孫艷麗 趙虎成 馮西橋

（清華大學(xué)航天航空學(xué)院工程力學(xué)系，生物力學(xué)與醫(yī)學(xué)工程研究所，北京 100084）

神經(jīng)元（neuron）是動(dòng)物機(jī)體中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一類細(xì)胞，由胞體（soma）、樹(shù)突（dendrite）和軸突（axon）組成。在發(fā)育過(guò)程中，胞體和軸突都會(huì)進(jìn)行長(zhǎng)距離的遷移并精確地延伸到所需的位置。正在延伸的軸突最前端是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，用于引導(dǎo)和控制神經(jīng)突（neurite）的前端生長(zhǎng)，命名為生長(zhǎng)錐（growth cone，GC）［1］。軸突用GC 來(lái)檢測(cè)環(huán)境信號(hào)、調(diào)整其生長(zhǎng)速度與方向，進(jìn)而尋找下一級(jí)神經(jīng)元的樹(shù)突或胞體。過(guò)去一直認(rèn)為化學(xué)物質(zhì)濃度梯度決定軸突的最終延伸方向［2］。近期的研究發(fā)現(xiàn)，非洲爪蟾的視神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，力學(xué)因素對(duì)軸突的延伸方向起到直接的調(diào)控作用［3］。這種力學(xué)因素和化學(xué)信號(hào)的整合不僅對(duì)發(fā)育很重要，而且對(duì)病理過(guò)程也很重要。許多神經(jīng)退行性疾病伴隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織力學(xué)的變化，如體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示：細(xì)胞外基質(zhì)硬度可影響軸突的延伸方向與生長(zhǎng)速度［3-4］。神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，涉及許多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)的相互協(xié)調(diào)，如細(xì)胞骨架主動(dòng)收縮力、外部載荷和細(xì)胞外基質(zhì)剛度［5-6］。高度動(dòng)態(tài)的GC通過(guò)軸突桿（axon shaft）與胞體連接（圖1），GC與軸突桿中的力對(duì)軸突的正常生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。GC 在軸向產(chǎn)生張力拉動(dòng)神經(jīng)突軸延伸，軸突桿亦對(duì)GC 的前移有推動(dòng)作用［6］。因此，軸突生長(zhǎng)可認(rèn)為是GC與神經(jīng)軸突桿之間的相互協(xié)同作用的結(jié)果。本文將結(jié)合自己的工作綜述內(nèi)力與外部載荷對(duì)軸突生長(zhǎng)調(diào)控的最新進(jìn)展。

Fig. 1 Origin of force in neuronal growth cones圖1 神經(jīng)元生長(zhǎng)錐中力的分布

1 內(nèi)力驅(qū)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)

1.1 細(xì)胞骨架收縮與聚合產(chǎn)生的內(nèi)力驅(qū)動(dòng)GC前移

GC 移動(dòng)與軸突的生長(zhǎng)依賴于細(xì)胞骨架。軸突內(nèi)的細(xì)胞骨架由肌動(dòng)蛋白、微管、神經(jīng)細(xì)絲組成。為了深入理解軸突生長(zhǎng)中力的平衡，研究人員將軸突的GC 與軸突桿看作是兩個(gè)獨(dú)立的部分（圖1）。GC 由中心區(qū)域（central domain）、片狀偽足（lamellipodium）、絲狀偽足（filopodia）組成［7］。GC 的偽足與其他類型細(xì)胞的偽足在形狀上相似，絲狀偽足與片狀偽足中充滿了致密的肌動(dòng)蛋白。在靠近GC膜端的肌動(dòng)蛋白絲聚合時(shí)可對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生推動(dòng)力［8］。由于布朗運(yùn)動(dòng)以及肌動(dòng)蛋白絲與GC膜的振蕩，為肌動(dòng)蛋白單體的進(jìn)入提供了足夠的空間進(jìn)而為絲狀偽足中肌動(dòng)蛋白的聚合提供物質(zhì)基礎(chǔ)［9］。當(dāng)聚合成彎曲的肌動(dòng)蛋白絲變直時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲推動(dòng)細(xì)胞膜使膜處于張力狀態(tài)下，張力的大小為10 μN(yùn)/m［10］。肌動(dòng)蛋白絲受到細(xì)胞膜同樣大小的反作用力。位于生長(zhǎng)錐中心的肌球蛋白馬達(dá)可牽拉肌動(dòng)蛋白絲產(chǎn)生收縮力，引起肌動(dòng)蛋白向GC中心回流。但是在生長(zhǎng)錐外周的肌動(dòng)蛋白通過(guò)點(diǎn)黏附與細(xì)胞外基質(zhì)耦聯(lián)在一起。類似于其他類型細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的點(diǎn)黏附，神經(jīng)元與細(xì)胞外基質(zhì)的點(diǎn)黏附由整合素（integrins）、踝蛋白（talin）、黏著斑蛋白（inculin）、shootin1和皮層蛋白（cortactin）組成。通過(guò)這些分子將肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)的連接在一起，形成局部點(diǎn)黏附。點(diǎn)黏附作用越強(qiáng)，肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)的聯(lián)系就越緊密，在GC 中心產(chǎn)生的收縮力可以傳遞到細(xì)胞外基質(zhì)上。因此，由絲狀偽足邊緣形成的局部黏附可以抑制肌動(dòng)蛋白的回流，而GC邊緣的肌動(dòng)蛋白馬達(dá)收縮將中心部位向邊緣拉伸［11］。 外周神經(jīng)系統(tǒng)（peripheral nervous system）神經(jīng)元的GC 收縮力為40 Pa左右，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system）神經(jīng)元GC 的收縮力在10 Pa 左右［12］。肌動(dòng)蛋白聚合可推動(dòng)細(xì)胞膜向前移動(dòng)，導(dǎo)致GC前移。肌動(dòng)蛋白聚合產(chǎn)生的推動(dòng)力在100 pN 左右［13］。由于肌動(dòng)蛋白聚合作用產(chǎn)生的推動(dòng)力與GC周邊的肌動(dòng)蛋白馬達(dá)收縮產(chǎn)生拉伸作用導(dǎo)致GC 向前移動(dòng)（圖1）。GC 的延伸與肌動(dòng)蛋白回縮流的速率一般是相關(guān)聯(lián)的，GC 延伸快，肌動(dòng)蛋白回縮慢。力的傳遞通過(guò)點(diǎn)黏附的形成、加強(qiáng)、解離的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。GC 的移動(dòng)最終取決于所有力的平衡（圖1）。GC持續(xù)移動(dòng)，依賴于纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）與點(diǎn)黏附的恒定轉(zhuǎn)換。GC 中心的肌動(dòng)蛋白絲需要解聚，為周邊的肌動(dòng)蛋白聚合提供單體。點(diǎn)黏附要有足夠的強(qiáng)度來(lái)產(chǎn)生引起GC前移的收縮力，同樣需要點(diǎn)黏附動(dòng)態(tài)的解聚與形成來(lái)拉動(dòng)GC前移［14］。

總之，肌動(dòng)蛋白在GC 外周聚合，在中心解聚，而肌球蛋白馬達(dá)向GC中心或者周邊拉伸依賴于局部黏附的動(dòng)力學(xué)。弱的局部黏附，肌動(dòng)蛋白回流率高（10 μm/h），GC 不再向前移動(dòng)。隨著絲狀偽足周邊局部黏附強(qiáng)度的增強(qiáng)，肌動(dòng)蛋白回流速率將降低，GC 外圍的收縮力增加。周邊由于大量肌動(dòng)蛋白收縮導(dǎo)致的黏附與解黏附引起的牽拉與肌動(dòng)蛋白聚合推動(dòng)細(xì)胞膜前移動(dòng)，每小時(shí)GC遷移可以達(dá)到幾十微米。局部黏附的動(dòng)態(tài)調(diào)控來(lái)決定GC延伸或者停止以適應(yīng)軸突外部的環(huán)境。

1.2 軸突桿中的力

成熟的軸突桿中細(xì)胞骨架的排列與GC中的細(xì)胞骨架排列存在明顯的差異。生長(zhǎng)過(guò)程中的軸突桿中充滿了微管， 軸突成熟后神經(jīng)絲（neurofilament）再添加進(jìn)去。在軸突中微管的伸長(zhǎng)端朝向GC［15］。微管一般長(zhǎng)時(shí)間保持幾百微米的長(zhǎng)度，可以看作是軸突中剛性的桿。類似于微絲聚合對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生的推動(dòng)力，在軸突延伸時(shí)每根微管聚合端會(huì)對(duì)GC細(xì)胞骨架產(chǎn)生3~5 pN的推動(dòng)力，分子馬達(dá)蛋白滑移引起的微管移動(dòng)也可以對(duì)GC產(chǎn)生推動(dòng)力［16］。微管聚合與滑移對(duì)GC推動(dòng)力的大小取決于軸突的橫截面積、微管的長(zhǎng)度、馬達(dá)蛋白的密度，總推動(dòng)力為幾百pN到幾個(gè)nN。在軸突中，肌動(dòng)蛋白以被血影蛋白（spectrin）間隔的垂直于微管的環(huán)狀排列形式存在（圖2）。肌動(dòng)蛋白環(huán)之間的距離在190 nm 左右，肌球蛋白絲長(zhǎng)度約為325 nm。因此，肌動(dòng)蛋白絲可以連接肌動(dòng)蛋白環(huán)，將它們牽拉而引起延軸突內(nèi)產(chǎn)生張力。在軸突中，肌球蛋白可以按照一定的角度排列，鑲嵌在相鄰肌動(dòng)蛋白環(huán)間隙內(nèi)，并施加軸向和周向張力，因此收縮產(chǎn)生的力可在軸向與周向（圖2）［17］。血影蛋白是否起到力學(xué)作用，目前尚不清楚。在紅細(xì)胞膜下由于血影蛋白的存在，使紅細(xì)胞具有較好的彈性。最近的研究證實(shí)血影蛋白對(duì)維持軸突結(jié)構(gòu)的完整性具有重要的作用。血影蛋白可能是一個(gè)被壓縮的彈簧，來(lái)抵抗肌球蛋白牽拉微絲產(chǎn)生的收縮力［18］?？傊?，微管的推動(dòng)力被沿著微管的肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白收縮產(chǎn)生的張力來(lái)平衡。肌動(dòng)蛋白產(chǎn)生的收縮力、微管聚合產(chǎn)生的推動(dòng)力、血影蛋白的被動(dòng)抵抗力共同形成了軸突總的合力，推動(dòng)GC向前延伸。

Fig. 2 The origin of force in neuronal axons圖2 神經(jīng)元軸突中的力

1.3 軸突中力的綜合作用決定其生長(zhǎng)

GC 與軸突桿是如何協(xié)同調(diào)控軸突生長(zhǎng)的？軸突的生長(zhǎng)需要增加微管、細(xì)胞膜、細(xì)胞器的量。軸突的生長(zhǎng)率取決于微管聚合與延伸的快慢。那么，是否軸突由微管的推動(dòng)與GC 的拉伸而驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)呢？也有實(shí)驗(yàn)證據(jù)提出新的觀點(diǎn)，支持微管作為軸突生長(zhǎng)的主要推動(dòng)力，去除微絲可引起軸突快速生長(zhǎng)，應(yīng)用紫杉醇來(lái)促進(jìn)微管的聚合可增加推動(dòng)力引起軸突的延伸速度增加［19］。這表明，軸突桿中肌動(dòng)蛋白的收縮抵抗生長(zhǎng)，微管聚合與滑移產(chǎn)生的推動(dòng)力促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。Lamoureux 等［1］將神經(jīng)元胞體從細(xì)胞外基質(zhì)剝離而GC保持黏附狀態(tài)，可以觀察到軸突繼續(xù)生長(zhǎng)。如果用微吸管沿著GC方向反向拉伸，軸突依然保持生長(zhǎng)。如何解釋這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢？簡(jiǎn)單地說(shuō)，在收縮力存在時(shí)，張力占主導(dǎo)，微管聚合或滑移產(chǎn)生的擠壓力可以忽略。例如，GC 停止了前進(jìn)，微管繼續(xù)前移會(huì)導(dǎo)致微管在GC的聚集大于推動(dòng)GC前移。只有干擾肌動(dòng)蛋白骨架降低收縮力后，微管才轉(zhuǎn)變成力平衡的主要貢獻(xiàn)者。當(dāng)不存在收縮力時(shí)，肌動(dòng)蛋白網(wǎng)可以忽略，微管聚合的擠壓力占主導(dǎo)，可以推動(dòng)生長(zhǎng)錐，導(dǎo)致軸突快速生長(zhǎng)。在這種情況下，微管前進(jìn)是唯一限制軸突前進(jìn)速度的因素，此時(shí)軸突前進(jìn)速度是最大的。將未受擾動(dòng)系統(tǒng)中的所有力分量加起來(lái)后，軸突桿中的總力和在生長(zhǎng)錐中產(chǎn)生的凈力綜合作用決定軸突是否延伸。一個(gè)簡(jiǎn)單的圖像是：GC 中存在濃密的肌動(dòng)蛋白骨架將阻礙微管從軸突進(jìn)入，微管產(chǎn)生的推動(dòng)力對(duì)抗軸突的張力與回縮。有時(shí)也有少量的微管伸入到GC，進(jìn)而幫助和加強(qiáng)生長(zhǎng)（圖1）。如果GC 邊緣的收縮力較高，GC 中心被向周邊拉伸，為微管伸入產(chǎn)生了空間。GC 越是對(duì)軸突拉伸，越為微管的伸入騰出空間，加速軸突的延伸［20］。

目前描述軸突生長(zhǎng)的快慢有兩種模型，即物質(zhì)擴(kuò)散模型與力學(xué)模型。對(duì)于物質(zhì)擴(kuò)散模型，強(qiáng)調(diào)可溶性的微管蛋白通過(guò)擴(kuò)散或主動(dòng)運(yùn)輸?shù)捷S突末端來(lái)提供微管合成的物質(zhì)基礎(chǔ)。在早期的神經(jīng)突中，胞體提供細(xì)胞的組分，如微管蛋白和其他骨架蛋白，然后沿軸擴(kuò)散和主動(dòng)運(yùn)輸，以到達(dá)軸突末端［21］。因此，生長(zhǎng)速率可用微管蛋白濃度的擴(kuò)散方程來(lái)描述。擴(kuò)散模型將軸突視為兩個(gè)部分（胞體和GC），胞體中的微管蛋白濃度大于軸突桿與GC中的微管蛋白濃度。通過(guò)化學(xué)擴(kuò)散或馬達(dá)蛋白的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)實(shí)現(xiàn)軸突生長(zhǎng)［21］。實(shí)際上，生長(zhǎng)中的軸突內(nèi)部不斷發(fā)生力變化與平衡。為此，力學(xué)模型引入了微管蛋白和肌動(dòng)蛋白的質(zhì)量變化和動(dòng)量平衡，建立了基于骨架成分的力學(xué)平衡模型［22］。微管主要分布在神經(jīng)軸突桿內(nèi)部，而肌動(dòng)蛋白皮質(zhì)則分布于GC的外圍。肌動(dòng)蛋白網(wǎng)收縮產(chǎn)生的張力與微管聚合延伸產(chǎn)生的機(jī)械力決定軸突的生長(zhǎng)速度與方向?？梢?jiàn)，機(jī)械力和物質(zhì)擴(kuò)散分別代表了神經(jīng)突生長(zhǎng)的兩個(gè)方面。在內(nèi)力和外力作用下，為了維持軸突快速伸長(zhǎng)和適應(yīng)力學(xué)作用的變化，胞體可能主動(dòng)地調(diào)節(jié)細(xì)胞成分的合成和輸運(yùn)，以支持生長(zhǎng)所需的物質(zhì)和避免物質(zhì)匱乏造成的張力牽拉損傷。目前的研究證實(shí)，衰老與阿爾茨海默病患者腦組織的硬度明顯降低，其軸突GC 的主動(dòng)收縮力明顯降低。GC 收縮力的變化與突觸數(shù)量的形成、突觸傳遞的效能密切相關(guān)［4］。因此，調(diào)控軸突延伸的內(nèi)力可能是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在靶點(diǎn)。

2 外力刺激對(duì)軸突生長(zhǎng)的調(diào)控

軸突生長(zhǎng)可大致分為突起形成、分化、延伸、成束與突觸形成5個(gè)階段，是建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵過(guò)程。由于軸突具有感知和產(chǎn)生力的機(jī)制，因此人為施加力載荷可以影響軸突生長(zhǎng)與發(fā)育的每個(gè)階段（圖3）［23-24］。

Fig. 3 Exogenous forces influences every phase of neuronal growth圖3 外力影響軸突生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)階段

2.1 外源性力誘導(dǎo)神經(jīng)突生成

培養(yǎng)的神經(jīng)元與基底接觸并貼壁后先伸出幾個(gè)短突起（神經(jīng)突），這個(gè)過(guò)程稱為神經(jīng)突起始階段［25］。最早有研究證實(shí)，對(duì)10~12 日齡雞胚的背根神經(jīng)節(jié)DRG 神經(jīng)元在彈性基底上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)直徑較小的玻璃管張力拉伸與神經(jīng)元接觸的基底導(dǎo)致神經(jīng)突的產(chǎn)生［26-27］。隨后的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞膜施加閾值以上的張力可以使貼壁后的神經(jīng)元延伸出神經(jīng)突，而與施加張力的方式無(wú)關(guān)，誘導(dǎo)神經(jīng)突產(chǎn)生通常需要張力的范圍在0.3~10 nN［27］。在牽拉作用下，誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)突可發(fā)育成正常的GC并能進(jìn)行軸突延伸。Dominguez-Romero等［28］證明了雞胚前腦神經(jīng)元神經(jīng)突的形成是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，延伸速度隨外力作用的增加而增加。神經(jīng)突的萌生過(guò)程必需有新的物質(zhì)的補(bǔ)充。牽拉神經(jīng)突的速度大于0.5 μm/min由于不能保證充分的物質(zhì)供應(yīng)而導(dǎo)致神經(jīng)突破壞［29-30］。

2.2 外力可誘導(dǎo)神經(jīng)突分化為軸突

當(dāng)神經(jīng)突形成后，其經(jīng)歷著延伸與回縮的循環(huán)過(guò)程。在這一階段，神經(jīng)元顯示出極化狀態(tài)，但無(wú)論是形態(tài)上還上化學(xué)組分上這些神經(jīng)突并沒(méi)有明確的軸突與樹(shù)突之分［24］。大約24 h 后，其中的一個(gè)神經(jīng)突顯示出較快的生長(zhǎng)速度而且具有軸突的特征，這一過(guò)程稱為軸突特化［30］。Magdesian 等［31］發(fā)現(xiàn)小的外部拉伸力可誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元小的神經(jīng)突分化為軸突。隨后發(fā)現(xiàn)由牽拉誘導(dǎo)形成的軸突與自發(fā)形成的軸突標(biāo)志性蛋白完全一致［31］。Kunze 等［32］的研究證實(shí)，局部的外力刺激通過(guò)影響細(xì)胞骨架蛋白Tau在細(xì)胞內(nèi)的分布來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生極性。Tau是神經(jīng)元產(chǎn)生極性的一個(gè)重要蛋白質(zhì)。盡管機(jī)械力可誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生極性，但詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。神經(jīng)元極化后，這種極化并不是一成不變的，而是可逆的，其中力發(fā)揮重要的作用。典型的神經(jīng)元僅有一個(gè)軸突，但張力牽拉可誘導(dǎo)形成多個(gè)軸突［31］?，F(xiàn)在提出一種假說(shuō)，軸突形成后會(huì)抑制其他小的神經(jīng)突生長(zhǎng)，力學(xué)刺激可以減除這種抑制［33］，引起產(chǎn)生極化的效應(yīng)器重新分布，進(jìn)而誘導(dǎo)出多個(gè)軸突［33］。

2.3 外力作用促進(jìn)軸突延伸

神經(jīng)元培養(yǎng)2~3 d 時(shí)，其他神經(jīng)突仍然處于靜止?fàn)顟B(tài)或進(jìn)行小幅度的生長(zhǎng)，而軸突則處于持續(xù)無(wú)回縮的生長(zhǎng)，這一階段稱為軸突延伸期［24］。早在1984年，Bray［26］就發(fā)現(xiàn)，如果沿著軸突機(jī)械拉伸持續(xù)30 min，可誘導(dǎo)其延伸超過(guò)300 μm。軸突除了增加長(zhǎng)度外，還增加直徑，而且保持正常的超微結(jié)構(gòu)與縱向的微管、神經(jīng)絲排列［26-27］。在此過(guò)程中，神經(jīng)元能夠感受到力刺激并以增加新蛋白、膜脂以及細(xì)胞骨架成分作為響應(yīng)［26］。最近發(fā)現(xiàn)所有類型的神經(jīng)元生長(zhǎng)期間，軸突受到牽拉均會(huì)做出與刺激強(qiáng)度呈正相關(guān)的延伸。軸突受到拉伸時(shí)，其延伸速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生理范圍內(nèi)的生長(zhǎng)速率。例如，DRG 神經(jīng)元軸突受到牽拉時(shí)在兩個(gè)星期內(nèi)從100 μm伸長(zhǎng)到10 cm，生長(zhǎng)速度是300 μm/h，是正常生長(zhǎng)速度的10倍［32］。也有研究發(fā)現(xiàn)，不同的拉伸方式引起軸突延伸的拉伸閾值不同。PC12 細(xì)胞與雞的感覺(jué)神經(jīng)元，用玻璃微管牽拉神經(jīng)元生長(zhǎng)的基底引起神經(jīng)突生長(zhǎng)的力學(xué)閾值為1 nN。雞的前腦神經(jīng)元黏附磁性小球后通過(guò)磁場(chǎng)施加磁性力（磁性微球），誘導(dǎo)神經(jīng)元延伸的閾值為15~100 pN。如果低于閾值，力學(xué)拉伸僅引起粘彈性變形，當(dāng)外力釋放后軸突又發(fā)生回縮［26］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，低于閾值的力長(zhǎng)時(shí)間作用，同樣可以促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)。一種可能的解釋是長(zhǎng)時(shí)間低強(qiáng)度力學(xué)刺激影響的是軸突的黏性成分，短期的高強(qiáng)度力學(xué)刺激影響的是軸突的彈性成分［33］。

2.4 外力作用影響軸突延伸方向與軸突成束

軸突形成后要沿著一定的路線尋找下一級(jí)神經(jīng)元或目標(biāo)細(xì)胞。軸突的GC 作為其延伸的導(dǎo)向器，檢測(cè)環(huán)境狀況并決定軸突的延伸方向。已有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，外力可以影響軸突的延伸方向。很早就發(fā)現(xiàn)，軸突的形成與延伸沿著外力的作用方向［34-35］。外力作用可引起細(xì)胞骨架重構(gòu)，以適應(yīng)力學(xué)作用方向。軸突成束依賴于軸突膜上蛋白質(zhì)的相互作用。這種相互作用既可促進(jìn)成束也可引起成束的軸突分離。Schelski 等［35］揭示了機(jī)械張力調(diào)控軸突成束的機(jī)制，即機(jī)械張力通過(guò)調(diào)控軸突間N鈣黏蛋白的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的成束。

2.5 外力作用促進(jìn)軸突的分叉和修剪

軸突的分叉與修剪是保證神經(jīng)系統(tǒng)形成正常突觸連接的前題條件。軸突的分叉為單個(gè)神經(jīng)元與多個(gè)神經(jīng)元建立突觸連接提供了保證。而軸突修剪又排除了過(guò)多與無(wú)效的軸突分支。De Vincentiis等［24］報(bào)道拉伸力可促進(jìn)軸突分支的產(chǎn)生。在海馬神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)，對(duì)軸突施加10 pN 的拉伸力2 d 后可促進(jìn)軸突二級(jí)與三級(jí)分支的增加。機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，力促進(jìn)分支形成的早期階段依賴于促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，后期則促進(jìn)微管的聚合。也有的研究［36-37］認(rèn)為，張力是軸突側(cè)枝生存所必須的信號(hào)，但是如果僅沿著一個(gè)側(cè)枝的方向施加張力不僅可以引起其穩(wěn)定性，也可引起回縮與消失。機(jī)械張力在軸突修剪中可穩(wěn)定其拉伸的側(cè)枝而促進(jìn)附近的側(cè)枝回縮或者消失［38-41］。這些情況發(fā)生在機(jī)械力超過(guò)閾值，引起局部鈣離子濃度大幅度增加，生長(zhǎng)錐塌陷，失去了與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附，側(cè)枝像彈簧一樣回縮，最后建立新的黏附。

2.6 外力可以促進(jìn)突觸形成

GC 一旦到達(dá)靶細(xì)胞，可形成分叉并與下一級(jí)神經(jīng)元建立突觸連接，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。沿著軸突方向的機(jī)械力可影響突觸的各個(gè)方面，包括突觸囊泡的動(dòng)力學(xué)、突觸傳遞、興奮性與網(wǎng)絡(luò)形成［42-44］。其中，突觸形成的關(guān)鍵步驟是突觸囊泡在軸突末端的聚集。Siechen 等［44］發(fā)現(xiàn)囊泡在突觸前聚集依賴于機(jī)械拉伸。應(yīng)用外科手術(shù)的辦法切斷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突末端，經(jīng)過(guò)機(jī)械拉伸后末梢仍可聚集突觸囊泡。5%的應(yīng)變作用0.5 h，可引起囊泡的聚集增加兩倍。他們推測(cè)，可能是由于機(jī)械拉伸促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚集，為囊泡的聚集提供了支架與軌道［44］。Ahmed等［43］也觀察到機(jī)械拉伸可影響局部和整個(gè)神經(jīng)元突觸囊泡聚集的動(dòng)力學(xué)，但機(jī)制需要進(jìn)一步研究。外力還可以影響突觸的功能，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元間信號(hào)傳遞。一些研究發(fā)現(xiàn)外力刺激可瞬間引起可逆的自發(fā)性與誘發(fā)性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放增強(qiáng)。有趣的是，機(jī)械拉伸使突觸傳遞增強(qiáng)并不需要生理狀態(tài)Ca2+觸發(fā)的囊泡與突觸前膜融合這一步驟［43-44］，推測(cè)機(jī)械刺激可直接調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)釋放的通路。Fan等［45］發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激還可以調(diào)控突觸的興奮性，持續(xù)低強(qiáng)度的拉伸軸突可以增強(qiáng)神經(jīng)元的電活性，而周期性的拉伸每次拉伸后均可增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性。神經(jīng)元對(duì)過(guò)去所受的拉伸刺激保持有“記憶”，每次刺激由于前一次刺激的殘余而增強(qiáng)。De Vincentiis等［46］的研究結(jié)果也證實(shí)，機(jī)械拉伸明顯的增強(qiáng)自發(fā)性突觸后電流的頻率，但不影響幅值。長(zhǎng)時(shí)間拉伸（14 d）神經(jīng)元，激發(fā)的突觸電流的頻率與幅值均明顯的增加［45，47］。Fan 等［45］推測(cè)，機(jī)械拉伸增強(qiáng)突觸囊泡的聚集可增強(qiáng)其與突觸前膜搭靠（docking）的頻率，進(jìn)而促進(jìn)囊泡的釋放率與釋放量。Roy 等［48］發(fā)現(xiàn)力刺激可引起神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)，牽拉軸突或者樹(shù)突可促進(jìn)新的分支形成，并在1 h 內(nèi)形成新的突觸連接。在這個(gè)過(guò)程中神經(jīng)突可伸長(zhǎng)60 μm，直到與下一級(jí)軸突或樹(shù)突接觸，即力刺激可以引起新的有效突觸形成。但機(jī)械誘導(dǎo)產(chǎn)生與生理狀態(tài)下形成的突觸功能是否相同，目前尚不明確。

3 外力作用的分子效應(yīng)

力學(xué)作用可引起化學(xué)物質(zhì)從軸丘向軸突末端轉(zhuǎn)運(yùn)。力刺激需要持續(xù)一定的時(shí)間，如果刺激時(shí)間很短神經(jīng)突又回復(fù)到原來(lái)的生長(zhǎng)模式［38-40］。誘導(dǎo)新的神經(jīng)突產(chǎn)生，力刺激強(qiáng)度需要超過(guò)一點(diǎn)的閾值。不同類型的神經(jīng)元力刺激的閾值不同，在幾百pN 到nN 范圍。軸突的生長(zhǎng)率為0.1~0.3 μm·h-1·pN-1。也有人發(fā)現(xiàn)，足夠長(zhǎng)的時(shí)間較小的力刺激也能誘發(fā)神經(jīng)突的形成［33-34］。當(dāng)較大的力作用在神經(jīng)突上由于新物質(zhì)的增加不會(huì)引起斷裂，新增物質(zhì)可以由胞體轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)突末端。軸突的生長(zhǎng)速度取決于神經(jīng)絲與微管的聚合速度，因?yàn)槠渥鳛槲镔|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的軌道。軸突的延伸速率不能超過(guò)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。物質(zhì)的移動(dòng)速率為0.3~3 mm/d，以走走停停的方式轉(zhuǎn)運(yùn)［41］。因此，長(zhǎng)時(shí)間施加較大強(qiáng)度的力可以引起軸突斷裂。在力學(xué)加載促發(fā)的軸突延伸過(guò)程中，軸突桿直徑不變或變粗，但物質(zhì)如何沿著軸突補(bǔ)充而防止拉伸導(dǎo)致變細(xì)的機(jī)制依然不清楚［42］。在2011年，Suter 等［49-50］提出了牽拉生長(zhǎng)模型（stretchgrowth model），認(rèn)為在拉伸狀態(tài)下軸突物質(zhì)的增加可以發(fā)生在軸突的任何位置。這個(gè)假說(shuō)與頂端生長(zhǎng)模型（tip-growth model）不一致，頂端生長(zhǎng)模型認(rèn)為GC 為唯一的生長(zhǎng)位置，物質(zhì)只在此位置增加［51-52］。拉伸生長(zhǎng)模型不是頂端生長(zhǎng)模型的替代，而是旨在提供一個(gè)統(tǒng)一的軸突生長(zhǎng)模型。目前認(rèn)為，GC 是物質(zhì)補(bǔ)充的主要部位，但施加力后其他部位也可能是物質(zhì)增加的位置［53-54］。拉伸促進(jìn)生長(zhǎng)是通過(guò)促進(jìn)整體物質(zhì)沿軸突向前移動(dòng)還是同時(shí)促進(jìn)局部新物質(zhì)的合成組裝或者是影響物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)率來(lái)調(diào)控生長(zhǎng)依然不清楚。

3.1 外力作用影響軸突中細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)

細(xì)胞骨架除了提供結(jié)構(gòu)支持外，還調(diào)控局部蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、囊泡的運(yùn)輸。低強(qiáng)度的力加載可影響微管與微絲的動(dòng)力學(xué)，涉及到GC的外周和中心部分［50］。大于閾值的機(jī)械拉伸可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲滑移，引起張力釋放［46］。機(jī)械力也可通過(guò)激活力敏感離子通道引起鈣離子內(nèi)流而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，或者促進(jìn)整合素介導(dǎo)的點(diǎn)黏附成熟或者抵消膜上存在的張力［47-52］。Baker等［53-56］報(bào)道局部施加力載荷可以加長(zhǎng)絲狀偽足中的肌動(dòng)蛋白骨架并誘導(dǎo)膜脂成分轉(zhuǎn)運(yùn)到GC細(xì)胞膜。延伸的軸突中含有聚合的肌動(dòng)蛋白絲，肌動(dòng)蛋白絲施加與突觸延伸方向相反的回縮力。研究者認(rèn)為，外力通過(guò)降低膜張力為肌動(dòng)蛋白的聚合與肌動(dòng)蛋白單體的插入提供了空間［56-57］。外力同樣影響微管的動(dòng)力學(xué)，微管在外力拉伸方向聚合。機(jī)械力可引起微管滑移，因?yàn)榉肿玉R達(dá)可以響應(yīng)機(jī)械力［58］。拉伸GC，由于與肌動(dòng)蛋白的耦聯(lián)，微管從中心結(jié)構(gòu)域向外周結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移，但不改變微管的聚合與解聚速率［59］。拉伸整個(gè)軸突，從軸突桿到GC的整個(gè)軸突的微管密度顯著增加，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和極性上都是正常的［47］。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)用諾可達(dá)唑（nocodazole）使微管解聚阻斷了應(yīng)力誘導(dǎo)軸突的生長(zhǎng)，而用紫杉醇（paclitaxel）穩(wěn)定微管的合成保留了應(yīng)力對(duì)軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，這表明微管聚合對(duì)維持拉伸誘導(dǎo)生長(zhǎng)起至關(guān)重要的作用［47］。這種作用具有特異性，抑制肌球蛋白II和肌動(dòng)蛋白聚合對(duì)拉伸促進(jìn)生長(zhǎng)沒(méi)有現(xiàn)顯著的影響。微管密度的增加有助于降低軸突桿內(nèi)的凈收縮力，改變力的平衡，刺激GC 向前運(yùn)動(dòng)。

3.2 外力作用影響軸突的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)

胞體向軸突進(jìn)行囊泡、顆粒和細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)是神經(jīng)元維持正常功能的必須條件。對(duì)軸突施加張力可明顯的影響軸突的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。在DRG 神經(jīng)元GC中線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯降低，但囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯增強(qiáng)［59-63］。張力可改變囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)速度和方向，這可能是由于影響細(xì)胞骨架的重構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)了囊泡在GC的積累。張力也會(huì)影響軸突中分子馬達(dá)的活性，但張力影響哪一種馬達(dá)目前尚不清楚。另外，張力也可以直接影響囊泡的移動(dòng)［59］。

3.3 外力作用影響軸突鈣離子內(nèi)流

機(jī)械力通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元離子通道的活性來(lái)影響其功能、發(fā)育和生理狀態(tài)。機(jī)械拉伸可影響神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度。低幅度的力刺激可引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣瞬變。但細(xì)胞培養(yǎng)基中的鈣被去除后神經(jīng)突（包括GC）不再對(duì)力刺激響應(yīng)［51-62］，表明力刺激引起神經(jīng)元的響應(yīng)通過(guò)鈣離子來(lái)介導(dǎo)。Glogauer等［55］發(fā)現(xiàn)局部力刺激超過(guò)閾值（~274 pN）可激活機(jī)械力敏感的離子通道，導(dǎo)致鈣內(nèi)流進(jìn)而引起神經(jīng)突回縮。增加的鈣離子從GC向軸突桿、其他側(cè)枝和胞體擴(kuò)散，在20~30 s 內(nèi)消失。實(shí)驗(yàn)還觀察到除了刺激GC，力作用神經(jīng)突的其他位置也可以引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流，但刺激胞體僅引起胞體小幅度的鈣內(nèi)流［63-64］。Tay 等［64］發(fā)現(xiàn)，刺激強(qiáng)度從0.1 nN增加到1 nN 可誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)鈣內(nèi)流，增加了鈣波的頻率與幅值。力刺激可激活N 型鈣通道，引起的鈣濃度升高15 min 后恢復(fù)到基線水平，力長(zhǎng)時(shí)間的刺激神經(jīng)元鈣恢復(fù)到基線水平主要原因是N型鈣通道的失活導(dǎo)致［56］。

4 總結(jié)與展望

本文系統(tǒng)地綜述了外力與自身內(nèi)力是如何調(diào)控軸突生長(zhǎng)的，這一領(lǐng)域研究在神經(jīng)再生領(lǐng)域?qū)?huì)有潛在的應(yīng)用［65-66］。外力可以調(diào)控神經(jīng)元生長(zhǎng)與發(fā)育的各個(gè)階段，不同大小和作用時(shí)間的力均可誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)。外力還可以影響細(xì)胞骨架的重建、軸突物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、力敏感離子通道。力刺激可以影響腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞的遷移與干細(xì)胞的分化，其機(jī)制與力對(duì)神經(jīng)元的影響基本類似，但對(duì)力刺激的敏感程度明顯不同，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。另外，力學(xué)因素和生化信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路之間相互影響，這些信號(hào)中任何一種的變化都可能改變細(xì)胞對(duì)另一種刺激的反應(yīng)，即機(jī)械力與生化信號(hào)對(duì)于發(fā)育中的大腦中軸突生長(zhǎng)一樣重要。因此，機(jī)械力也可能對(duì)于軸突再生過(guò)程至關(guān)重要［66］。本課題組過(guò)去的研究也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)硬度可以影響培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的電活性，并具有細(xì)胞外基質(zhì)成分依賴性［67-68］。Koser等［3］確定力敏感離子通道Piezo1為神經(jīng)元對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的感受器關(guān)于力學(xué)刺激調(diào)控軸突生長(zhǎng)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。另一個(gè)相關(guān)的問(wèn)題是，如何通過(guò)機(jī)械力調(diào)控神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)再生策略。近年來(lái)，隨著技術(shù)的進(jìn)步，許多技術(shù)都可實(shí)現(xiàn)通過(guò)機(jī)械加載誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)，這為體外定向培養(yǎng)神經(jīng)組織與受傷神經(jīng)組織的修復(fù)提供了物理方法，有著巨大的臨床應(yīng)用潛力。然而，到目前為止，這些技術(shù)沒(méi)有一種處于臨床前階段。為了能在臨床上應(yīng)用，還需要進(jìn)一步地研究了解內(nèi)源性機(jī)械力如何在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生，以及外源性機(jī)械力如何在體內(nèi)或體外通過(guò)模仿發(fā)育過(guò)程來(lái)加速修復(fù)機(jī)制。