褚芳芳 趙巖松 趙玉澤 白晨 肖培倫 王曉莉 于樹娜 蔣吉英

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科中心，山東濰坊 261031；3.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，山東濰坊 261053）

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）是一種以視網(wǎng)膜新生血管為特征的視網(wǎng)膜病變，隨著早產(chǎn)兒存活率的提高，ROP 的發(fā)病率也顯著提高，已成為兒童致盲的主要原因之一［1］。然而，ROP 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏明確的治療措施。因此，探索ROP 的相關(guān)機(jī)制及新的治療方法具有重要的臨床意義。氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變（oxygen-induced retinopathy，OIR）新生小鼠模型可以較好地模擬高氧刺激后視網(wǎng)膜血管閉塞和新生血管的形成，是研究ROP 的經(jīng)典模型。以往的研究多側(cè)重于血管新生，近年來的研究顯示，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體介導(dǎo)的炎癥也參與了OIR的病理進(jìn)程，提示抑制炎癥反應(yīng)亦可作為ROP 的治療靶點(diǎn)。褪黑素（melatonin，Mel）是一種具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用的內(nèi)分泌激素［2-3］，已有研究證實Mel對ROP、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷等眼部疾病有保護(hù)作用［4-5］。由此推測Mel 可能通過抑制NLRP3 炎性小體的活化減輕OIR。為驗證上述假說，本研究通過建立OIR 新生小鼠模型，觀察HMGB1/NF-κB/NLRP3 軸在Mel 對新生小鼠OIR 保護(hù)作用中的影響，以期為Mel在ROP中的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型建立

健康成年C57BL/6J 小鼠20 只（山東省濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司），體重22～25 g，SPF級，常規(guī)鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，雄鼠與雌鼠按1∶3 比例合籠。取27 只自然分娩喂養(yǎng)至出生后第7 天（postnatal day 7，P7）的新生小鼠進(jìn)行實驗，雌雄不限，體重3.13±0.16 g。將P7新生小鼠隨機(jī)分為對照組（n=9）、模型組（OIR 組，n=9）與Mel 處理組（OIR+Mel 組，n=9）。參照文獻(xiàn)［6］建立OIR 小鼠模型，即將哺乳母鼠與P7 新生小鼠置于氧氣體積分?jǐn)?shù)為75%±2%的氧艙（DYC-Ⅰ，武漢七〇一研究所）內(nèi)飼養(yǎng)5 d，隔日更換母鼠和墊料、加食換水。于P12時移出氧箱，置于常氧環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)5 d。對照組小鼠在常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。Mel 處理組從P12 開始，每日上午8:00 腹腔注射Mel 10 mg/kg（美國Sigma公司）［4］，連續(xù)5 d，于P17時處死動物、取材。

1.2 視網(wǎng)膜鋪片法觀察視網(wǎng)膜新生血管

P17小鼠乙醚麻醉后固定，暴露心臟，剪開右心耳，從左心室依次注入0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛溶液、5%明膠墨汁（上海晨光墨汁），以口、鼻、四肢呈黑色為灌注成功，冰上靜置30 min使明膠墨汁凝固后取眼，置于4%多聚甲醛固定2 h。在體視顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開眼球，分離鞏膜和脈絡(luò)膜，去除晶狀體、殘存的玻璃體及色素，以視神經(jīng)乳頭為中心沿鼻上、鼻下、顳上、顳下4個方向?qū)⒁暰W(wǎng)膜剪為四葉草形狀，置于準(zhǔn)備好的載玻片上，甘油明膠封片，研究級正置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 標(biāo)本的采集及處理

P17小鼠乙醚麻醉下摘取眼球，去除角膜及晶狀體，用4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（厚4 μm），每3～5 張切片取1 張切片，分別行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色及免疫熒光染色；取眼后保留視網(wǎng)膜組織，稱重，行髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測。

1.4 HE染色

石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，采用HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）染色，蘇木素染核10 min，鹽酸酒精分化30 s，去離子水沖洗，伊紅胞漿染色2 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)、計數(shù)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。

1.5 免疫熒光染色

石蠟切片，脫蠟水化、抗原修復(fù)、0.3%TritonX-100透膜、5% BSA-PBS封閉2 h，分別加入兔抗NLRP3（1∶100，英國Affinity公司）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）（1∶200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、半胱氨酸蛋白水解酶-1 前體（procaspase-1）（1∶100，武漢愛博泰克生物科技有限公司）、剪切的半胱氨酸蛋白水解酶-1（cleavedcaspase-1，1∶100，英國Affinity 公司）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β（1∶200，武漢愛博泰克生物科技有限公司）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）（1∶100，上海愛必信生物科技有限公司）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（neuclear transcription factor kappa B，NF-κB）（1∶100，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、淋巴細(xì)胞抗原6G（lymphocyte antigen 6G，Ly-6G）（1∶200，美國CST 公司）、褪黑素受體1（melatonin receptor 1，MT1）（1∶50，美國ABBIOTEC公司）和褪黑素受體2（melatonin receptor 2，MT2）（1∶100，英國Affinity 公司）、鼠抗Toll 樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4）（1∶200，美國Santa 公司）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）（1∶100，美國Santa 公司）一抗，4℃孵育過夜；次日，37℃復(fù)溫，PBS 漂洗3 次，滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG熒光二抗（1∶200，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，用含DAPI 的熒光封片劑（美國Santa 公司）封片。正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，并用Image J 軟件進(jìn)行分析。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜Ly-6G、TNF-α 免疫熒光染色結(jié)果（×400） Ly-6G 為中性粒細(xì)胞標(biāo)志物，Ly-6G+胞漿染色為綠色，TNF-α+胞漿染色為紅色，DAPI+細(xì)胞核染為藍(lán)色。OIR+Mel組Ly-6G+、TNF-α+表達(dá)少于OIR組。［GCL］神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；［INL］內(nèi)核層；［ONL］外核層。

1.6 比色法檢測MPO活性

將視網(wǎng)膜組織按重量體積比1∶19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿，按MPO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書加入試劑后混勻，60℃水浴10 min后取出，吸取200 μL于96孔板中，立即用分光光度計在450 nm 波長處測量各組的吸光度值。根據(jù)說明書提供公式，計算MPO活力。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mel 對OIR 小鼠視網(wǎng)膜血管新生及視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示，OIR組視網(wǎng)膜血管分布被破壞，中央部出現(xiàn)大片無灌注區(qū)，無灌注區(qū)附近出現(xiàn)新生血管，新生血管呈團(tuán)簇狀，分布紊亂；OIR+Mel 組視網(wǎng)膜的無灌注區(qū)和新生血管數(shù)量減少。HE 染色結(jié)果顯示，OIR 組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)排列疏松紊亂，可見細(xì)胞丟失和空泡化，內(nèi)界膜不完整，突出內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)（25.17±1.61）較對照組（0.75±0.25）多；OIR+Mel 組視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜基本恢復(fù)平滑，偶見細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，突出內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)（4.25±0.75）較OIR組減少，各組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=489.006，P＜0.001）。見圖1。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和新生血管變化 A：視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果（光學(xué)顯微鏡，×40）。OIR組出現(xiàn)大量無灌注區(qū)和病理性新生血管，OIR+Mel組視網(wǎng)膜的無灌注區(qū)和新生血管數(shù)量減少。藍(lán)色箭頭指示視網(wǎng)膜的無灌注區(qū)，紅色箭頭指示新生血管。B：蘇木精-伊紅染色結(jié)果（×400）。OIR組大量新生血管內(nèi)皮細(xì)胞突出內(nèi)界膜，OIR+Mel組突出內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)減少。箭頭指示突出內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。［GCL］神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；［INL］內(nèi)核層；［ONL］外核層；［ILM］內(nèi)界膜。

2.2 Mel對OIR小鼠視網(wǎng)膜NLRP3炎性小體相關(guān)因子表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，對照組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1 和IL-1β 陽性表達(dá)少，OIR 組和OIR+Mel 組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（ganglion cell layer，GCL）與內(nèi)核層（inner nuclear layer，INL） 均可見其陽性表達(dá)，且OIR 組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1 和IL-1β 陽性表達(dá)較對照組顯著升高（P＜0.05），OIR+Mel 組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleavedcaspase-1 和IL-1β 陽性表達(dá)較OIR 組減少（P＜0.05）。見圖2、表1。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、IL-1β平均熒光強(qiáng)度比較 （± s，n=3）

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、IL-1β平均熒光強(qiáng)度比較 （± s，n=3）

注：a示與對照組比較，P＜0.05；b示與OIR組比較，P＜0.05。［NLRP3］核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；［ASC］凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；［pro-caspase-1］半胱氨酸蛋白水解酶-1前體；［cleaved-caspase-1］剪切的半胱氨酸蛋白水解酶-1；［IL-1β］白細(xì)胞介素-1β。

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圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)的變化（免疫熒光染色，×400） HMGB1+、NF-κB+胞漿染色為綠色，TLR4+胞漿染色為紅色，DAPI+細(xì)胞核染為藍(lán)色。OIR+Mel 組HMGB1+、NF-κB+、TLR4+表達(dá)少于OIR組。［GCL］神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；［INL］內(nèi)核層；［ONL］外核層。

2.3 Mel對OIR小鼠視網(wǎng)膜HMGB1、TLR4、NFκB表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，對照組HMGB1、TLR4和NF-κB陽性表達(dá)較少，OIR組和OIR+Mel組GCL與INL 均可見其陽性表達(dá)，OIR+Mel 組HMGB1、TLR4和NF-κB陽性表達(dá)低于OIR組（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜HMGB1、TLR4、NF-κB平均熒光強(qiáng)度比較 （± s，n=3）

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜HMGB1、TLR4、NF-κB平均熒光強(qiáng)度比較 （± s，n=3）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OIR 組比較，P＜0.05。［HMGB1］高遷移率族蛋白B1；［TLR4］Toll 樣受體4；［NF-κB］核轉(zhuǎn)錄因子-κB。

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2.4 Mel 對OIR 小鼠中性粒細(xì)胞浸潤和促炎因子表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，對照組中性粒細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y-6G 和TNF-α 陽性表達(dá)較少，OIR 組和OIR+Mel 組GCL 與INL 均可見Ly-6G、TNF-α 陽性表達(dá)，且OIR+Mel 組Ly-6G、TNF-α 陽性表達(dá)顯著低于OIR 組（P＜0.05）。MPO 活力檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，OIR組MPO活力顯著升高，OIR+Mel組較OIR 組MPO 活力降低（均P＜0.05）。見圖4、表3。

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜Ly-6G、TNF-α平均熒光強(qiáng)度及MPO活力比較 （± s，n=3）

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜Ly-6G、TNF-α平均熒光強(qiáng)度及MPO活力比較 （± s，n=3）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OIR 組比較，P＜0.05。［Ly-6G］淋巴細(xì)胞抗原6G；［TNF-α］腫瘤壞死因子-α；［MPO］髓過氧化物酶。

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2.5 Mel對OIR小鼠Mel受體表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，對照組可見MT1 和MT2的陽性表達(dá)主要位于GCL 與INL，OIR 組GCL 與INL 中MT1 和MT2 陽性表達(dá)較對照組顯著減少，OIR+Mel組MT1和MT2陽性表達(dá)較OIR組增多（均P＜0.05）。見表4、圖5。

表4 各組小鼠視網(wǎng)膜MT1、MT2平均熒光強(qiáng)度比較（± s，n=3）

表4 各組小鼠視網(wǎng)膜MT1、MT2平均熒光強(qiáng)度比較（± s，n=3）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OIR 組比較，P＜0.05。［MT1］褪黑素受體1；［MT2］褪黑素受體2。

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圖5 各組小鼠視網(wǎng)膜中MT1和MT2表達(dá)變化（免疫熒光染色，×400） MT1+、MT2+胞漿染色為綠色，DAPI+細(xì)胞核染為藍(lán)色。OIR+Mel組MT1+、MT2+表達(dá)較OIR組多。［GCL］神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；［INL］內(nèi)核層；［ONL］外核層。

3 討論

ROP 作為一種新生血管性視網(wǎng)膜疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且已有研究證實高氧在誘導(dǎo)ROP 新生血管生成中起著關(guān)鍵作用，新生小鼠OIR模型已被廣泛應(yīng)用于ROP的研究［7］。本研究亦采用經(jīng)典的Smith 等［6］設(shè)計的方法建立新生小鼠OIR模型。視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜血管的正常分布被破壞，中央部出現(xiàn)大片無灌注區(qū)，無灌注區(qū)附近出現(xiàn)病理性新生血管；HE 染色結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)疏松、排列紊亂，內(nèi)界膜不完整，可見較多的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜，均提示OIR模型建立成功。

Mel是松果體分泌的一種內(nèi)分泌激素，除了調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律外，還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及調(diào)節(jié)血管生成等多種生物學(xué)功能［8］。本實驗室以往的研究已證實Mel對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［9-10］。Xu等［4］的研究證實，Mel可通過抑制視網(wǎng)膜血管新生，減輕OIR 小鼠模型中的視網(wǎng)膜損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，Mel干預(yù)后，視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜基本恢復(fù)平整，突出內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)減少，病理性新生血管顯著減少，說明Mel可改善OIR新生小鼠視網(wǎng)膜的組織學(xué)損傷，對視網(wǎng)膜損傷具有保護(hù)作用。

目前的研究認(rèn)為氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能參與了ROP 的發(fā)生發(fā)展，因此推測抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基可能減輕OIR誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。在各種視網(wǎng)膜疾病中，損傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的釋放被認(rèn)為是連接細(xì)胞死亡和炎癥的重要生物過程，釋放到胞外的DAMPs 通過與模式識別受體結(jié)合，如Toll樣受體家族、NOD樣受體家族，進(jìn)而將損傷信號轉(zhuǎn)化為分子事件［11］。其中HMGB1是這一過程中的關(guān)鍵分子，通過與TLR4 結(jié)合，激活NFκB，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生，這些炎癥因子和趨化因子又可募集大量的中性粒細(xì)胞浸潤，使更多細(xì)胞死亡，形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而加重視網(wǎng)膜損傷［12-14］。本研究結(jié)果顯示，HMGB1、TLR4、NF-κB、TNF-α、Ly-6G在OIR組小鼠視網(wǎng)膜的陽性表達(dá)及MPO活性較對照組顯著升高，Mel 處理可使之降低。此外，活化的NF-κB 是NLRP3 的上游分子，可調(diào)控NLRP3炎性小體的組裝［15-16］，使pro-caspase-1募集到NLRP3-ASC 復(fù)合物上，發(fā)生自體的剪切活化，參與IL-1β 的成熟、分泌，而IL-1β 是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)［4，17-18］，提示NLRP3炎性小體在OIR誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中充當(dāng)重要角色。Sui 等［19］的研究證明，OIR模型小鼠中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 等的表達(dá)升高，而NLRP3 的抑制劑（MCC950）使視網(wǎng)膜的新生血管減少、血管滲漏減輕。另有研究顯示，視網(wǎng)膜缺血再灌注誘導(dǎo)的TLR4的表達(dá)先于NLRP3炎性小體的活化，并且TLR4的抑制劑吡格列酮可以抑制NLRP3 炎性小體的激活，從而減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜NLRP3、ASC、procaspase-1、cleaved-caspase-1和IL-1β的陽性反應(yīng)強(qiáng)度較對照組顯著升高，Mel處理可使之降低。以上提示Mel可有效減弱小鼠OIR損傷后視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng)，且Mel可能通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抑制OIR 誘導(dǎo)的NLRP3 炎性小體的活化和中性粒細(xì)胞浸潤。

Baba等［22］研究證實視網(wǎng)膜、角膜等多種眼部組織中均有MT1 和MT2 的表達(dá)；Jiang 等［23］報道，在實驗性糖尿病視網(wǎng)膜病變中，Mel可以通過受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)對視網(wǎng)膜炎癥發(fā)揮保護(hù)作用，表明Mel 可能通過受體途徑對眼部疾病發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，OIR組MT1、MT2表達(dá)顯著減少，Mel處理后可挽救OIR誘導(dǎo)的受體丟失，提示Mel對小鼠OIR損傷后視網(wǎng)膜的保護(hù)作用可能是通過褪黑素受體途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，Mel 可能通過抑制HMGB1/NF-κB/NLRP3 軸減輕OIR 誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷，且可能通過褪黑素受體途徑發(fā)揮作用的。本研究仍存在一些局限性，僅使用免疫熒光染色觀察了HMGB1/NF-κB/NLRP3 軸相關(guān)因子的表達(dá)，后續(xù)實驗將采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blot技術(shù)，檢測相關(guān)因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；并觀察Mel受體拮抗劑N-乙酰-2-芐基色胺或MT 小干擾RNA對Mel 保護(hù)作用的影響，進(jìn)一步探討Mel 對OIR 的保護(hù)作用的機(jī)制，為其在ROP 中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。