喬治華，劉 翔，姚向峰，杜慶志，張建業(yè)，孫石昂，張風(fēng)文，姜興印*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271018；2.農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101)

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于防治病蟲草害[1]，溴氰蟲酰胺作為第二代雙酰胺類殺蟲劑，已得到廣泛應(yīng)用。溴氰蟲酰胺具有觸殺和內(nèi)吸作用，當(dāng)接觸害蟲并被蟲體吸收后，激活靶標(biāo)昆蟲的魚尼丁受體（RyRs），造成昆蟲細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度平衡破壞，最后肌肉過度收縮導(dǎo)致昆蟲死亡[2-3]。目前關(guān)于溴氰蟲酰胺的主要研究集中于對(duì)靶標(biāo)害蟲的防治。研究表明，溴氰蟲酰胺可以很好地防治鱗翅目[4]、半翅目[5]和纓翅目[6-7]害蟲。通常，溴氰蟲酰胺在蔬菜和果樹上可直接噴霧使用或者灌根防治害蟲[8-10]，在玉米田中可以直接進(jìn)行種子處理和土壤混施等方式來防治小地老虎和雙委夜蛾[11-12]，先正達(dá)于2020年首次登記溴氰蟲酰胺種子處理懸浮劑，用來防治玉米田小地老虎。這些防治方法都是利用了其優(yōu)良的內(nèi)吸活性，來達(dá)到防治害蟲的效果。隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，農(nóng)藥的弊端也逐漸暴露出來，農(nóng)藥對(duì)土壤環(huán)境、水環(huán)境的污染逐漸受到人們的關(guān)注[13-14]。溴氰蟲酰胺的長(zhǎng)期使用，在土壤中發(fā)生富集，也必然會(huì)對(duì)土壤環(huán)境帶來問題。

蚯蚓廣泛分布于土壤中，占土壤動(dòng)物生物量的60%～80%，是控制陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)的重要組成部分[15-16]。蚯蚓因?yàn)榫哂袑?duì)環(huán)境污染物敏感，體積較大，常見，易于繁殖等特點(diǎn)，常作為監(jiān)測(cè)土壤污染的指示生物，特別是用于確定土壤中污染物的生態(tài)毒理學(xué)[17-18]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些現(xiàn)代化的手段應(yīng)用于蚯蚓的生態(tài)毒理學(xué)研究，如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等[19-21]。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)手段研究對(duì)蚯蚓微觀指標(biāo)的影響成為目前生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以研究污染物對(duì)生物的轉(zhuǎn)錄水平的影響，從而探究其分子機(jī)理。

目前溴氰蟲酰胺對(duì)環(huán)境生物的影響研究較少，主要集中于急性毒性和生理生化水平的亞慢性毒性研究，而在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上的研究尚未報(bào)道。本研究的主要目的是研究溴氰蟲酰胺對(duì)于土壤生物蚯蚓的生態(tài)毒性，基于本研究前期溴氰蟲酰胺對(duì)蚯蚓的基礎(chǔ)生理生化指標(biāo)的研究結(jié)果，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方式研究溴氰蟲酰胺對(duì)蚯蚓轉(zhuǎn)錄水平的影響，及其對(duì)蚯蚓使用的分子機(jī)理，同時(shí)評(píng)價(jià)溴氰蟲酰胺對(duì)于土壤環(huán)境的影響，為溴氰蟲酰胺的合理使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

94%溴氰蟲酰胺原藥，上海杜邦農(nóng)化有限公司；TRIzol試劑，上海生工生物技術(shù)有限公司；RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒，安捷倫科技（中國）有限公司。QuantStudio 5 熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；BIO-BEST140E紫外凝膠成像儀，美國SIM公司；MyCyclerTMThermal Cycler梯度PCR基因擴(kuò)增儀，美國Bio-rad公司；NanoDrop One分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技中國有限公司。

1.2 赤子愛勝蚓

赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）購于江蘇省句容市王軍蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)。在天然的土壤中，20±1℃下馴養(yǎng)2 w后使其適應(yīng)人工養(yǎng)殖環(huán)境。試驗(yàn)前，取環(huán)帶明顯且大小較一致，重量在300～500 mg的健康成蚓，用0.9%的生理鹽水將蚯蚓體表洗凈，放置在培養(yǎng)皿中，皿內(nèi)鋪有去離子水濕潤的濾紙。20±1℃下放置一夜，目的是清除蚯蚓腸道內(nèi)的雜質(zhì)等[22]，保證試驗(yàn)過程中蚯蚓的死亡率不超過1%。

1.3 試驗(yàn)土壤

蚯蚓的試驗(yàn)土壤采用OECD土[23]。高嶺土和苔蘚泥炭土均購于普天試劑公司。

表1 OECD 土配方

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蚯蚓染毒

溴氰蟲酰胺在土壤中的初始?xì)埩魸舛葹?.40～3.6 mg/kg，半衰期為9.2～20.8 d[14,24]，根據(jù)我們先前的研究結(jié)果[25-26]，轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)設(shè)計(jì)溴氰蟲酰胺濃度為0.1、10 mg/kg干土和100 mg/kg干土，以丙酮處理為對(duì)照組，后面的轉(zhuǎn)錄組分析0.1 mg/kg干土處理組編號(hào)為Cya.L，10 mg/kg干土處理組編號(hào)為Cya.M，100 mg/kg干土處理組編號(hào)為Cya.H，丙酮對(duì)照組編號(hào)為CK。

稱取0.212 8 g溴氰蟲酰胺原藥用丙酮溶解于100 mL的容量瓶中配制成2 000 mg/L的母液，然后將母液稀釋為系列濃度。在50 g的人工土中加入適量的藥液配制成所需要濃度的土壤[23]，對(duì)照組加入25 mL丙酮，攪拌均勻，放于通風(fēng)處使丙酮揮發(fā)干凈，再和450 g人工土混合均勻。加入一定量的無菌去離子水，使土壤含水量達(dá)到土壤質(zhì)量的40%，放在1 L的燒杯中。

從低濃度到高濃度依次進(jìn)行染毒，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。每個(gè)燒杯放入15條經(jīng)過清洗大小一致的蚯蚓，每周于土壤表面加入定量的牛糞和水，用皮筋將保鮮膜封住燒杯口并扎孔保持空氣的流通[27]。放在生化培養(yǎng)箱，溫度為20±1℃，L//D=12 h∶12 h[22]。于染毒后14 d取樣，樣品用液氮及時(shí)冷凍，并放入-80℃冰箱凍存待檢測(cè)。

1.4.2 蚯蚓轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)與分析

用TRIzol試劑按照說明書提取蚯蚓樣品中的總RNA。RNA的完整性通過Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies,CA,US）的RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。RNA的純度和濃度由NanoDrop One 分光光度計(jì)測(cè)定（Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE）。樣品經(jīng)過檢測(cè)合格之后，由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)試。本試驗(yàn)參考基因組信息詳見網(wǎng)址https://bigd.big.ac.cn/search/?dbId=gwh&q=GWHACBE00000000。對(duì)差異表達(dá)基因在7個(gè)數(shù)據(jù)庫（Swiss-Prot，GO，KEGG，COG，KOG，Pfam，NR）進(jìn)行比對(duì)。

采用DESeq2 軟件進(jìn)行差異篩選，將Fold Change≥2且FDR＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用R（v3.6.2）ggplot2程序包繪制差異基因火山圖，使用R（v3.6.2）pheatmap繪制基因表達(dá)聚類熱圖。利用clusterProfiler R軟件包實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因（DEGs）的基因本體（GO）富集分析，使用Kobas軟件檢測(cè)[28]KEGG通路中差異表達(dá)基因的富集。

1.4.3 熒光定量PCR

通過RT-qPCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，選擇10個(gè)與差異顯著相關(guān)的基因進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析，基因及其引物序列設(shè)計(jì)列表見表2。反應(yīng)體系見表3、4。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算。

表2 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的蚯蚓基因引物序列設(shè)計(jì)

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系配制

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

所有用于轉(zhuǎn)錄組的RNA質(zhì)量檢測(cè)如圖1所示，通過電泳條帶可以看出18SRNA條帶清晰無拖尾，由于大多數(shù)的無脊椎生物中28SRNA 有一個(gè)“hidden break”的結(jié)構(gòu)[29]，恰好位于28S的中央導(dǎo)致電泳時(shí)與18S重合。通過Nanodrop定性定量分析，各個(gè)處理的OD260/280值均在1.8～2.2之間，檢測(cè)結(jié)果均為A，說明RNA的純度和完整性較好，RNA濃度均大于400 ng/μL。則12個(gè)樣品的RNA質(zhì)量合格，符合建庫的要求。

圖1 RNA 提取電泳結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因篩選與分析

圖2可以快速準(zhǔn)確地比較出1、10 mg/kg干土溴氰蟲酰胺處理的蚯蚓與CK的差異基因數(shù)目。圖中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，其中點(diǎn)偏離橫坐標(biāo)的0點(diǎn)越遠(yuǎn)，說明該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因的表達(dá)量與CK差異越大；點(diǎn)的縱坐標(biāo)越大，說明該點(diǎn)代表的基因在樣本間差異表達(dá)越顯著。因此試驗(yàn)中應(yīng)盡量選擇偏離橫坐標(biāo)原點(diǎn)且縱坐標(biāo)值大的點(diǎn)所代表的基因作為功能驗(yàn)證基因。

圖2 1 mg/kg 干土（A）、10 mg/kg 干土（B）和100 mg/kg 干土（C）溴氰蟲酰胺處理14 d 后蚯蚓差異表達(dá)基因（DGEs）的數(shù)量火山圖及差異基因韋恩圖（D）

我們可以發(fā)現(xiàn)1 mg/kg干土的處理在第14 d時(shí)與CK相比，顯著差異基因有960個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)438個(gè)，下調(diào)表達(dá)522個(gè)（圖2A）。10 mg/kg干土的處理在第14 d時(shí)與CK相比，篩選出顯著差異基因1 212個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)632個(gè)，下調(diào)表達(dá)580個(gè)（圖2B）。100 mg/kg干土處理在第14 d時(shí)與CK相比，篩選出顯著差異基因1 081個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)608個(gè)，下調(diào)表達(dá)473個(gè)（圖2C），同時(shí)從1 mg/kg干土到10 mg/kg干土差異基因顯著增多，10 mg/kg干土到100 mg/kg干土差異基因有所下降。由圖2D中的韋恩圖可知，蚯蚓在3 個(gè)處理組中共有3 253 條差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），不同差異表達(dá)基因集中的DEG有重疊，其中93個(gè)基因在不同處理組間均呈現(xiàn)出差異表達(dá)。

對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析（圖3），其中橫坐標(biāo)表示不同樣品對(duì)應(yīng)的基因。顏色不同表示基因在樣品中的表達(dá)量水平不同。2個(gè)處理間所有差異表達(dá)基因共聚類成6組，組內(nèi)基因的表達(dá)水平基本相似。通過結(jié)果我們可以看出CKvsCya.L（圖3A）中聚類結(jié)果將CK和Cya.L很好地分開，每個(gè)處理的3個(gè)重復(fù)聚類到一起，說明重復(fù)性良好。同樣CKvsCya.M、CKvsCya.H也是如此。

圖3 CK vs Cya.L（A）、CK vs Cya.M（B）、CK vs Cya.H（C）差異表達(dá)基因聚類圖

圖4 CK vs Cya.L（A）、CK vs Cya.M（B）、CK vs Cya.H（C）的差異表達(dá)基因GO 注釋分類統(tǒng)計(jì)圖

2.3 差異表達(dá)基因功能富集分析

2.3.1 差異基因注釋結(jié)果

對(duì)篩選的差異基因與7個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，得出在各個(gè)基因庫中注釋的基因數(shù)量如表5所示?？梢钥闯鯟KvsCya.L在7個(gè)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)注釋的基因數(shù)為586個(gè)，其中在GO注釋基因數(shù)為288個(gè)，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)為65個(gè)，COG數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)86個(gè)；CKvsCya.M在7個(gè)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)的注釋基因數(shù)為760個(gè)，其中在GO注釋基因數(shù)為438個(gè)，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)為125個(gè)，COG數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)為114個(gè)；CKvsCya.H在7個(gè)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)的注釋基因數(shù)為669個(gè)，其中在GO注釋基因數(shù)為413個(gè)，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)為111個(gè)，COG數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)為113個(gè)。

表5 注釋的差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

2.3.2 差異基因GO富集分析

共有25 709條Unigene被成功注釋到三大類的55個(gè)二級(jí)功能條目中。3個(gè)處理在細(xì)胞組分共富集了19個(gè)功能條目，在分子功能共富集了13個(gè)功能條目，在生物學(xué)過程共富集了23個(gè)功能條目。細(xì)胞組分上1、10、100 mg/kg干土處理與CK相比，胞外區(qū)、細(xì)胞、膜部分、突觸部分、細(xì)胞組分等二級(jí)分類的功能條目顯著增加。分子功能上1、10、100 mg/kg干土與CK相比，酶的催化活性、分子功能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等二級(jí)分類的功能條目顯著增加。在生物學(xué)過程上，1、10、100 mg/kg干土處理與CK處理相比，繁殖、細(xì)胞進(jìn)程、繁殖過程、發(fā)育過程、生長(zhǎng)、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、解毒等二級(jí)分類的功能條目顯著增加。

2.3.3 差異基因KEGG富集分析

在圖5中，3個(gè)濃度的處理與CK之間的差異基因富集的KEGG一級(jí)代謝通路均為細(xì)胞進(jìn)程、遺傳信息處理、人類疾病、環(huán)境信息處理、代謝作用、有機(jī)系統(tǒng)六大通路。在細(xì)胞進(jìn)程一級(jí)代謝通路中，各個(gè)處理的差異基因主要富集于細(xì)胞的生長(zhǎng)與死亡、真核生物的細(xì)胞群落、運(yùn)輸和分解代謝3個(gè)二級(jí)代謝通路中，同時(shí)高濃度（10、100 mg/kg干土）的處理在細(xì)胞進(jìn)程代謝通路富集的差異基因顯著高于低濃度（1 mg/kg干土）的處理。在環(huán)境信息處理一級(jí)代謝通路中，低濃度（1 mg/kg干土）的處理的差異基因主要集中于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)分子的相互作用二級(jí)代謝通路。高濃度（10、100 mg/kg干土）處理相比于低濃度又增加了膜信號(hào)二級(jí)代謝通路，同時(shí)在其他2個(gè)二級(jí)代謝通路富集的差異基因也顯著增加。在遺傳信息處理的一級(jí)代謝通路中，各個(gè)處理的差異基因主要富集于折疊、分類和降解，高濃度（10、100 mg/kg干土）處理均有差異基因在翻譯二級(jí)代謝通路富集。在新陳代謝一級(jí)代謝通路中，低濃度（1 mg/kg干土）處理的差異基因在糖代謝二級(jí)通路富集最多，在其他6條二級(jí)通路富集差異基因較少。在高濃度（10、100 mg/kg干土）處理中，在脂質(zhì)代謝二級(jí)通路富集的差異基因最多，100 mg/kg干土的處理組在糖代謝二級(jí)通路中與低濃度處理相比，富集的差異基因顯著增多。同時(shí)高濃度處理組中差異的二級(jí)通路也比低濃度處理增多。在有機(jī)系統(tǒng)一級(jí)代謝通路中，低濃度的處理差異基因主要富集在內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。在高濃度的處理中差異基因顯著增多，同時(shí)富集的二級(jí)通路也顯著增加。主要表現(xiàn)在原有的二級(jí)通路富集基因數(shù)增加，同時(shí)增加了在循環(huán)系統(tǒng)、環(huán)境適應(yīng)、消化系統(tǒng)等二級(jí)通路的富集基因。

圖5 CK vs Cya.L（A）、CK vs Cya.M（B）、CK vs Cya.H（C）的差異表達(dá)基因KEGG 分類圖

2.3.4 RT-qPCR對(duì)關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

分別選取了10 個(gè)差異顯著的基因進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證，通過計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量與CK的相對(duì)表達(dá)量倍數(shù)得出圖6?？梢钥闯鼋?jīng)過RT-qPCR后的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果基本一致。結(jié)果顯示控制谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因evm.TU.Chr02.2134表達(dá)下調(diào)，控制熱激蛋白70基因evm.TU.Chr11.1027上調(diào)，控制細(xì)胞色素P450 18 a1基因evm.TU.Chr01.306和evm.TU.Chr04.1250均下調(diào)?？刂柒}調(diào)蛋白-腺苷酸環(huán)化酶反應(yīng)的基因evm.TU.Chr11.1424下調(diào)?？刂普{(diào)節(jié)幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的基因evm.TU.Chr09.1717下調(diào)，證明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠性較高。

圖6 RT-qPCR 對(duì)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

基于Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)探究溴氰蟲酰胺對(duì)赤子愛勝蚓轉(zhuǎn)錄水平的影響。通過差異基因的韋恩圖和火山圖可以看出，溴氰蟲酰胺1、10 mg/kg干土和100 mg/kg干土處理與CK相比，差異基因顯著增加，這表明溴氰蟲酰胺對(duì)蚯蚓轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生顯著影響。Zhu等[20]研究土壤中的TiO2納米粒子對(duì)蚯蚓的影響也是如此，從5 mg/kg到500 mg/kg與CK相比，差異基因也顯著增加。

GO數(shù)據(jù)庫是2000年構(gòu)建的一個(gè)結(jié)構(gòu)化標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，目的是建立一個(gè)基因及其產(chǎn)物適用于各個(gè)物種的知識(shí)標(biāo)準(zhǔn)詞匯體系[30]。GO注釋系統(tǒng)是一個(gè)有向無環(huán)圖，其中包括3個(gè)主要分支，分別為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能[31]。通過GO富集分析可以看出，暴露于溴氰蟲酰胺后，蚯蚓在細(xì)胞組分上與神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)二級(jí)分類條目增加，這可能與溴氰蟲酰胺作用于魚尼丁受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的變化有關(guān)。在分子功能的二級(jí)條目的基因富集說明蚯蚓暴露于溴氰蟲酰胺后，蚯蚓體內(nèi)的各種抗氧化酶及其他酶的活性會(huì)發(fā)生變化，同時(shí)蚯蚓體內(nèi)開始對(duì)于溴氰蟲酰胺的毒性做出反應(yīng)調(diào)節(jié)，因此差異基因富集于酶的催化活性、分子功能調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性上。同時(shí)我們之前的研究也表明溴氰蟲酰胺能夠?qū)е买球倔w內(nèi)抗氧化酶活性的改變[25]。但是蚯蚓暴露于溴氰蟲酰胺后差異基因最多的還是富集于生物學(xué)過程上，可以看出隨著濃度的增加，溴氰蟲酰胺對(duì)蚯蚓的繁殖、生長(zhǎng)的生物學(xué)過程的影響也在加強(qiáng)。刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、解毒二級(jí)功能條目主要是對(duì)外界的刺激條件做出反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行自身的調(diào)節(jié)作用和對(duì)污染物的解毒作用。隨著濃度的增加，這些二級(jí)功能條目的富集基因增加，說明蚯蚓對(duì)于溴氰蟲酰胺的毒性應(yīng)激反應(yīng)增加。Liu等[32]研究氯蟲苯甲酰胺對(duì)于蚯蚓生長(zhǎng)繁殖的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著濃度的增加，蚯蚓的體重降低，繁殖量減少。同時(shí)也有研究表明蚯蚓暴露于污染物后體內(nèi)的抗氧化酶活性、解毒酶活性、抗逆基因以及生殖基因等相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生改變[33-35]。

作為有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫[36]，KEGG主要提供代謝途徑的查詢，其中包括碳水化合物、核苷、氨基酸等代謝途徑及有機(jī)物的生物降解途徑，而且對(duì)催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注解。KEGG是對(duì)生物體內(nèi)代謝分析和代謝網(wǎng)絡(luò)研究的有效工具。通過KEGG差異基因富集分析可以看出，低濃度的溴氰蟲酰胺處理下主要影響環(huán)境信息處理和代謝途徑一級(jí)代謝通路，差異基因主要富集于這2個(gè)通路。而高濃度處理下，則影響環(huán)境信息處理、代謝途徑和有機(jī)系統(tǒng)一級(jí)代謝通路，同時(shí)富集的差異基因顯著增多，差異基因富集到的二級(jí)通路也顯著增加。這可能是溴氰蟲酰胺濃度增加對(duì)蚯蚓的影響增大引起的。在代謝途徑一級(jí)通路中，低濃度的溴氰蟲酰胺影響蚯蚓的差異基因主要富集于糖代謝途徑，而在高濃度處理下差異基因還更多的富集于脂質(zhì)代謝途徑。這可能是溴氰蟲酰胺濃度的增高不僅對(duì)于糖代謝途徑影響加大，同時(shí)也開始影響脂質(zhì)代謝途徑。內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)起主導(dǎo)作用的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它們密切聯(lián)系，互相配合，維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定[37]。當(dāng)隨著濃度的升高，溴氰蟲酰胺開始影響蚯蚓的消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。我們認(rèn)為溴氰蟲酰胺可能首先導(dǎo)致蚯蚓的內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相關(guān)基因發(fā)生改變，然后導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境的紊亂，影響了蚯蚓的各種代謝途徑，最終導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變。陳婷[38]研究重金屬鉛對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒性表明，鉛能夠?qū)е买球灸芰看x、氨基酸代謝等代謝途徑失衡。

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果我們可以看出，低濃度的溴氰蟲酰胺對(duì)于蚯蚓的轉(zhuǎn)錄水平影響較小，影響的代謝通路較少。隨著濃度的升高，溴氰蟲酰胺對(duì)蚯蚓影響的差異基因增多，差異基因富集的代謝通路在增加，說明溴氰蟲酰胺對(duì)蚯蚓轉(zhuǎn)錄水平影響增大，可能對(duì)蚯蚓的毒性增大。