吳俊儀，陳武，翟俊瓊※

（1.南寧市動(dòng)物園，廣西 南寧 530003；2.廣州動(dòng)物園&廣州市野生動(dòng)物研究中心，廣東 廣州 510070）

博爾納病毒（Borna disease virus,BDV）是單股負(fù)鏈、不分節(jié)段和嗜神經(jīng)性的RNA 病毒，可感染鳥(niǎo)類及大多數(shù)恒溫哺乳動(dòng)物。禽博爾納病毒（Avian borna virus,ABV）是導(dǎo)致鳥(niǎo)類腺胃擴(kuò)張癥（Proventricular dilatanon disease,PDD）的主要病原，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)具有嚴(yán)重威脅，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。20 世紀(jì)70 年代，首次在一只精神沉郁、嚴(yán)重嘔吐的金剛鸚鵡上發(fā)現(xiàn)PDD，目前已有報(bào)道顯示70 多種鸚鵡產(chǎn)生PDD[1]。2008 年，在一只患有PDD 的鸚鵡上首次發(fā)現(xiàn)ABV[2]。到目前為止，國(guó)內(nèi)對(duì)鸚鵡感染ABV 的相關(guān)報(bào)道較少，主要為博爾納病毒4 型，且集中在對(duì)博爾納病毒的檢測(cè)和序列分析方面[3-7]。本研究在臨床中遇到1 例非洲灰鸚鵡出現(xiàn)腺胃擴(kuò)張癥的案例，經(jīng)過(guò)尸體剖檢檢查、病理變化及實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)和測(cè)序，證實(shí)感染鸚鵡的是博爾納病毒2 型（PaBV-2），為國(guó)內(nèi)的首次發(fā)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 病料

2021 年3 月，廣東省某養(yǎng)殖場(chǎng)鸚鵡出現(xiàn)死亡，無(wú)菌采集病死鸚鵡腦、腺胃。

1.2 主要試劑

病毒RNA/DNA 提取試劑盒（AxyPrePTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit）購(gòu)自AXYGEN，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit）購(gòu)自TaKaRa，膠回收試劑盒（D2500-02 Gel Extraction Kit D2500）購(gòu)自O(shè)MEGA，酶制劑[PCR Master Mix（2X）]購(gòu)自Thermo Fisher。

1.3 方法

1.3.1 疑似PaBV 感染的臨床癥狀以及病理觀察觀察疑似PaBV 感染的鸚鵡癥狀以及死后剖檢變化，并取病變較嚴(yán)重的組織做切片觀察。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank 上發(fā)表的鸚鵡博爾納病毒序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)用于擴(kuò)增鸚鵡博爾納病毒的通用引物（PaBV-F 和PaBV-R）（表1），擴(kuò)增長(zhǎng)度約350bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 鸚鵡博爾納病毒鑒定引物Table 1 Primers for identification of parrots Bornavirus

1.3.3 疑似PaBV 感染的RT-PCR 鑒定 取鸚鵡腦和腺胃組織，用研缽研磨，根據(jù)病毒RNA/DNA 提取試劑盒說(shuō)明提取RNA，按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用1.3.2 引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。PCR 反應(yīng)體系：Mix 12.5L，PCR Forward Primer 1L，PCR Reverse Primer 1L，cDNA 1L，Nuclease-free Water 9.5L。反應(yīng)程序：95℃，4min；95℃30s，55℃30s，72 ℃45 （s1 kb/min），35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。1%電泳觀察結(jié)果。

1.3.4 產(chǎn)物測(cè)序及序列分析 將陽(yáng)性RT-PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MEGA7對(duì)NCBI 上下載的8 個(gè)基因型PaBV 序列與本研究測(cè)到的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及病理變化

該非洲灰鸚鵡病初食欲下降、精神萎靡、嘔吐、偶有墨綠色糞便，伴頭撞墻等癥狀。隨病程發(fā)展，鸚鵡出現(xiàn)虛弱、精神沉郁、死亡癥狀。死后剖檢發(fā)現(xiàn)腺胃有明顯擴(kuò)張，是正常腺胃的幾倍大，占據(jù)腹腔大部分體積，胃內(nèi)有大量未消化食物并伴酸臭味，胃壁變薄，腦部充血，見(jiàn)圖1。

圖1 非洲灰鸚鵡腦Fig.1 African grey parrot brain

取腺胃組織浸泡甲醛固定液，送至武漢長(zhǎng)衍病理科技有限公司進(jìn)行病理切片制作。由圖2 可知，腺胃組織切片可見(jiàn)部分黏膜組織及間質(zhì)水腫（紅色），間質(zhì)可見(jiàn)灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（藍(lán)色）。

圖2 腺胃病理切片圖（100 ）Fig.2 Glandular gastropathy section（100 ）

2.2 PaBV的檢測(cè)及序列分析

將RT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物約350bp（圖3），與目的基因序列大小相符，將產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到擴(kuò)增片段的序列。通過(guò)比對(duì)分析建立遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖4），發(fā)現(xiàn)本研究鑒定出的鸚鵡博爾納病毒與美國(guó)及泰國(guó)的7 株鸚鵡博爾納病毒2 型同屬一個(gè)分支。

圖3 鸚鵡博爾納病毒檢測(cè)電泳圖Fig.3 Electrophoresis of borna virus detection in parrots

圖4 根據(jù)M 基因序列建立遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Genetic evolution tree based on M gene sequence

3 討論

ABV 自1970 年報(bào)道發(fā)現(xiàn)以來(lái)，多感染鸚鵡、金絲雀等鳥(niǎo)類，致死率高，各類珍禽受到很大威脅。由于廣泛的商貿(mào)活動(dòng)，使得PDD 在寵物鳥(niǎo)中持續(xù)傳播至世界各國(guó)。巨嘴鳥(niǎo)、加拿大鵝、鴕鳥(niǎo)、番鴨、鴿、鶉哥、貓頭鷹、鶩、密雀、織雀及其它雀形目鳥(niǎo)類已經(jīng)檢出該病毒，家禽中，鴨、鵝及鴿也攜帶該病毒[8]。研究顯示，ABV 感染宿主后，主要侵害鳥(niǎo)類的神經(jīng)系統(tǒng)，特別是鳥(niǎo)類胃腸道上部自主神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腺胃擴(kuò)張，無(wú)法正常蠕動(dòng)，腸內(nèi)細(xì)菌由于過(guò)度繁殖導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)敗血癥和死亡。感染ABV 后，還可能出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、消瘦、腹瀉及糞便內(nèi)出現(xiàn)未消化完全食物等癥狀，但在臨床上，癥狀往往不固定，也不夠單一，可能表現(xiàn)出一種或幾種癥狀，攜帶該病毒的鳥(niǎo)類也可能不表現(xiàn)出特有的臨床癥狀，或者癥狀不明顯，這給診斷帶來(lái)困難[5]。有研究表明，ABV 可通過(guò)尿 糞 口途徑傳播，但目前的數(shù)據(jù)仍無(wú)法支撐，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)[9-12]。已知感染ABV 的鳥(niǎo)類可通過(guò)排泄物間歇性排毒，且有研究在糞便及被糞便、尿液污染的羽毛中檢測(cè)到該病毒[13]，因此對(duì)于活體的診斷，最好能做到間歇性多次采樣以減少假陰性；對(duì)于死亡個(gè)體，可通過(guò)剖檢觀察臟器變化、病理切片以及分子檢測(cè)來(lái)確診。NCBI上能查到鸚鵡感染禽博爾納病毒共有PaBV-1~8 共8 個(gè)型，以PaBV-2 和PaBV-4 型最多[9]，本研究通過(guò)病理變化及RT-PCR 檢測(cè)后測(cè)序證實(shí)該鸚鵡感染PaBV-2，在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。該病毒基因型的遺傳化分析表明，與歐美相關(guān)基因型的毒株同源性較近，結(jié)合動(dòng)物來(lái)源分析，該鳥(niǎo)的親鳥(niǎo)是從美洲地區(qū)引進(jìn)至該養(yǎng)殖場(chǎng)的，推測(cè)是由親鳥(niǎo)傳播導(dǎo)致該鳥(niǎo)感染。禽博爾納病毒感染的途徑多種多樣，禽博爾納病毒毒株的來(lái)源也可以來(lái)源世界多個(gè)地區(qū)[14-17]。由于目前國(guó)內(nèi)樣本數(shù)量不足，檢測(cè)不系統(tǒng)，且僅能采集零星發(fā)病的病例樣本檢測(cè)，其流行情況和地理分布規(guī)律均有待進(jìn)一步研究。

迄今為止，暫沒(méi)有疫苗和特效藥用于預(yù)防和治療該病，曾有研究證實(shí)核苷酸類似物利巴韋林可以抑制細(xì)胞系中的博爾納病毒增殖，但無(wú)法完全消除該病毒，且僅限于細(xì)胞層面，在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步證實(shí)[18]。有研究者嘗試對(duì)鸚鵡進(jìn)行口服利巴韋林進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)既沒(méi)有對(duì)該病有任何治療效果，也沒(méi)有對(duì)鳥(niǎo)類產(chǎn)生有害影響[13]；最近，抗病毒化合物法匹拉韋（T-705）被證明在細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制博爾納病毒的效率明顯高于利巴韋林，并且可能能夠從持續(xù)感染的培養(yǎng)物中完全消除博爾納病毒[19]，是否也能在體內(nèi)提供抗病毒效果，以及接受治療的鳥(niǎo)類是否耐受該藥物，仍有待闡明。目前主要是通過(guò)監(jiān)測(cè)病毒來(lái)實(shí)施鳥(niǎo)群管理，對(duì)感染的鳥(niǎo)類通過(guò)隔離、消毒和凈化等閉環(huán)管理防控，同時(shí)防止病毒進(jìn)一步傳播，因此，實(shí)驗(yàn)室病原監(jiān)測(cè)能有效防控鸚鵡感染博爾納病毒，而對(duì)于感染鳥(niǎo)類則主要采用支持療法、對(duì)癥治療或采取隔離消毒等措施自我凈化[20]。

綜上所述，本研究通過(guò)臨床癥狀、病理變化以及分子檢測(cè)證實(shí)廣東省某鸚鵡養(yǎng)殖場(chǎng)鸚鵡感染博爾納病毒2 型，為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，本研究為博爾納病毒的診斷提供了依據(jù)，并為后續(xù)該病的防控提供了參考。