李楠，李鋒，魏佳韻，喬艷玲,3，李香豫，王優(yōu)美,3，徐鵬,3*，狄斌*

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.國家禁毒委員會辦公室-中國藥科大學禁毒關鍵技術聯(lián)合實驗室，北京100193；3.毒品監(jiān)測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，公安部禁毒情報技術中心，北京100193）

色胺類物質(zhì)是一類以色胺為母核的化學物質(zhì)，具有與神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）相似的化學結構和藥理作用，通過與5-HT 受體結合產(chǎn)生致幻效應，其致幻效應強烈，作用時間長，嚴重威脅吸食者健康和公共安全[1]。α-甲色胺（alpha-methyltryptamine，AMT）、5-甲氧-α-甲色胺（5-methoxy-alpha-methyltryptamine，5-MeO-AMT）和5-甲氧-N，N-二異丙色胺（5-methoxy-N，N-diisopropyl tryptamine，5-MeO-DiPT）是三種合成色胺類物質(zhì)，在國內(nèi)均被列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品》，受到了嚴格管控，但在國際上，盡管AMT 已受到聯(lián)合國1971 年《精神藥物公約》的管控，但5-MeOAMT 與5-MeO-DiPT 只在部分國家受到了管控，且近幾年仍有較多濫用現(xiàn)象[1-3]。有研究認為色胺類物質(zhì)精神依賴性較低，但相關研究較為匱乏[4]。3，4-亞甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）是常見毒品搖頭丸的主要活性成分，具有較強的精神依賴性和致幻作用。MDMA 與5-HT 受體也具有一定親和力，而且MDMA 引起實驗動物的“搖頭”現(xiàn)象與色胺類物質(zhì)引起實驗動物的“甩頭”現(xiàn)象類似[5]。本研究通過條件性位置偏愛（Conditioned Place Preference，CPP）實驗，以MDMA 為陽性對照，對三種色胺類物質(zhì)AMT、5-MeO-AMT 和5-MeO-DiPT 的獎賞效應進行評估，并對其精神依賴性大小進行比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級ICR 雄性小鼠，體重18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010。動物房溫度控制在20～25℃，相對濕度控制在50%～65%，12 h 明暗循環(huán)照明。實驗開始前，動物在動物房至少適應環(huán)境1～2 d，飼料與清潔水可自由攝取。對實驗動物進行的操作均符合實驗動物倫理學，遵循國家動物使用和保護委員會頒布的相關條例。

1.2 實驗藥品與試劑

AMT、5-MeO-AMT、5-MeO-AMT、5-MeO-DiPT、MDMA 由公安部禁毒情報技術中心提供，純度均≥98%。0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），購自山東齊都藥業(yè)有限公司。四種化合物均采用0.9%氯化鈉注射液溶解，實驗前新鮮配制。陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液。

1.3 實驗設備

條件性位置偏愛箱（以下簡稱CPP 箱）及CPP 視頻分析系統(tǒng)（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）。CPP 箱采用三室式CPP 箱（400 mm×150 mm×350 mm），箱體的材料為醫(yī)用PVC，并由兩塊活動隔板分成左、中、右三室。左右室（170 mm×150 mm×350 mm）大小相等。左室內(nèi)壁黑色，底部為圓點狀鏤空底板，右室內(nèi)壁為黑白相間的條紋，底部為圓點與條狀相間鏤空底板。高清攝像頭安裝于CPP 箱正上方以記錄小鼠的活動情況，使用Tracking Master V3.63計算機軟件記錄每個小鼠在每個隔間停留的時間。

1.4 動物分組及給藥

將前篩合格的實驗小鼠按體重隨機分為5 大組：陰性對照組（生理鹽水）、MDMA 不同劑量組（分別為1 mg/kg，3 mg/kg，10 mg/kg）、AMT 不同劑量組（分別為3 mg/kg，10 mg/kg，30 mg/kg）、5-MeOAMT 不同劑量組（分別為3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg）和5-MeO-DiPT 不同劑量組（分別為3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg）。各劑量組小鼠8～12 只，腹腔注射，固定體積給藥。

1.5 實驗方法

實驗前一天，將小鼠放入CPP 箱中以適應環(huán)境。正式實驗包括3個階段：前篩、給藥訓練和表達測試[6]。第1 天進行前篩：將小鼠從中間室放入CPP 箱內(nèi)，使其在箱內(nèi)自由活動15 min，測定小鼠的天然偏愛傾向。將小鼠天然非偏愛側（右室）作為伴藥箱，另一側（左室）作為非伴藥箱，剔除在左右兩室中天然偏愛差異較大的小鼠（剔除標準：小鼠在左右兩室停留時間差值＞120s）。將前篩合格的小鼠進行分組。第2～6 天進行給藥訓練：放入活動隔板以阻斷CPP 箱內(nèi)通道，各組小鼠每天上午腹腔給藥，立即放入伴藥箱停留45 min，下午給予生理鹽水，立即放入非伴藥箱停留45 min，陰性對照組小鼠每天上下午都給予生理鹽水，上下午給藥的時間間隔≥6 h。第7 天進行表達測試：在給藥訓練的最后一次給藥的24 h 后進行測試。表達測試當天不給藥。將活動隔板取出，將小鼠從中間室放入CPP 箱內(nèi)，使其在箱內(nèi)自由活動15 min。分別記錄小鼠在伴藥箱和非伴藥箱內(nèi)停留的時間。計算CPP 分數(shù)，計算公式為：CPP 分數(shù)=伴藥箱停留時間-非伴藥箱停留時間。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8 軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±SEM）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Bonferroni post hoc檢驗，以P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MDMA 的CPP 實驗結果

單因素方差分析顯示，不同劑量的MDMA[F（3，29）=18.36，P＜0.0001]對CPP 分數(shù)有顯著性影響，CPP 分數(shù)與給藥劑量在實驗劑量范圍內(nèi)呈正相關；Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，MDMA 在劑量為3mg/kg 和10mg/kg 時能顯著影響CPP 分數(shù)的表達，即能使小鼠對伴藥箱產(chǎn)生顯著的位置偏愛。在一定范圍內(nèi)，隨著給藥劑量的增加，MDMA 誘導的小鼠CPP 分數(shù)表達逐漸增強，見圖1。

圖1 不同劑量的MDMA 腹腔給藥訓練后測得的CPP 分數(shù)

2.2 三種色胺類物質(zhì)的CPP 實驗結果

單因素方差分析顯示，不同劑量的AMT[F（3，30）=3.877，P=0.0187]對CPP 分數(shù)有顯著性影響；Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，AMT 在劑量為30mg/kg 時能誘導小鼠對伴藥箱產(chǎn)生顯著的位置偏愛（圖2A）。不同劑量的5-MeO-AMT[F（3，35）=4.763，P=0.0069]對CPP 分數(shù)有顯著性影響；Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，5-MeO-AMT 在劑量為30mg/kg 時能誘導小鼠對伴藥箱產(chǎn)生顯著的位置偏愛（圖2B）。與陰性對照組相比，不同劑量的5-MeO-DiPT 對CPP 分數(shù)的表達均無顯著性差異（圖2C）。

圖2 不同劑量的AMT（A）、5-MeO-AMT（B）、5-MeO-DiPT（C）腹腔給藥訓練后測得的CPP 分數(shù)

3 討論

3.1 給藥劑量對CPP 分數(shù)的影響

本研究結果顯示，MDMA 引起小鼠產(chǎn)生CPP 行為的最小有效劑量為3 mg/kg，而AMT 和5-MeOAMT 的劑量則需要達到30 mg/kg 時才能引起小鼠產(chǎn)生顯著的CPP 行為，在本研究劑量范圍內(nèi)，5-MeODiPT 不能誘導小鼠產(chǎn)生CPP 行為。分析認為，CPP實驗是評價藥物獎賞效應的經(jīng)典動物實驗模型，廣泛應用于藥物精神依賴性初步評價。該模型建立的理論依據(jù)是巴普洛夫經(jīng)典條件反射，首先通過反復訓練使動物在環(huán)境刺激與藥物作用之間建立聯(lián)系，然后通過測試動物對該環(huán)境的偏愛程度來測定該藥物的獎賞作用強度[7]。因此，CPP 實驗可評估藥物的獎賞效應和藥物濫用潛在威脅，常用于初步篩查某種藥物是否具有成癮性。MDMA 是常見毒品“搖頭丸”的主要活性成分，能產(chǎn)生致幻作用，對其精神依賴性的研究較多，相關研究顯示[8]，MDMA 腹腔給藥劑量為5 mg/kg 時能誘導小鼠產(chǎn)生顯著的CPP行為，而本研究中MDMA 引起小鼠產(chǎn)生CPP 行為的最小有效劑量（3 mg/kg）與之接近。另有研究[9，10]采用CPP 實驗和自身給藥實驗評估了5-MeO-AMT、吡咯烷基色胺、哌啶基色胺、N，N-二丁基色胺和2-甲基色胺的精神依賴性，結果表明這五種色胺類物質(zhì)均不能誘導實驗動物的CPP 行為和自身給藥行為，其中5-MeO-AMT 的CPP 實驗只研究了0.3mg/kg、1mg/kg 和3mg/kg 這三個較低的劑量，且均不能誘導小鼠產(chǎn)生顯著的CPP 行為。而本研究結果顯示，盡管5-MeO-AMT 在劑量為3mg/kg 和10mg/kg 時也不能誘導小鼠產(chǎn)生顯著的CPP 行為，但5-MeO-AMT在劑量為30mg/kg 時能夠誘導實驗動物的顯著CPP行為，提示色胺類物質(zhì)在大劑量長期使用的情況下可能會產(chǎn)生明顯的精神依賴性。

通常情況下，在相同條件下誘導實驗動物開始形成CPP 的劑量越小，說明該物質(zhì)引起獎賞效應的能力越強。AMT 和5-MeO-AMT 形成CPP 的劑量是MDMA 的10 倍，一定程度上可反映AMT 和5-MeOAMT 的獎賞效應較弱，5-MeO-DiPT 幾乎不具有獎賞效應。以上結果說明了在這幾種物質(zhì)中，MDMA的獎賞效應最強，與MDMA 相比，三種色胺類物質(zhì)的獎賞效應較低，其精神依賴性大小相對效力如下：MDMA＞AMT ≈5-MeO-AMT＞5-MeO-DiPT。此 外，盡管5-MeO-DiPT 在本研究的劑量范圍內(nèi)均不能引起小鼠的CPP 行為，但在實驗過程中觀察到，5-MeODiPT 劑量增加到60 mg/kg 時出現(xiàn)了個別小鼠死亡的現(xiàn)象，提示該劑量可能接近其半數(shù)致死劑量，但該劑量下仍不能誘導小鼠產(chǎn)生CPP行為，表明5-MeO-DiPT毒性較強但精神依賴性可能較低。

3.2 影響CPP 結果的可能神經(jīng)生物學機制分析

MDMA 和三種色胺類物質(zhì)在獎賞效應上的差異可能與該物質(zhì)對不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的不同作用有關。目前普遍認為，腦內(nèi)獎賞效應可能是產(chǎn)生精神依賴性和強迫性覓藥行為的主要原因，中腦邊緣多巴胺（DA）通路是藥物獎賞效應形成的重要神經(jīng)生物學基礎，5-羥色胺（5-HT）主要對DA起負性調(diào)節(jié)的作用，因此在藥物的精神依賴性研究中，DA 和5-HT 是研究較多的兩種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。MDMA 能激活5-HT 受體和DA 受體，從而產(chǎn)生各種生物學效應。相關研究表明[11]，D1 受體和D2 受體拮抗劑能使MDMA 大鼠自身給藥模型中的劑量-效應曲線右移，證明MDMA 獎賞效應的產(chǎn)生與DA受體的功能改變相關。

而色胺類物質(zhì)主要通過激活5-HT 受體產(chǎn)生藥理作用，對DA 受體的作用則相對較弱。Nagai F等[12]研 究 表 明，AMT、5-MeO-AMT 和5-MeODiPT 對5-HT 在大鼠腦中的再攝取均有抑制作用，其中AMT（IC50=3.8±0.74×10-7M）的效力與MDMA（IC50=7.2±1.9×10-7M）相當。放射性受體配體結合研究顯示[13]，在色胺類物質(zhì)中，5-MeO-AMT 與5-HT2A受體的親和力最強（Ki±SD=0.034±0.01 μM），而對DA 受體的親和力較弱。此外，5-MeO-DiPT 對不同腦區(qū)內(nèi)DA 和5-HT 的作用強度可能不同，DA 和5-HT兩種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放也可能相互影響其具體的機制，需要進一步研究[14]。

CPP 實驗只是判斷藥物是否具有精神依賴性的初步實驗，很多自然性獎賞物質(zhì)如甜食等也可形成CPP，實驗數(shù)據(jù)也可能存在較高的假陽性率[15]。此外，色胺類物質(zhì)普遍具有強烈的致幻效應，致幻效應是一種視覺、聽覺和觸覺等感覺上的主觀效應，實驗動物在給予致幻劑類物質(zhì)后可能會喪失對外部環(huán)境的判斷能力，產(chǎn)生錯誤的主觀感覺，因此僅通過CPP 實驗評估色胺類物質(zhì)的獎賞效應并不準確。要想得到確定的結果還需要進一步評估，如結合可信度更高、在藥物成癮研究中更為經(jīng)典的自身給藥實驗和藥物辨別實驗等對色胺類物質(zhì)進行進一步研究。

3.3 總結與不足

本研究通過CPP 實驗評估了AMT、5-MeO-AMT和5-MeO-DiPT 三種色胺類物質(zhì)的獎賞效應，并與較為常見的毒品MDMA 進行了比較，結果揭示了盡管色胺類物質(zhì)的獎賞效應較弱，但該類物質(zhì)在大劑量長期使用的情況下仍然可以產(chǎn)生明顯精神依賴性，該現(xiàn)象應當引起高度重視。