◎ 王雪酈，帥 蓮，劉雪婷，王璐瑤

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

藠頭（Allium chinenseG. Don）又稱蕎頭和薤等，屬百合科、蔥屬多年生宿根性草本植物。藠頭富含蛋白質(zhì)和人體所需的多種礦物質(zhì)、維生素等，具有開味、祛腥、健胃、順氣[1-2]、保護(hù)心血管系統(tǒng)健康[3]、抗菌抑菌、抗癌防癌[4-5]、抗氧化和增強(qiáng)免疫力[6]等功效。目前，主要采取浸泡發(fā)酵的方式對藠頭進(jìn)行加工[7]，以此減少藠頭自身的辛辣、沖味，增加酸辣、嫩脆的口感[8]。但是傳統(tǒng)藠頭的加工多采用自然發(fā)酵工藝，該方法不僅發(fā)酵周期長、不利于產(chǎn)品規(guī)?；皹?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，而且產(chǎn)品易出現(xiàn)亞硝酸鹽累積現(xiàn)象[9-10]。亞硝酸鹽是亞硝胺和亞硝基酰胺等致癌物質(zhì)的前體，對人體健康和安全構(gòu)成較大威脅[11-13]，故如何減少發(fā)酵食品中亞硝酸鹽的生成是研究的熱點(diǎn)。劉永逸等[14]研究表明經(jīng)純種乳酸菌發(fā)酵后的酸筍中亞硝酸鹽含量較低，增加了產(chǎn)品的安全性和風(fēng)味。

大量研究證實(shí)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）具有高效降解亞硝酸鹽的能力[15-19]。本研究采用一株植物乳桿菌對藠頭進(jìn)行低鹽純種發(fā)酵，以亞硝酸鹽含量為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)探究接種量、食鹽添加量、白糖添加量和發(fā)酵溫度對發(fā)酵藠頭產(chǎn)品品質(zhì)的影響[20-24]，解決傳統(tǒng)發(fā)酵高鹽，品質(zhì)、口感不一的問題，為純種低鹽發(fā)酵藠頭的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：藠頭、食鹽、白糖、純凈水、白酒、小米椒、花椒、大蒜、老姜和干紫蘇（市售）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（保藏于貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

試劑：亞硝酸鈉、95%乙醇、酚酞、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硼酸鈉、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、鹽酸、氨水和硝酸等均為分析純；MRS 瓊脂培養(yǎng)基；MRS 肉湯培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204B 型電子天平，上海天美天平儀器有限公司；SPX-250-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TD5MD 型臺式低速離心機(jī)，長沙邁佳森儀器設(shè)備公司；JYL-C020E 組織搗碎機(jī)，九陽股份有限公司；HH-6 數(shù)顯型恒溫水浴鍋，常州澳SPX-250-Z型華儀器有限公司；722 型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-75G 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

原料選擇→清洗、整切→裝瓶→加入配料→接菌種懸浮液→發(fā)酵→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）配料。純凈水500 mL、白酒12.5 mL、小米椒10 g、花椒2.5 g、大蒜7.5 g、老姜2.5 g、干紫蘇1 g、食鹽和白糖少量。

（2）菌種活化。從-80 ℃取出甘油管保藏的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）菌種，接種至MRS 培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種至MRS 液體培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)18 ～20 h，以5%的接種量轉(zhuǎn)接到MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，于5 000 r·min-1離心5 min 后收集菌體，制備成菌體密度為4.88×106CFU·mL-1的種子液備用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以菌種接種量5%、食鹽添加量4%、白糖添加量4%、發(fā)酵溫度30 ℃為基礎(chǔ)，在工藝條件和其他影響指標(biāo)相同的情況下，研究菌種接種量（2%、4%、6%、8%和10%）、食鹽添加量（2%、4%、6%、8%和10%）、白糖添加量（2%、3%、4%、5%和6%）、發(fā)酵溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃）對產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以亞硝酸鹽含量為響應(yīng)值，以菌種接種量（A）、白糖添加量（B）、食鹽添加量（C）和發(fā)酵溫度（D）為變量，采用Box-Behnken 展開4 個因素3 個水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平表

1.3.5 理化檢測

亞硝酸鹽檢測：依照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對藠頭產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的影響

由圖1 可知，當(dāng)接種量為8%時，亞硝酸鹽含量最低，為0.137 mg·kg-1，因此選擇最適接種量為8%。當(dāng)接種量過小，會導(dǎo)致發(fā)酵時間過長，亞硝酸鹽累積濃度過大；反之，發(fā)酵速度較快，菌株可在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量乳酸，可有效抑制雜菌生長的同時，增加產(chǎn)品的風(fēng)味。

圖1 菌種接種量對亞硝酸鹽 含量的影響圖

2.1.2 食鹽添加量對藠頭產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的影響

由圖2 可知，當(dāng)食鹽添加量在6%～8%時，亞硝酸鹽含量呈線性增加，說明高鹽發(fā)酵后的產(chǎn)品易出現(xiàn)亞硝酸鹽的累積。當(dāng)食鹽添加量為6%時，亞硝酸含量最低，達(dá)0.488 mg·kg-1，因此選擇最適食鹽添加量為6%。

圖2 食鹽添加量對亞硝酸鹽含量的影響圖

2.1.3 白糖添加量對藠頭產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的影響

由圖3 可知，當(dāng)白糖添加量為3%時，亞硝酸鹽的含量最低，為0.383 mg·kg-1，因此選擇最適白糖添加量為3%。

圖3 白糖添加量對亞硝酸鹽含量的影響圖

2.1.4 發(fā)酵溫度對藠頭產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的影響

發(fā)酵溫度會影響酶的活性，從而影響植物乳桿菌的生長和代謝活動[23-24]。發(fā)酵溫度過低，植物乳桿菌受抑制，導(dǎo)致雜菌生長，造成污染，亞硝酸含量較高。由圖4 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，亞硝酸鹽含量呈先下降后上升再下降趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，亞硝酸含量最低，為0.144 mg·kg-1，因此選擇最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對亞硝酸鹽含量的影響圖

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

以亞硝酸鹽含量為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇A、B、C、D4 個因素，進(jìn)行4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以探究藠頭發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示，采用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并對各因素進(jìn)行多元擬合?；貧w方程如下所示。亞硝酸鹽含量=0.30-0.12A-5.83×10-3B+0.052C-4.17×10-3D+0.023AB-7.5×10-3AC-0.13AD-0.015BC+0.030BD+0.092CD+0.100A2+0.021B2+0.052C2+0.098D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

由表3 的方差分析可知，該模型P＜0.01，回歸模型差異極顯著。失擬項(xiàng)P=0.633 7（P＞0.05），表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；方差分析中R2=0.952 2、試驗(yàn)結(jié)果表明模型擬合程度較好，適用于藠頭發(fā)酵條件預(yù)測和分析。其中回歸方程的一次項(xiàng)A、C對藠頭的亞硝酸鹽含量影響極顯著，B、D不顯著，且影響的順序依次為A＞C＞B＞D，交互項(xiàng)AD、CD及二次項(xiàng)A2、C2、D2極顯著，其余均不顯著，這表明各個試驗(yàn)因素對亞硝酸鹽含量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 亞硝酸鹽含量的方差分析結(jié)果表

兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖見圖5。由圖5 可知，菌種接種量與白糖添加量、菌種接種量與食鹽添加量、食鹽添加量與白糖添加量、發(fā)酵溫度與白糖添加量的等高線呈圓形，顯示因素間交互作用不顯著（P＞0.05），菌種接種量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度與食鹽添加量的等高線呈橢圓形，顯示因素間交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖5 菌種接種量與3 個因素的交互作用對亞硝酸鹽含量影響的響應(yīng)面圖

通過響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果并依據(jù)回歸模型，得到以亞硝酸鹽含量為響應(yīng)值的最佳發(fā)酵工藝條件為菌種接種量8.86%，白糖添加量2.00%，食鹽添加量4.24%，發(fā)酵溫度35.00 ℃，預(yù)測亞硝酸鹽最小值為0.20 mg·kg-1。為便于后續(xù)加工試驗(yàn)，選擇最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為菌種接種量9%，白糖添加量2%，食鹽添加量4%，發(fā)酵溫度35 ℃，在此條件下對所建模型進(jìn)行驗(yàn)證，亞硝酸鹽含量為0.196 mg·kg-1，驗(yàn)證值與預(yù)測值基本吻合，說明模型很好地模擬和預(yù)測了藠頭發(fā)酵工藝。

3 結(jié)論

以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，選取菌種接種量、白糖添加量、食鹽添加量、發(fā)酵溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)值試驗(yàn)，得到藠頭最佳發(fā)酵條件為菌種接種量9%、白糖添加量2%、食鹽添加量4%、發(fā)酵溫度35 ℃，在此條件下測得的亞硝酸鹽含量為0.196 mg·kg-1，本研究為藠頭純種低鹽發(fā)酵工藝提供了理論參考。