陳倩倩,陶文揚,鄭美瑜,馬子甲,王 璐,陸勝民,*

(1.浙江師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321000; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所,浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室,浙江 杭州 310021)

枇杷花是薔薇科蘋果亞屬枇杷屬植物枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.]的花卉,在我國民間自古就有以枇杷花入藥治療咳疾的記載。自2019年起,枇杷花被國家衛(wèi)生健康委員會收錄為新食品資源原料[1]。為了提高品質(zhì)和穩(wěn)產(chǎn),每年果農(nóng)都會對枇杷樹進行疏花穗處理,因而產(chǎn)生了大量的枇杷花副產(chǎn)物。已報道的文獻顯示,枇杷花黃酮和多酚類物質(zhì)具有抑菌[2]、抗炎[3]、抗氧化清除自由基[4]等功效。但目前為止,有關(guān)枇杷花的美白功效、枇杷花提取物對酪氨酸酶抑制效果的報道并不多見[5]。

黑色素的過度表達會導(dǎo)致色素沉積而產(chǎn)生色素斑,嚴(yán)重者更是會出現(xiàn)黑色素腫瘤[6]。黑色素合成是一個涉及多重反應(yīng)的復(fù)雜過程,主要涉及酪氨酸酶基因家族的3種酶,包括TYR、TYR-1和TYR-2。其中酪氨酸酶(TYR,EC 1.14.18.1)參與L-酪氨酸(L-Tyr)和左旋多巴(L-DOPA)的氧化過程,L-Tyr被酪氨酸酶催化成L-DOPA,然后進一步催化生成多巴醌[7],而多巴醌再經(jīng)過一系列反應(yīng)生成黑色素。酪氨酸酶催化反應(yīng)被認(rèn)為是黑色素合成的限速步驟,因而酪氨酸酶可視為黑色素合成的限速酶[8]。目前酪氨酸酶抑制劑主要有曲酸、熊果苷等,但是曲酸可能會致敏,熊果苷可能會引起細(xì)胞毒性[9-10],所以找尋一種新的酪氨酸酶抑制劑十分必要。目前,從紫蘇[11]中發(fā)現(xiàn)芹菜素-7-O-二葡萄糖苷酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、黃芩苷和7-羥基香豆素;從千日紅[12]中發(fā)現(xiàn)香草酸、麥黃酮、對羥基肉桂酸和對甲氧基肉桂酸;還從多種植物中發(fā)現(xiàn)槲皮素、異李鼠素、圣草酚、香豆酸和阿魏酸等[13-20]具有抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)。本實驗以酪氨酸酶抑制率為指標(biāo),提取純化枇杷花中的酪氨酸酶抑制成分并鑒定出主要組分,為從天然提取物中尋找新型天然黑色素抑制劑提供新的思路和途徑,為枇杷花的研究和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;MJ-PB80Easy218攪拌機,廣東美的生活電器制造有限公司;AR224 CN型電子分析天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;LXJ-IIB低速離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;SCIENTZ-10N冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Tecan Spark 多功能酶標(biāo)儀,廣州深華公司;Thermo Vanquish UHPLC 高效液相色譜儀、Q-Exactive HF 高分辨質(zhì)譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Zorbax Eclipse C18 色譜柱,安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 材料與試劑

枇杷鮮花穗由寧波美棲生物科技有限公司提供,鮮花在40 ℃條件下熱風(fēng)烘干至含水量5.41%,粉碎過50目篩,密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、二甲基亞砜(DMSO)(均為分析純),購自上海麥克林生化科技有限公司;酪氨酸酶(500 U·mg-1),購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;左旋多巴(L-DOPA),上海源葉生物科技有限公司;D101大孔樹脂,上海麥克林生化科技有限公司;甲醇、乙腈(均為HPLC-MS級),購自德國默克集團(Merck KgaA);甲酸(HPLC-MS級),購自西亞化學(xué)科技(山東)有限公司。

1.3 體外酪氨酸酶抑制率測定方法

參考Mahdavi等[21]的方法并在其基礎(chǔ)上進行適當(dāng)修改。按表1進行分組,在96孔板內(nèi)加入相應(yīng)試劑混勻,37 ℃孵育9 min,加入100 μL L-DOPA (0.2 mg·mL-1) 37 ℃反應(yīng)15 min,于475 nm處測D值,設(shè)置3組平行。根據(jù)測定結(jié)果計算酪氨酸酶抑制率。

表1 反應(yīng)體系Table 1 Reaction system

1.4 單因素實驗設(shè)計

1.4.1 浸提時間對提取物體外酪氨酸酶活性抑制率的影響

稱取枇杷花干粉5.0 g,設(shè)定料液比(m∶V)為1∶20,提取次數(shù)1次,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,浸提溫度50 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速500 r·min-1,浸提時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的條件下,考察浸提時間對提取物體外酪氨酸酶活性抑制率的影響。

1.4.2 乙醇濃度對體外酪氨酸酶活性抑制率的影響

稱取枇杷花原料5.0 g,設(shè)定料液比(m∶V)1∶20,浸提溫度50 ℃,浸提時間0.5 h,提取次數(shù)1次,攪拌轉(zhuǎn)速500 r·min-1,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%的條件下,考察乙醇濃度對提取物體外酪氨酸酶活性抑制率的影響。

1.4.3 溫度對體外酪氨酸酶活性抑制率的影響

稱取枇杷花原料5.0 g,設(shè)定提取時間0.5 h,料液比(m∶V)1∶20,提取次數(shù)1次,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,攪拌轉(zhuǎn)速500 r·min-1,浸提溫度分別為20、40、50、60、80 ℃的條件下,考察浸提溫度對提取物體外酪氨酸酶活性抑制率的影響。

1.4.4 浸提次數(shù)對體外酪氨酸酶活性抑制率的影響

稱取枇杷花原料5.0 g,設(shè)定料液比(m∶V)1∶20,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,浸提溫度50 ℃,浸提時間0.5 h,攪拌轉(zhuǎn)速500 r·min-1,浸提次數(shù)分別為1、2、3、4、5次的條件下,考察提取次數(shù)對提取物體外酪氨酸酶活性抑制率的影響。

1.5 正交試驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平正交實驗,以體外酪氨酸酶活性抑制率為指標(biāo),優(yōu)化枇杷花醇提物的提取工藝,實驗因素及水平見表2。

表2 基于體外酪氨酸酶活性抑制率的枇杷花提取工藝優(yōu)化的正交試驗因素及水平Table 2 Orthogonal test factors and levels of loquat flower extraction process optimization based on in vitro tyrosinase inhibition rate

最優(yōu)提取條件下的枇杷花粗提物冷凍干燥,用于后續(xù)實驗。

1.6 D101大孔樹脂靜態(tài)純化工藝優(yōu)化

1.6.1 大孔樹脂預(yù)處理

將D101型大孔樹脂用蒸餾水沖洗除去劣質(zhì)樹脂,置于95%乙醇中,浸泡24 h使其充分溶脹后用蒸餾水沖洗至無醇味;再將大孔樹脂置于5%鹽酸中浸泡12 h,用蒸餾水沖洗至中性;最后將大孔樹脂用5%的氫氧化鈉浸泡12 h,用蒸餾水洗至中性,備用[22]。

1.6.2 大孔樹脂吸附平衡時間的確定

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的大孔樹脂1.0 g,置于25 mL的錐形瓶中,加入40 mg·mL-1的枇杷花粗提物水溶液15 mL,在轉(zhuǎn)速160 r·min-1、25 ℃條件下,搖床振蕩12 h,每隔1.0 h 取樣一次,獲得上清液,測定樣品對酪氨酸酶活性的抑制率,并計算出不同吸附時間下大孔樹脂對酪氨酸酶具有抑制活性物質(zhì)的吸附率Q。計算公式見式(1):

(1)

式(1)中:C0為枇杷花粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率;Ce為上清液對酪氨酸酶活性的抑制率。

1.6.3 大孔樹脂解析時間的確定

將吸附飽和的D101大孔樹脂重新置入25 mL容量瓶中,加入60%乙醇水溶液10 mL,在轉(zhuǎn)速130 r·min-1、25 ℃條件下,搖床振蕩4.5 h,每隔0.5 h 取樣一次,獲得解析液,測定樣品對酪氨酸酶活性的抑制率,并計算出不同解析時間下大孔樹脂對酪氨酸酶具有抑制活性物質(zhì)的解析率D。計算公式見式(2)。

(2)

式(2)中:C0、Ce與式(1)相同;C1為解析液對酪氨酸酶的抑制率。

1.7 D101大孔樹脂對動態(tài)純化工藝優(yōu)化

1.7.1 上樣濃度對吸附的影響

采用濕法裝柱,稱取適量大孔樹脂進行裝柱,測量出柱體積(BV)為20 mL。配制不同濃度(25、30、40、50 mg·mL-1)的枇杷花粗提物水溶液為上樣溶液,上樣流速為3.0 BV·h-1,以1.0 BV·h-1收集一次,按1.3節(jié)的方法計算收集液對體外酪氨酸酶活性的抑制率。參考王亞楠[11]的方法,當(dāng)流出液對酪氨酸酶活性的抑制率大于50%時,則認(rèn)為到達了泄漏點,此時停止上樣。記錄泄漏點,確定不同上樣濃度對大孔樹脂動態(tài)吸附酪氨酸酶活性抑制成分效果的影響。

1.7.2 上樣流速對吸附的影響

采用濕法裝柱,稱取適量大孔樹脂(濕重)進行裝柱,測量出柱體積為20 mL。選擇質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1的枇杷花粗提物水溶液作為上樣液,分別以2、3、4、5 BV·h-1流速進行上樣,1 BV·h-1收集一次,按照1.3節(jié)的方法測定收集液對體外酪氨酸酶活性的抑制率,達到泄漏點時停止上樣。確定不同上樣流速對大孔樹脂動態(tài)吸附酪氨酸酶活性抑制成分效果的影響。

1.7.3 洗脫劑濃度對解析的影響

將吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗去除雜質(zhì),然后分別用不同體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%)的乙醇溶液進行洗脫,洗脫速度設(shè)定為4.0 BV·h-1,0.5 BV·h-1收集一次,按1.3節(jié)的方法測定收集液對體外酪氨酸酶活性的抑制率,直至收集液對酪氨酸酶抑制率小于10%時停止洗脫。確定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂中酪氨酸酶活性抑制成分洗脫效果的影響。

1.7.4 洗脫流速對解析的影響

將吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗洗去雜質(zhì),用60%的乙醇作為洗脫劑,分別用3、4、5、6 BV·h-1的洗脫流速進行洗脫,0.5 BV·h-1收集一次。按1.3節(jié)的方法測定收集液對體外酪氨酸酶活性的抑制率,直至收集液的抑制率小于10%。確定不同洗脫流速對大孔樹脂洗脫酪氨酸酶抑制成分效果的影響。

1.8 色譜條件與質(zhì)譜條件

參考文獻[23-24]稍加改進,取最優(yōu)提取及純化條件下的枇杷花提取物冷凍干燥,用70%甲醇配制成100 mg·mL-1溶液,進行質(zhì)譜檢測。

色譜柱為Zorbax Eclipse C18色譜柱,柱體積為1.8 μm×2.1 mm×100 mm。色譜分離條件為:柱溫30 ℃,流速0.3 mL·min-1,流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為純乙腈,進樣量為2.0 μL,自動進樣器溫度為4 ℃。

質(zhì)譜條件:離子源溫度325 ℃;離子噴霧干燥電壓3.5 kV;質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 500。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

由圖1-A可知,隨著浸提時間的延長枇杷花粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率先升后降,浸提時間在1.0 h時粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率達到峰值,為47.9%。浸提時間影響溶劑與不同細(xì)胞位置活性物質(zhì)的接觸程度。隨著浸提時間的延長,溶劑將滲透至枇杷花組織細(xì)胞的更多部位,從而接觸并溶解更多的活性物質(zhì),有利于有效成分的提取[12]。但隨著浸提時間的進一步延長,細(xì)胞內(nèi)部分其他物質(zhì)也會一同析出,這將降低酪氨酸酶活性抑制成分的占比,過長受熱(50 ℃)也會導(dǎo)致該類活性成分的降解從而使粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率降低[2]。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The values with different lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).圖1 提取時間(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取溫度(C)、提取次數(shù)(D)對枇杷花粗提物體外酪氨酸酶活性抑制率的影響Fig.1 Effects of extraction time (A), ethanol volume fraction (B), extraction temperature (C), and extraction times (D) on in vitro tyrosinase inhibition rate of loquat flower extracts

由圖1-B可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時,枇杷花粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率隨乙醇濃度的升高呈上升趨勢;乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%后,枇杷花粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率出現(xiàn)下降。根據(jù)相似相溶的原理,低體積分?jǐn)?shù)乙醇水溶液可以溶解植物中極性較高的成分,如植物細(xì)胞的主要成分蛋白質(zhì)、淀粉等,但這類物質(zhì)對酪氨酸酶沒有抑制作用[12]。因此,適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)有利于具有酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的浸出[25],而進一步提升乙醇體積分?jǐn)?shù)后,提取物的酪氨酸酶活性抑制率沒有隨之增加,反而出現(xiàn)下降的情況,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)是提取枇杷花中酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的重要影響因素。

由圖1-C可知,隨著浸提溫度的提高枇杷花粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率表現(xiàn)為先升后降,浸提溫度在60 ℃時粗提物對酪氨酸酶活性的抑制率達到峰值。溫度升高會加快細(xì)胞的破裂和有效物質(zhì)的擴散浸出,而隨著溫度的進一步升高抑制率出現(xiàn)下降,這可能是有效物質(zhì)被熱分解導(dǎo)致流失[26]。由此可知,浸提溫度也是提取枇杷花酪氨酸酶活性抑制物質(zhì)的重要影響因素。

由圖1-D可知,隨著提取次數(shù)的增加有效物質(zhì)的提取率反而出現(xiàn)下降,這可能是因為提取次數(shù)的增加提高了原料中的可溶性膳食纖維、可溶性蛋白和淀粉等雜質(zhì)浸出而降低了有效物質(zhì)的占比[27]。此外,提取次數(shù)的增加延長了有效物質(zhì)與空氣的接觸時間,這也將導(dǎo)致酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的氧化,從而導(dǎo)致對該酶抑制效果的減弱[28-29]。

2.2 正交試驗結(jié)果

由正交試驗可知,4個因素對提取物的酪氨酸酶抑制活性影響大小為C>A>D>B,即乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時間>提取次數(shù)。由k值可知,試驗的最優(yōu)組合為A1B2C2D2,該條件下進行驗證實驗,其提取物對酪氨酸酶活性的抑制率為65%,高于正交試驗表(表3)中最優(yōu)組合的59.65%,因此最優(yōu)組合為A1B2C2D2,即溫度50 ℃、提取次數(shù)3次、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時間1.0 h。在此條件下枇杷花粗提物的得率(得率=粗提物/原料)為30.01%,對酪氨酸酶活性抑制率的IC50值為25 mg·mL-1。

表3 基于體外酪氨酸酶活性抑制率的枇杷花提取工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of loquat flower extraction optimization based on in vitro tyrosinase inhibition rate

2.3 分批式吸附-解析實驗結(jié)果

D101型大孔樹脂對枇杷花中具有酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的吸附平衡時間見圖2。由圖可知,吸附時間在4.5 h內(nèi),隨著吸附時間的延長,大孔樹脂對枇杷花提取物中具有酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的吸附率逐漸增大;吸附時間超過4.5 h后,吸附率逐漸趨于穩(wěn)定。因此,大孔樹脂對枇杷花粗提物中酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的最佳吸附平衡時間選擇為4.5 h。

圖2 D101型大孔樹脂對枇杷花粗提物中具有酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的分批式吸附-解析動力學(xué)曲線Fig.2 Static adsorption-elution kinetic curves of macroporous resin D101 to substances with tyrosinase inhibitory activity in loquat flower ethanol extract

由圖2也可知,大孔樹脂對枇杷花中具有酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的解析率隨解析時間的延長而增大,在3.5 h之前解析率穩(wěn)步上升,而當(dāng)解析時間達到3.5 h后,解析率趨于穩(wěn)定。因此,大孔樹脂對枇杷花粗提物中具有酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的最佳解析時間選擇為3.5 h。

2.4 動態(tài)吸附-洗脫實驗結(jié)果

2.4.1 上樣濃度

由表4可知,上樣濃度越高,泄漏點出現(xiàn)的時間越早。當(dāng)上樣濃度為50 mg·mL-1時,泄漏點出現(xiàn)在8 BV,這是因為上樣濃度過高,樣品會堵塞大孔樹脂,從而導(dǎo)致有效成分泄露,吸附量減少。而當(dāng)上樣濃度為25 mg·mL-1時,泄漏點出現(xiàn)最晚,樹脂對樣品中具酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的吸附量最高,但是用時過長、效率低下。綜合考慮選擇40 mg·mL-1作為最佳上樣濃度。

表4 上樣液濃度對D101型大孔樹脂動態(tài)吸附性能的影響Table 4 Effect of sample solution concentrations on dynamic adsorption performance of macroporous resin D101

2.4.2 上樣流速、洗脫劑濃度、洗脫流速對大孔樹脂動態(tài)純化酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的影響

由圖3-A可知,上樣流速越快泄漏點出現(xiàn)得越早,表現(xiàn)為當(dāng)上樣速度為2、3、4和5 BV·h-1時,泄漏點分別出現(xiàn)在14、14、12和5 BV·h-1。上樣過程中,流速過高會導(dǎo)致樣液與大孔樹脂接觸不充分,樣品組分來不及被大孔樹脂吸附而流出,造成很大程度的浪費[30]。因此,上樣流速越低,大孔樹脂對樣品中有效成分的吸附效果越好。2 BV·h-1和3 BV·h-1泄漏點出現(xiàn)的時間相近,綜合考慮選擇3 BV·h-1作為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速(A)、乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)(B)、洗脫流速(C)對D101型大孔樹脂中酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)洗脫效果的影響Fig.3 Effect of sample flow rate (A), ethanol eluent volume fraction (B), and elution velocity (C) on desorption performance of tyrosinase inhibitory substances in macroporous resin D101

由圖3-B可知,乙醇洗脫液的體積分?jǐn)?shù)對出峰時間無明顯影響。當(dāng)用40%乙醇溶液洗脫時,峰型最寬且有很嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象,對有效成分的分離效果不理想;50%、60%、70%乙醇溶液洗脫時,峰型相似,但以60%乙醇洗脫的峰型相對更窄。因此,考慮選擇60%乙醇作為洗脫溶劑。

選擇60%乙醇作為洗脫劑,不同洗脫速度對大孔樹脂洗脫有效成分效果的影響結(jié)果見圖3-C。

在3、4、5、6 BV·h-1洗脫流速下,各組洗脫液中酪氨酸酶抑制活性出峰時間和峰值的最大值相近。其中6 BV·h-1洗脫流速時的峰值最高,但是該條件下峰寬且有拖尾現(xiàn)象,分離效果不好;3、4、5 BV·h-1洗脫流速下的峰面積和最大峰值相似,但5 BV·h-1洗脫流速下的峰面積小于3和4 BV·h-1,可能是大孔樹脂吸附的物質(zhì)大部分被洗脫下來后,由于流速過快洗脫劑不能充分地進入大孔樹脂內(nèi)部洗脫吸附的樣品[31]。綜合考慮選擇4 BV·h-1作為最佳洗脫流速。

因此,D01型大孔樹脂對枇杷花粗提物的最優(yōu)純化條件為上樣濃度40 mg·mL-1、上樣流速 3 BV·h-1、60%乙醇體積分?jǐn)?shù)作為洗脫劑、洗脫速度4 BV·h-1。在該條件下純化物的得率為4.39%,純化物對酪氨酸酶活性抑制率的IC50值為4 mg·mL-1,未被D101純化前的粗提物對酪氨酸酶活性抑制率的IC50值為25 mg·mL-1,由數(shù)據(jù)可知,D101對酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)的收集和純化還是具有很好的效果。

2.5 枇杷花提取純化物中酪氨酸酶活性抑制成分的鑒定結(jié)果

圖4為枇杷花乙醇提取純化物樣本的總離子流(TIC)圖。液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)初步分析發(fā)現(xiàn)枇杷花的酪氨酸酶抑制活性提取純化物中含有黃酮類物質(zhì)、肉桂酸及其衍生物、苯及其衍生物等26個大類,共鑒定出成分137種。對比中外文獻發(fā)現(xiàn),具有酪氨酸酶抑制活性的化合物有12種(表5)。

圖4 枇杷花乙醇提取純化物樣本的總離子流(TIC)圖Fig.4 Total ion current (TIC) diagram of loquat flower ethanol extraction purified sample

表5 全譜鑒定結(jié)果統(tǒng)計表Table 5 Statistical table of full spectrum identification results

3 結(jié)論與討論

以枇杷干花為原料,酪氨酸酶活性抑制率為考察指標(biāo),采用單因素結(jié)合正交試驗,獲得枇杷花具酪氨酸酶抑制活性粗提物的最佳提取工藝:在料液比(m∶V)1∶20條件下,提取劑為50%乙醇體積分?jǐn)?shù),提取溫度為50 ℃,提取次數(shù)為3次,每次時間為1.0 h。應(yīng)用D101型大孔樹脂純化枇杷花粗提物時最佳靜態(tài)吸附平衡時間為4.5 h,靜態(tài)解析平衡時間為3.5 h;動態(tài)吸附-洗脫條件為:上樣濃度40 mg·mL-1、上樣流速 3 BV·h-1、60%乙醇體積分?jǐn)?shù)作為洗脫劑、洗脫速度4 BV·h-1。在上述條件下粗提物的提取率為30.01%,純化物的得率為4.39%。液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)初步分析發(fā)現(xiàn),枇杷花中具有酪氨酸酶抑制活性的物質(zhì)含有黃酮類、肉桂酸及其衍生物、苯及其衍生物等26個大類,共鑒定出成分137種。對比中外文獻發(fā)現(xiàn),其中包含槲皮素、異鼠李素、對香豆酸等12種化合物具有酪氨酸酶抑制活性。本研究為枇杷花的研究和利用提供一種新的方法。