李崇娟,呂鳳仙,楊 鼎,張麗琴,蘭 梅,楊紅麗,徐學(xué)忠,胡靖鋒,申時(shí)品,吳毓飛,和江明,*,董相書

(1.云南大學(xué) 資源植物研究院,云南 昆明 650504; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所,云南 昆明 650205; 3.國(guó)家蔬菜改良分中心云南分中心,云南 昆明 650205; 4.鎮(zhèn)雄縣農(nóng)業(yè)科技推廣中心,云南 鎮(zhèn)雄 657200)

芥菜(Brassicajuncea,AABB,2n=36)是十字花科蕓薹屬一種重要蔬菜,由黑芥(Brassicanigra,BB,2n=16)與蕓薹(Brassicarapa,AA,2n=20)天然雜交后自然加倍形成的雙二倍體進(jìn)化而來(lái)[1]。作為異源多倍體,芥菜的營(yíng)養(yǎng)器官在自然演變進(jìn)化和人們的選擇馴化栽培過程中發(fā)生了多向而強(qiáng)烈的分化,形成了如今的根用、莖用、葉用、薹用4大類16個(gè)變種和眾多的變異類型[2]。葉用芥菜是其中最為廣泛種植的一類,主要用于腌制加工或鮮食,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于目前葉用芥菜生產(chǎn)上大多以地方品種或者提純復(fù)壯的常規(guī)品種為主,存在品種單一、混雜、優(yōu)良性狀退化等問題[3],急需高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、性狀優(yōu)良、滿足市場(chǎng)生產(chǎn)需求的新品種,來(lái)補(bǔ)足目前生產(chǎn)上葉用芥菜品種的短板。利用雜種優(yōu)勢(shì)育種是品種改良的有效途徑之一,但由于芥菜是常異花授粉作物,與甘藍(lán)和白菜類蔬菜相比,芥菜自交親和指數(shù)高,無(wú)法利用自交不親和系配制雜交種,所以雄性不育材料的利用成為了芥菜優(yōu)良品種選育的主要途徑。

蘿卜胞質(zhì)雄性不育(Ogura cytoplasmic male sterility,Ogura CMS)是Ogura在日本鹿兒島的一個(gè)蘿卜群體中發(fā)現(xiàn)的天然雄性不育類型[4],其不育度和不育株率均可達(dá)100%,且不育性穩(wěn)定,是目前為止十字花科作物中不育性最徹底的胞質(zhì)不育源之一,有極高的研究?jī)r(jià)值[5]。在白菜、甘藍(lán)等蔬菜育種中已被廣泛利用,但在芥菜育種中研究報(bào)道尚少。

目前,我國(guó)葉用芥菜雜種優(yōu)勢(shì)育種研究中利用較廣泛的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型是hau CMS,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)利用轉(zhuǎn)育的多個(gè)葉用芥菜變種hau細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育出的華芥1號(hào)、華芥2號(hào)等優(yōu)良雜交種已在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用[6]。但長(zhǎng)期使用一種不育細(xì)胞質(zhì)開展雜種優(yōu)勢(shì)育種,會(huì)造成細(xì)胞質(zhì)單一、負(fù)效應(yīng)增加等問題,創(chuàng)制新的雄性不育源有利于豐富芥菜雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑。Nilornpun等[7]將美國(guó)引進(jìn)的胞質(zhì)不育源轉(zhuǎn)育到泰國(guó)葉芥中,得到的8個(gè)葉芥品種均出現(xiàn)苗期低溫黃化、蜜腺不發(fā)達(dá)、雄蕊敗育不徹底等問題,未能在生產(chǎn)上大面積推廣利用。金海霞等[8]通過種間雜交、多代回交的方式,將白菜的不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到葉用芥菜中,育成了5個(gè)芥菜雄性不育系。章時(shí)蕃等[9]以改良型蘿卜胞質(zhì)大白菜雄性不育系為不育源,成功轉(zhuǎn)育了結(jié)球芥和長(zhǎng)柄芥不育系。由于芥菜類蔬菜的雜種優(yōu)勢(shì)利用相比其他十字花科蔬菜研究起步較晚,目前報(bào)道的不育系大多存在育性不穩(wěn)定、蜜腺不發(fā)達(dá)等問題[10],創(chuàng)制優(yōu)良的Ogura CMS芥菜材料成為了選育新品種芥菜的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)以課題組選育的新型Ogura CMS白菜為不育源,開展細(xì)胞質(zhì)雄性不育源種間雜交轉(zhuǎn)育的研究,通過遠(yuǎn)緣雜交和連續(xù)回交法,把芥菜的B基因組導(dǎo)入到白菜的不育細(xì)胞質(zhì)中,達(dá)到回交核替換的目的,育成雄性不育性穩(wěn)定、植株形態(tài)與輪回親本相近、有正常結(jié)籽能力的芥菜雄性不育材料,以豐富芥菜種資質(zhì)源,拓寬芥菜雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑,為芥菜類蔬菜品種改良提供理論基礎(chǔ)和材料來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的蘿卜胞質(zhì)不育源白菜CCR17001和輪回親本葉用芥菜JC17000皆由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所十字花科課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 遠(yuǎn)緣雜交與連續(xù)回交

遠(yuǎn)緣雜交:為促使花期相遇,白菜CCR17001于2017年10月上旬播種,芥菜JC17000于15 d后播種。2017年12月初,將材料定植到云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院嵩明基地大棚內(nèi),進(jìn)行常規(guī)管理。植株現(xiàn)蕾10 d后開始雜交,以CCR17001為母本,JC17000為父本,雜交前2～3 d摘除父母本花序上已開放的花朵,并噴施適量殺蟲劑,套以硫酸紙袋隔離。于父本花蕾開放當(dāng)天上午取花粉授至母本的柱頭上,每隔2～3 d重復(fù)授粉1次,重復(fù)2～3次,以克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性。

連續(xù)回交:白菜與芥菜雜交后,在田間常規(guī)管理,收獲雜種F1代種子,于2018年春,與輪回親本芥菜JC17000進(jìn)行回交,次年從回交后代中選擇表現(xiàn)為雄性不育的植株,再與輪回親本回交,如此連續(xù)回交多年,同時(shí)適當(dāng)進(jìn)行加代繁殖,至2022年春季完成5個(gè)世代的回交轉(zhuǎn)育,逐步將胞質(zhì)不育源材料的核基因替換為芥菜核基因,得到胞質(zhì)不育芥菜。轉(zhuǎn)育模式見圖1。

圖1 蘿卜胞質(zhì)雄不育芥菜轉(zhuǎn)育模式Fig.1 Breeding model for the transfer of Ogura CMS in mustard

1.2.2 胚挽救條件優(yōu)化

不同激素含量的培養(yǎng)基?；亟坏?、2年,由于三倍體在減數(shù)分裂過程中染色體的非正常配對(duì),導(dǎo)致胚敗育,常規(guī)培養(yǎng)無(wú)法得到回交后代,需對(duì)回交后的胚珠進(jìn)行人工培養(yǎng)。分別于第1次、第2次回交授粉后第13天,選取表面有明顯膨大的角果,自來(lái)水沖洗干凈,置于超凈工作臺(tái)內(nèi),先后用75%乙醇和10% NaClO浸泡50 s、15 min,消毒完畢后,用無(wú)菌水沖洗3次,并浸泡5 min,濾紙吸干表面水分。用解剖刀和鑷子輕輕切開莢果,挑取飽滿且呈綠色的胚珠,接種到不同激素含量的培養(yǎng)基(表1)中。置于(25±2)℃、光照12 h·d-1、光照強(qiáng)度1 500 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后及時(shí)觀察污染和萌發(fā)情況,每15 d更換1次培養(yǎng)基,30 d后統(tǒng)計(jì)不同取材時(shí)間和不同培養(yǎng)基出胚情況,篩選出最適宜的培養(yǎng)基。

表1 胚挽救不同培養(yǎng)基成分Table 1 Components of embryo rescue medium for interspecific hybrid

不同取材時(shí)間。篩選出適宜培養(yǎng)基后,分別于第1次、第2次回交后第11、12、13、14、15、16天,取表面有明顯膨大的角果,按上述相同的消毒方法,挑取飽滿胚珠后,接種至篩選出的最適宜培養(yǎng)基,上述相同條件下培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)不同取材時(shí)間出胚率,選擇最適宜的取材時(shí)間。并且對(duì)第1次回交和第2次回交的出胚率進(jìn)行縱向比較,觀察回交次數(shù)對(duì)雜交親和性的影響。

1.2.3 田間表型觀察

以輪回親本葉用芥菜JC17000為對(duì)照,觀察統(tǒng)計(jì)BC5代植株的生長(zhǎng)勢(shì)、株型、株高、葉片、花蕾等特征特性,隨機(jī)抽取花藥做鏡檢分析。選取100個(gè)單株,在開花期觀察其雄蕊生長(zhǎng)情況,并采用亞歷山大染液顯色法[11]對(duì)花藥進(jìn)行鏡檢,分析植株敗育情況,統(tǒng)計(jì)不育株的數(shù)量,計(jì)算不育株率;同時(shí)對(duì)單株進(jìn)行套袋自交,統(tǒng)計(jì)結(jié)莢率,計(jì)算不育度。不育度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照楊光圣等[12]制定的方法。

1.2.4 細(xì)胞學(xué)形態(tài)鑒定

植株現(xiàn)蕾后,取2～3 mm的花蕾,將完整的雌蕊取出置于0.002 mol·L-18-羥基喹啉中,常溫下暗處理3～4 h,轉(zhuǎn)入新鮮卡諾固定液中固定12 h,轉(zhuǎn)移至1 mol·L-1鹽酸中60 ℃水浴6～8 min使其軟化。取出軟化后的材料,用蒸餾水洗凈并浸泡1 min,置于干凈的載玻片上搗碎,加卡寶品紅染色液染色30 s,用鑷子輕輕敲打蓋玻片使細(xì)胞散開,置于顯微鏡下觀察染色體數(shù)量。

1.2.5 倍性鑒定

取苗期幼嫩的葉片,用ddH2O沖洗干凈,擦干放入滅菌的培養(yǎng)皿中,置于冰上,加入預(yù)冷的裂解液(Galbraith[13],每1 g葉片加1 mL)后,用刀片把葉片切碎,用40 μm的濾網(wǎng)將其過濾到1.5 mL離心管中,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清液,加入1 μL裂解液、5 μL PI染料、2.5 μL RnaseA,混勻,避光孵化30 min后放入流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分析。

1.2.6 不育類型分子鑒定

選擇1個(gè)可育白菜品種CCR21001作為對(duì)照,使用全式金生物公司的試劑盒,提取親本、子代和選取的可育白菜的DNA,經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度,并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。利用蘭梅等[5]、劉嬌嬌[14]設(shè)計(jì)開發(fā)的4對(duì)特異性引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),125 V條件下運(yùn)行30 min后,放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄,對(duì)比分析條帶分布情況。

表2 鑒定蘿卜胞質(zhì)不育的引物信息Table 2 Information of primers for identifying Ogura cytoplasm male sterility

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對(duì)出胚率的影響

2.1.1 培養(yǎng)基對(duì)出胚率的影響

授粉13 d后取材的胚珠在不同成分培養(yǎng)基中出胚率如圖2所示,2次回交過程中,未添加激素的培養(yǎng)基M1出胚率均為0,M4的出胚率均最高,分別達(dá)到26.44%、32.66%,顯著高于其他培養(yǎng)基;接種至M5和M6的胚珠2次回交的出胚率差異不顯著,M2、M7、M8之間出胚率無(wú)顯著差異。綜合上述結(jié)果,2次回交過程中,M4(MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+AC 1 g·L-1)出胚率均為最高,分別為26.44%、32.66%,為最佳培養(yǎng)基。離體胚在培養(yǎng)基中萌發(fā)后生長(zhǎng)良好,接種15 d后胚珠萌發(fā)情況、成活胚珠增殖情況、45 d后成苗情況均如圖3所示。

M1～M8為不同培養(yǎng)基,具體成分見表1。柱上無(wú)相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。M1-M8 were different culture mediums, their components were the same as in Table 1. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖2 不同成分培養(yǎng)基的出胚率Fig.2 Embryogenesis rate of different culture mediums

a,胚珠萌發(fā);b,成活胚增殖分化;c和d為胚挽救幼苗。a, Ovule germination; b, Proliferation and differentiation of survival embryos; c and d, Embryo rescued seedling.圖3 F1×JC17000種間雜種胚挽救情況Fig.3 Embryo rescue situation of interspecific hybrid of F1×JC17000

2.1.2 取材時(shí)間對(duì)出胚率的影響

2次回交過程中,不同時(shí)間取材的胚珠在M4培養(yǎng)基上的成活率均有差異(表3)。其中,授粉后11 d取材,胚還未發(fā)育完整,出胚率較低,第1次回交出胚率僅10.06%,第2次回交出胚率也只有11.07%,說明此時(shí)雌雄配子的受精結(jié)實(shí)能力較差,不適宜離開母體存活。授粉后第13天取材進(jìn)行胚挽救,出胚率最高,第1次回交出胚率達(dá)到26.44%、第2次回交出胚率達(dá)到32.66%,顯著高于其他取材時(shí)間的出胚率。13 d以后取材的胚珠,出胚率逐漸下降,至第16天取材,出胚率分別降至4.73%和5.75%,說明合子胚已逐漸敗育,不適宜再進(jìn)行胚挽救。綜上所述,2次回交過程中,授粉后第13天均為進(jìn)行胚挽救的最佳取材時(shí)間。

表3 不同取材時(shí)間的出胚率Table 3 Embryogenesis rate at different sampling time

對(duì)2次回交的不同培養(yǎng)基和不同取材時(shí)間的出胚率進(jìn)行縱向比較,結(jié)果顯示,同一時(shí)間和同一培養(yǎng)基上,出胚率均為第2次回交略高于第1次回交,證明回交有利于胚的正常發(fā)育,能夠提高A基因組與B基因組的親和性,至第3次回交時(shí),雜種胚已能正常發(fā)育,無(wú)需進(jìn)行人工胚挽救即可得到BC3代種子。

2.2 種間雜交與回交后代的田間表型

2.2.1 植株形態(tài)

對(duì)雜交親本、種間雜種F1和回交后代BC5植株形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):葉用芥菜(圖4-a)的葉片呈倒卵形,葉緣波狀,葉下表面無(wú)刺毛,葉面綠色平滑,葉柄背面蠟粉中等,葉柄基部橫切面半圓形,植株高大;白菜葉片呈卵圓形,葉緣波狀,葉下表面有刺毛,葉面綠色微皺,葉柄背面蠟粉無(wú),葉柄基部橫切面扁平,植株較矮小(圖4-b);雜交種F1保留了母本白菜的大部分性狀,葉片顏色較深且光滑無(wú)缺刻,幼莖和葉背具刺毛(圖4-c);隨著回交世代的增加,葉片逐漸出現(xiàn)裂刻,刺毛消失,至BC5代植株,株型與葉型與輪回親本非常相似,葉色、葉數(shù)也近似于輪回親本(圖4-d),幾乎沒有母本白菜的性狀特征,符合葉用芥菜的選育目標(biāo)。

a,輪回親本芥菜JC17000;b,蘿卜胞質(zhì)不育白菜CCR17001;c,種間雜種F1;d,BC5。a, Recurrent parent mustard JC17000; b, Ogura CMS Chinese cabbage CCR17001; c, Interspecific hybridition F1; d, BC5.圖4 親本與雜交回交后代的植株形態(tài)Fig.4 Plant morphology of parents, hybrid and backcross progeny

2.2.2 種間雜交、回交后代的不育度和不育株率

對(duì)各植株花朵進(jìn)行觀察,并對(duì)完全開放的花朵結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖觀察,結(jié)果如圖5所示。種間雜種F1和回交各世代植株的雄蕊均高度退化,BC5代花藥成片狀卷曲近似花瓣,且鏡檢無(wú)花粉,可染率為0,群體不育株率和單株不育度皆達(dá)到100%。雌蕊發(fā)育正常,柱頭健壯裸露,蜜腺發(fā)達(dá),BC5的雄蕊已退化變異成類似花瓣的結(jié)構(gòu),不會(huì)再產(chǎn)生花粉,是典型的高度不育類型。另外,BC5代植株的花器官明顯變小,花蕾長(zhǎng)、花蕾直徑、花瓣長(zhǎng)、花瓣寬等都小于親本,但雌蕊的大小介于兩親本之間(表4),說明胞質(zhì)不育源的轉(zhuǎn)育會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)效應(yīng),導(dǎo)致花器官形態(tài)大小受到影響。

表4 蘿卜胞質(zhì)不育芥菜與親本花器官結(jié)構(gòu)特征的比較Table 4 Comparison of floral organ structure characteristics between cytoplasmic male sterility of Brassica juncea and its parents cm

a,JC17000的花;b,CCR17001的花;c,BC5的花;d,JC17000花的解剖;e,CCR17001花的解剖;f,BC5花的解刨。標(biāo)尺=1 cm。a, The flower of JC17000; b, The flower of CCR17001; c, The flower of BC5; d, Dissection of JC17000 flower; e, Dissection of CCR17001 flower; f, Dissection of BC5 flower. Scale bar=1 cm.圖5 BC5與輪回親本的花器官形態(tài)比較Fig.5 Comparison of flower morphology between BC5 and recurrent parents

2.3 種間雜交與回交后代的結(jié)實(shí)性

以葉用芥菜作為對(duì)照,對(duì)蘿卜胞質(zhì)不育白菜與其雜交后代、回交后代植株的結(jié)實(shí)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表5。數(shù)據(jù)顯示,種間雜交存在一定程度的親和性障礙,雜交種F1平均單花結(jié)籽數(shù)相對(duì)較低,僅有3.61;BC1、BC2代,由于三倍體形成的雌配子染色體為非整倍體,在減數(shù)分裂時(shí)期發(fā)生紊亂,表現(xiàn)為胚敗育,無(wú)結(jié)籽能力。通過胚挽救獲得的后代植株,從BC3開始恢復(fù)結(jié)籽能力,且隨著回交世代的增加,平均單花結(jié)籽數(shù)逐漸提高,到BC5代結(jié)籽能力接近于輪回親本芥菜JC17000,說明此時(shí)回交后代植株染色體數(shù)量已恢復(fù)正常水平。

表5 親本與雜交及回交后代的結(jié)實(shí)性比較Table 5 Comparison of fruitfulness between parents, cross and backcross generations

2.4 植株的細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 染色體觀察結(jié)果

對(duì)種間雜種和回交雜種有絲分裂過程中雌蕊染色體數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行觀察,結(jié)果表明,蘿卜胞質(zhì)雄性不育白菜與芥菜的雜交種F1雌蕊染色體數(shù)量為28(圖6-c),為親本白菜(AA,2n=20)產(chǎn)生的配子A與芥菜(AABB,2n=36)產(chǎn)生的配子AB染色體數(shù)量之和,與預(yù)期染色體數(shù)量相符,為不育的三倍體植株。經(jīng)過5代回交之后,BC5的雌蕊染色體數(shù)重新恢復(fù)到了36(圖6-d),與葉用芥菜染色體數(shù)量相等,說明芥菜的細(xì)胞核已成功導(dǎo)入到白菜不育細(xì)胞質(zhì)中,結(jié)合植株高度不育的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)判斷,成功創(chuàng)制出了基因型為AABB的蘿卜胞質(zhì)不育芥菜。

a,蘿卜胞質(zhì)不育白菜CCR17001的有絲分裂細(xì)胞,2n=20;b,輪回親本芥菜JC17000的有絲分裂細(xì)胞,2n=36;c,種間雜交后代F1的有絲分裂細(xì)胞,2n=28;d,BC5的有絲分裂細(xì)胞,2n=36。標(biāo)尺=10 μm。a, Mitotic cells of ogura CMS Chinese cabbage CCR17001, 2n=20; b, Mitotic cells of the recurrent parent mustard JC17000, 2n=36; c, Mitotic cells of interspecific hybrid progeny F1, 2n=28; d, Mitotic cells of BC5, 2n=36. Scale bar=10 μm.圖6 親本與雜交及回交后代的染色體觀察Fig.6 Chromosome observation of cross and backcross generations

2.4.2 植株的倍性

以親本雄性不育白菜和葉用芥菜作為參照,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)F1和BC5代植株的倍性,結(jié)果如圖7所示,雄性不育白菜CCR17001的熒光強(qiáng)度高峰位于20左右,葉用芥菜JC17000的熒光強(qiáng)度高峰位于50;雜交種F1的熒光強(qiáng)度高峰位于35,為親本的平均值,為三倍體。經(jīng)過5代回交之后的BC5熒光強(qiáng)度高峰位于50,與輪回親本芥菜的熒光強(qiáng)度高峰位置相同,為四倍體,鑒定結(jié)果與染色體觀察結(jié)果一致。綜合上述鑒定結(jié)果,回交至第5代已經(jīng)完成了回交核替換的目標(biāo),得到的BC5是基因型為AABB的四倍體芥菜。

a,蘿卜胞質(zhì)不育白菜CCR17001;b,輪回親本芥菜JC17000;c,種間雜種F1;d,BC5。a, Ogura CMS Chinese cabbage CCR17001; b, Recurrent parent mustard JC17000; c, Interspecific hybrid progeny F1; d, BC5.圖7 親本與雜交及回交后代流式細(xì)胞圖Fig.7 Flow cytometry of parent, cross and backcross progeny

2.5 蘿卜胞質(zhì)不育的分子鑒定結(jié)果

利用4對(duì)Ogura CMS特異性引物,對(duì)BC5及其親本材料的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖8所示,以可育芥菜和可育白菜的基因組DNA為模板時(shí),均未擴(kuò)增出明顯的條帶,以BC5和蘿卜胞質(zhì)雄不育白菜的基因組DNA為模板時(shí),4對(duì)引物中都能擴(kuò)增出條帶,且BC5出現(xiàn)條帶的位置都與不育白菜的位置一致,其中,引物ogu-1擴(kuò)增的條帶大小在300 bp左右,引物ogu-2擴(kuò)增的條帶大小在1 200 bp左右,引物ogu-3擴(kuò)增的條帶大小在300 bp左右,ogu-4為引物擴(kuò)增的條帶大小在310 bp左右。以上結(jié)果表明,已成功將白菜中的不育源轉(zhuǎn)育到芥菜中,創(chuàng)制出的BC5是蘿卜胞質(zhì)雄性不育材料。結(jié)合形態(tài)學(xué)和倍性鑒定結(jié)果,確定回交所得的BC5為四倍體的雄性不育芥菜。

M,DL2000 marker;1,蘿卜胞質(zhì)不育白菜CCR17001;2,輪回親本芥菜JC17000;3,BC5;4,可育白菜CCR21001。M, DL2000 marker; 1, Ogura CMS Chinese cabbage CCR17001; 2, Recurrent parent mustard JC17000; 3, BC5; 4, Fertile Chinese cabbage CCR21001.圖8 利用Ogura胞質(zhì)雄性不育分子鑒定BC5及其親本材料Fig.8 Ogura cytoplasmic male sterility molecular identification BC5 and its parents

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞質(zhì)雄性不育在十字花科蔬菜新品種選育的研究中被廣泛應(yīng)用,可以挖掘在自然界中天然存在的不育源,如云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院1973年報(bào)道的油用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型歐新A,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)1999年報(bào)道的芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型hau CMS。有學(xué)者利用上述2個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育源和國(guó)外引進(jìn)的雄性不育源,通過遠(yuǎn)緣雜交、體細(xì)胞融合、回交核置換等手段獲得分蘗芥、筍子芥、莖瘤芥3個(gè)變種的雄性不育系[15-18]。本試驗(yàn)以新的Ogura CMS白菜CCR17001為不育源,與葉用芥菜JC17000進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交,并經(jīng)過5代連續(xù)回交,成功將芥菜的B基因組導(dǎo)入到白菜的不育細(xì)胞質(zhì)中,創(chuàng)制出了1個(gè)蘿卜胞質(zhì)雄性不育的芥菜材料。周慶紅等[19]、王丹等[20]研究表明,白菜與芥菜正反雜交親和性有差異,用白菜作母本能獲得有胚的雜交種子,反交時(shí)獲得雜交種比較困難。本實(shí)驗(yàn)以白菜作母本、芥菜作父本,遠(yuǎn)緣雜交后成功獲得了三倍體雜種F1的種子,與前人的研究結(jié)果一致。但該結(jié)果與劉后利[21]的研究結(jié)果有差異,其認(rèn)為以染色體數(shù)目多的芥菜作為母本時(shí),更容易獲得雜交種,產(chǎn)生差異的原因可能與親本的基因型有關(guān)。

李祥升等[22]、柳霖坡[23]研究表明,異源三倍體F1(AAB)在減數(shù)分裂過程中,由于染色體不均等分離,一般育性較低,因此回交后代比雜種一代F1更難獲得,利用胚挽救技術(shù)可以提高三倍體在回交過程中的結(jié)籽率。本試驗(yàn)中的F1(AAB)回交時(shí)B基因組以單價(jià)體的形式存在,影響正常的減數(shù)分裂從而導(dǎo)致胚敗育,無(wú)法產(chǎn)生種子,通過胚挽救技術(shù),成功獲得了BC1、BC2代植株,證明利用胚挽救技術(shù)能夠克服三倍體在回交過程中胚敗育的問題。由于胚挽救技術(shù)過程較為復(fù)雜,成功率受多種因素的影響,而授粉后的取材時(shí)間和培養(yǎng)基的成分是胚挽救成功的關(guān)鍵。扈新民等[24]利用甘藍(lán)與蘿卜進(jìn)行種間雜交,胚挽救研究表明授粉后14 d取材出胚率最高。Harberd[25]通過胚挽救獲得甘藍(lán)×白菜雜種,研究發(fā)現(xiàn)胚齡對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響較大,授粉后過早或過晚取材都會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)的條件更復(fù)雜。本研究中,授粉后13 d取材的出胚率最高,離體胚珠在不同成分的培養(yǎng)基上出胚率也有顯著差異,以M4(MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+AC 1 g·L-1)培養(yǎng)基上的出胚率最高,第1次回交為26.44%,第2次回交為32.66%,這一結(jié)果與呂鳳仙等[26]在菜心和芥藍(lán)種間雜種胚挽救中發(fā)現(xiàn)的最佳培養(yǎng)基成分一致。

本試驗(yàn)利用遠(yuǎn)緣雜交將芥菜的B基因組導(dǎo)入白菜的不育細(xì)胞質(zhì)中,并通過連續(xù)回交法結(jié)合胚挽救技術(shù)完成回交核替換的目標(biāo),創(chuàng)制出了蘿卜胞質(zhì)不育的芥菜材料,經(jīng)形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)鑒定,該不育材料的雄蕊高度退化成片狀卷曲的花瓣,明顯區(qū)別于其他不育類型。陳竹君等[27]在榨菜胞質(zhì)不育系的研究中報(bào)道過這種雄蕊無(wú)花藥類型,發(fā)現(xiàn)這種孢子體敗育型雄蕊的不育度和不育株率均為100%。本試驗(yàn)中形態(tài)學(xué)和花粉育性檢測(cè)表明,所得材料不育性穩(wěn)定,且不育度和不育株均為100%,與其研究結(jié)果一致。試驗(yàn)中,回交至第5代的材料,性狀表現(xiàn)已更接近芥菜,且此時(shí)結(jié)籽能力已接近于正常的輪回親本芥菜,染色體和倍性鑒定結(jié)果也表明,該材料是染色體數(shù)目為36條的異源二倍體(AABB)芥菜。但在對(duì)該材料進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定過程中發(fā)現(xiàn),與輪回親本芥菜相比,該不育材料的大部分花器官都明顯變小。鄒瑞昌[28]在其他雄性胞質(zhì)不育的研究中曾有過類似的報(bào)道,說明種間的不育源轉(zhuǎn)育會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)遺傳產(chǎn)生一定的負(fù)效應(yīng),并提出增加回交的世代數(shù)或選擇合適的父本配組可以減輕甚至克服負(fù)效應(yīng)。

本試驗(yàn)獲得了不育度和不育株率均為100%的芥菜雄性不育材料,為芥菜新品種的選育提供了材料,且利用蘿卜胞質(zhì)不育白菜作為不育源,為芥菜雄性不育材料的選育提供了新思路。但選育得到的不育材料,其雄蕊發(fā)育和退化機(jī)理,以及雜種優(yōu)勢(shì)利用潛力還有待進(jìn)一步研究。