李治國，盛光玉，趙文卿，信璐瑤，井波，王云峰，余復(fù)昌，齊萌

摘 要：為鑒定阿拉爾市散養(yǎng)雞感染的線蟲種類，采用形態(tài)學(xué)觀察和PCR法對阿拉爾市2只林下散養(yǎng)雞盲腸中發(fā)現(xiàn)的43條線蟲進(jìn)行種類鑒定。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，蟲體外觀呈白色短線狀，兩端較細(xì)；雌蟲陰門到尾端距離為4.12～6.35mm；口腔短，食道前部圓柱狀；雄蟲尾端有2根不等長的交合刺，初步鑒定為雞異刺線蟲?；诰€蟲ITS基因位點(diǎn)，對2條蟲體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，經(jīng)序列比對，2條蟲體序列與我國四川省雞源異刺線蟲序列同源性為99.90%，鑒定為雞異刺線蟲。種系發(fā)育分析顯示，本研究所獲雞源異刺線蟲序列與禽源異刺線蟲同處于1個(gè)進(jìn)化支，與其他異刺線蟲屬的線蟲形成不同分支。研究結(jié)果為雞源異刺線蟲的種類鑒定和遺傳進(jìn)化分析提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：異刺線蟲；形態(tài)學(xué)；鑒定；種類；雞

中圖分類號(hào)：S858.312.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2023）05-0008-05

雞異刺線蟲（Heterakis gallinarum）是常見的寄生于雞盲腸內(nèi)的線蟲之一，可引起雞食欲減退，下痢，發(fā)育遲緩，消瘦，產(chǎn)蛋量下降等癥狀[1]。異刺線蟲除引起宿主感染和發(fā)病外，還可作為火雞組織滴蟲（Histomonas meleagridis）的傳播者，導(dǎo)致宿主發(fā)生高死亡率的組織滴蟲病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。雞異刺線蟲病無明顯季節(jié)性，多見于衛(wèi)生條件相對較差的散養(yǎng)雞群。成雞感染異刺線蟲后，通常不表現(xiàn)出臨床癥狀。異刺線蟲一般通過對解剖發(fā)現(xiàn)的蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察來進(jìn)行鑒定。近年來，研究者采用分子生物學(xué)技術(shù)對我國雞源、孔雀源和七彩山雞源異刺線蟲進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)不同禽源異刺線蟲存在一定的遺傳多樣分布特征，其中，四川雞源異刺線蟲種群具有豐富的單倍型多樣性，種群間基因交流頻繁，群體遺傳分化不明顯[2-4]。為進(jìn)一步了解我國不同地區(qū)禽源異刺線蟲的遺傳進(jìn)化多樣性，本調(diào)查通過形態(tài)學(xué)觀察鑒定阿拉爾市散養(yǎng)雞雞源異刺線蟲，并結(jié)合分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行種系發(fā)育分析，以期為該地區(qū)雞源異刺線蟲病的防治提供基礎(chǔ)參考資料。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣本收集

自阿拉爾市某林下肉雞養(yǎng)殖戶購買2只散養(yǎng)雞，解剖后自雞盲腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)蟲體，用生理鹽水漂洗3次，立即投入70℃的70%乙醇固定液中進(jìn)行固定，使蟲體伸展，固定液冷卻后長期保存。

1.2 主要試劑和儀器

組織基因組DNA提取試劑盒（EasyPure Genomic

DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、DL2000 Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；體式顯微鏡（Nikon SMZ18）購自日本Nikon公司；PCR儀EP （Mastercycler nexus）購自德國Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR＋）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 蟲體形態(tài)學(xué)觀察

觀察蟲體外部形態(tài)，使用標(biāo)尺測量蟲體長度。蟲體標(biāo)本經(jīng)乳酸酚溶液透明6 h后，使用光學(xué)顯微鏡對蟲體的唇、食道球、雄蟲的交合刺和雌蟲的生殖道等部位進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，拍攝照片，測量雌蟲陰門到尾端長度，根據(jù)參考資料[5]進(jìn)行蟲種鑒定。

1.4 蟲體基因組DNA提取

將分離獲得的蟲體隨機(jī)挑取2條，置于1.5 mL的離心管中，用手持式組織研磨器研磨后，加入組織裂解液和蛋白酶uK，37℃水浴加熱3 h，按照試劑盒操作步驟提取蟲體DNA，置于-20℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)

參照古小彬等[2]報(bào)道的線蟲ITS序列通用引物序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，下游引物為NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′，引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 ?L：2×EasyTaq Mix（12.5 ?L），上下游引物（各0.3 ?L），蟲體DNA模板（1 ?L），ddH2O（10.9 ?L）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。陽性對照樣本為鴿源蛔蟲DNA，由塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存，陰性對照為雙蒸水。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 ?L擴(kuò)增產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，結(jié)果在凝膠成像儀中進(jìn)行觀察。將陽性PCR產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.7 序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)公司測序所獲的2條序列，雙向序列拼接完成后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行比對分析，根據(jù)序列比對結(jié)果鑒定線蟲種類。以旋毛線蟲（Trichinella spiralis）為外群構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹，下載GenBank中相關(guān)同源參考序列，見表1。使用MGEA7.0軟件，選用鄰接法（Neighbor-Joining， NJ）中的Kimura-2-parameter模型，采用bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行可靠性分析，1 000個(gè)重復(fù)，對本研究所獲線蟲序列進(jìn)行種系發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 蟲體形態(tài)學(xué)鑒定

對2只散養(yǎng)雞進(jìn)行剖檢，在盲腸內(nèi)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)43條線蟲，蟲體外觀呈白色短線狀，兩端較細(xì)，顯微鏡下可見蟲體頭端有3片唇，口腔短，食道前部圓柱狀（圖1A），測量雌蟲體長6.22～12.32 mm，雄蟲體長4.23～8.16 mm；雌蟲陰門到尾端距離為4.12～6.35 mm（圖1B）；雄蟲尾部尖細(xì)，泄殖孔前具有角質(zhì)吸盤，左右交合刺不等長（圖1C）。結(jié)合線蟲的寄生部位和蟲體形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定43條線蟲均為雞異刺線蟲。

2.2 蟲體DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

基于線蟲通用ITS基因位點(diǎn)，2份蟲體DNA樣本均成功擴(kuò)增出1 200 bp左右大小條帶，與目的片段條帶一致，陰性對照樣本未出現(xiàn)條帶擴(kuò)增（圖2）。

2.3 蟲體序列比對和種類鑒定

基于ITS基因位點(diǎn)，2條蟲體均成功雙向測序，序列均一致，與我國四川省雞源異刺線蟲序列（序列登錄號(hào)：KT310153）同源性為99.90%，其在第33核苷酸位置處增加1個(gè)T堿基。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和序列分析，鑒定本次調(diào)查所獲蟲體為雞異刺線蟲。

2.4 所獲雞異刺線蟲的種系發(fā)育分析

根據(jù)構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，本研究所獲雞源異刺線蟲序列與我國、突尼斯、印度雞源、波蘭鵝源和美國草原松雞源異刺線蟲序列同處一個(gè)進(jìn)化支，與孟加拉國雞源異刺線蟲形成小的亞群分支；其他禽源貝拉異刺線蟲、異形異刺線蟲和雉異刺線蟲聚類形成1個(gè)進(jìn)化支，與雞異刺線蟲序列形成2個(gè)群組；鼠源鼠異刺線蟲單獨(dú)聚類形成1個(gè)進(jìn)化支（圖3）。結(jié)果提示不同宿主之間，雞異刺線蟲序列無明顯宿主差異，存在一定的地理隔離差異。

3 討論

雞異刺線蟲常引起禽類群體感染，對養(yǎng)禽業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。郭小玲等[6]報(bào)道確山縣某鄉(xiāng)養(yǎng)殖戶雞群感染異刺線蟲后，采食量減少，羽毛粗糙，下痢，排米黃色、褐色稀糞，雞只陸續(xù)死亡。黃瀟航等[4]報(bào)道福建省某戶庭院飼養(yǎng)的七彩山雞感染異刺線蟲后，表現(xiàn)出精神不振、消瘦、采食量下降和腹瀉等癥狀。鑒定線蟲種類傳統(tǒng)方法是蠕蟲形態(tài)學(xué)觀察，而近年來，分子生物學(xué)方法已普遍應(yīng)用到線蟲種類鑒定中，提高了線蟲種類鑒定的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和蟲體序列分析，鑒定阿拉爾市散養(yǎng)雞感染的線蟲種類為雞異刺線蟲，結(jié)果提示戶外散養(yǎng)雞群應(yīng)給予合理的驅(qū)蟲預(yù)防，根據(jù)飼養(yǎng)場地的實(shí)際情況定期驅(qū)蟲，并加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理。

基于ITS基因序列，呂召宏等[7]調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣州市2條雞源異刺線蟲的序列與澳大利亞雞源異刺線蟲的ITS序列具有較小的種內(nèi)變異，在第170堿基處比澳大利亞雞源異刺線蟲序列增加1個(gè)C堿基。劉路瑤等[3]自合肥市野生動(dòng)物園孔雀盲腸內(nèi)分離出48條異刺線蟲，基于ITS-2基因序列進(jìn)行分析，其與雞異刺線蟲序列同源性較高，鑒定為雞異刺線蟲。古小彬等[2]基于ITS基因序列，對四川省雞源異刺線蟲進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明雞異刺線蟲ITS1基因序列種間變異較ITS2基因序列大，59條序列共檢測出20個(gè)變異位點(diǎn)和14個(gè)單倍型，核苷酸多樣性和單倍型多樣性分別為0.00094和0.532，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性。本研究基于ITS基因序列，所獲雞源異刺線蟲序列與禽源異刺線蟲同處于1個(gè)進(jìn)化支，與其他異刺線蟲屬形成不同分支，不同宿主源異刺線蟲的序列無明顯差異，不同地區(qū)雞異刺線蟲的序列具有堿基替換或缺失，提示雞異刺線蟲存在一定的區(qū)域性遺傳進(jìn)化。

4 結(jié)論

本調(diào)查所獲雞源異刺線蟲存在一定的區(qū)域性遺傳進(jìn)化，研究結(jié)果為雞源異刺線蟲的種類鑒定和遺傳進(jìn)化提供了基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 古小彬，朱俊揚(yáng)，王保健，等.四川地區(qū)雞異刺線蟲核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1/2）序列的遺傳變異分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，47（04）：796-804.

[3] 劉路瑤，楊聰山，章翔，等. 孔雀源異刺線蟲的形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2021，39（06）：816-820.

[4] 黃瀟航，彭佳佳，李詩藝，等.一例七彩山雞異刺線蟲感染的臨床診斷及其分子生物學(xué)鑒定[J].中國動(dòng)物檢疫，2021，38（08）：95-97.

[5] 廖黨金，黃兵.中國畜禽線蟲形態(tài)分類彩色圖譜[M].北京：北京科學(xué)出版社，2016：50-51.

[6] 郭小玲，朱鳳霞，許瑞，等.1例雞異刺線蟲病與組織滴蟲病混合感染的診療與分析[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治，2019（01）：37-38.

[7] 呂召宏，徐廣庭，林瑞慶，等.雞異刺線蟲ITS rDNA的PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2005（08）：41-44.

Morphological Observation and Molecular Identification of Heterakis gallinarum from Free Breeding Chickens in Alar

LI Zhiguo， SHENG Guangyu， ZHAO Wenqing， XIN Luyao， JING Bo， WANG Yunfeng， YU Fuchang， QI Meng

（College of Animal Science and Technology， Tarim University/Engineering Laboratory of Tarim Animal Diseases Diagnosis and Control， Xinjiang Production & Construction Corps， Alar? 843300， China）

Abstract：? ?In order to identify the species of nematode in free breeding chickens in Alar， 43 nematodes were collected from two free breeding chickens and were identified the species used by morphological observation and PCR. Morphological observation showed that the nematode was white， and short linear with thin ends. The distance from vulva to caudal end of the female was 4.12～6.35 mm， with short mouth and anterior esophagus cylindrical. The male had two unequal-length copula spines at the tail end. According to the preliminary results， nematodes were the identified as Heterakis gallinarum. Based on the ITS gene， the DNA of the two nematodes were amplified by PCR and sequenced. The sequences of the two nematodes shared 99.90% homology with the sequences of H. gallinarum isolated from chickens in Sichuan Province， China， and were identified as H. gallinarum. Phylogenetic analysis showed that the sequences of H. gallinarum obtained in this study belonged to the same clade as that of H. gallinarum from avian origin， and formed different branches from other species of Heterakis. These results provide basic information for the species identification and phylogenetic analysis of H. gallinarum in chickens.

Keywords： Heterakis gallinarum; Morphological observation; Identification; Type; Chicken