磷脂酶D 的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)及其轉(zhuǎn)?；呋钚?/h1>
2023-06-07 11:17程青謝志鵬
浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版） 2023年3期
程青，謝志鵬
（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥物生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058）
磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是生物膜磷脂的重要組成成分［1］，可以調(diào)控細(xì)胞膜中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)［2］、平衡情緒［3］、改善記憶力［4］和緩解阿爾茨海默氏病癥狀［5］、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員的恢復(fù)能力［6］。目前，PS 的制備方法主要有化學(xué)提取法和生物酶催化法?；瘜W(xué)提取法成本高、產(chǎn)率低，且動(dòng)物原料存在安全隱患［7］。生物酶催化法，以磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸為原料，以磷脂酶D（phospholipase D，PLD）為催化劑，簡(jiǎn)單高效，反應(yīng)溫和，更適合PS的規(guī)模化生產(chǎn)［8］。
PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 種反應(yīng)：（1）水解反應(yīng)，催化PC 的磷酸二酯鍵水解，生成磷脂酸和膽堿；（2）轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，將PC 的磷脂頭部轉(zhuǎn)移至其他受體醇［9-10］。PLD 廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物的生物膜中［11］。相對(duì)于動(dòng)植物來(lái)源的PLD，微生物來(lái)源的PLD，尤其是鏈霉菌屬（Streptomyces）來(lái)源的PLD，具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)磷脂能力和更廣泛的底物專一性［12］。
野生鏈霉菌表達(dá)PLD 發(fā)酵周期長(zhǎng)且酶活水平低，目前獲得PLD 的常用手段是對(duì)PLD 進(jìn)行分子改造，將其異源表達(dá)到其他工程菌。大腸桿菌具有生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)成本低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是PLD 的主要異源表達(dá)系統(tǒng)，也有研究利用其他宿主菌表達(dá)PLD，如畢赤酵母、變鉛鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等。LIU 等［13］在畢赤酵母表面展示PLD，當(dāng)誘導(dǎo)108 h 時(shí)，轉(zhuǎn)?；盍_(dá)到最大，為315 U·g-1（細(xì)胞干重），但與大腸桿菌表達(dá)PLD 相比，發(fā)酵周期過長(zhǎng)。NAKAZAWA 等［14］通過構(gòu)建大腸桿菌-變鉛鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，在變鉛鏈霉菌中分泌表達(dá)PLD，培養(yǎng)60 h 后酶活高達(dá)30 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸銨沉淀，從培養(yǎng)基上清中分離PLD 蛋白。HUANG 等［15］利用枯草芽孢桿菌WB600 分泌表達(dá)PLD，但需將發(fā)酵液經(jīng)過鎳柱洗脫得到純PLD。HOU 等［16］首次使用谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)PLD，但從培養(yǎng)基上清中獲得的PLD 粗酶液，需使用較為昂貴的腦浸出液培養(yǎng)基。由于PLD 的表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒害作用，在不誘導(dǎo)時(shí)，PLD 的微量滲漏表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞死亡或質(zhì)粒丟失［17］，從而令PLD 產(chǎn)量降低。XIONG 等［18］將大腸桿菌作為PLD 表達(dá)宿主，在質(zhì)粒中加入穩(wěn)定基因，使用嚴(yán)謹(jǐn)型啟動(dòng)子，質(zhì)粒穩(wěn)定性在傳代5 次后仍為100%，5 L 發(fā)酵罐中的酶活達(dá)120 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸鹽沉淀、鎳柱洗脫等復(fù)雜純化過程。ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ADIA-I，在大腸桿菌表面展示PLD，雖然避免了PLD 的純化，但誘導(dǎo)48 h后，酶活僅為0.074 U·mL-1。目前，已有的PLD 表達(dá)方式存在細(xì)胞發(fā)酵周期長(zhǎng)、分離純化步驟煩瑣、培養(yǎng)成本較高等問題。
本研究旨在通過系統(tǒng)性地對(duì)比研究大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和表面展示3 種方式對(duì)PLD 酶活及其PS 催化合成效率的影響，探索全細(xì)胞催化制備PS 的可行性及最適方式，以期大幅縮短PLD 高效活性表達(dá)所需的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，優(yōu)化操作煩瑣、耗時(shí)、成本高昂的PLD 分離純化工序。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 株
大腸桿菌表達(dá)宿主Escherichia coli BL21（DE3）和克隆宿主Escherichia coli DH5α 菌株均為實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2 主要酶與試劑
膽堿氧化酶購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，辣根過氧化物酶購(gòu)于上海生工公司，磷脂酰膽堿（98%）、磷脂酰絲氨酸（99%）購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司，L-絲氨酸（99%）購(gòu)于上海麥克林生化科技公司。
1.2 方 法
1.2.1 重組菌株的構(gòu)建
構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和表面展示3 種方式的PLD 表達(dá)重組菌株，見表1。
表1 表達(dá)PLD 的菌株Table 1 The strains for expression of PLD
胞內(nèi)表達(dá)菌株BL-PLD?；诖竽c桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化Streptomyces halstedii 來(lái)源的pld 基因（AB062136.1），由擎科生物公司合成，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株而得。
采用限制性內(nèi)切酶Hind III 和BamH I 對(duì)合成的pET28a（+）-PLD 載體和pET22b（+）空載體進(jìn)行雙酶切，連接后得到重組質(zhì)粒pET22b（+）-PLDp。以pET22b（+）-PLDp 為模板，將pelB 信號(hào)肽分別替換為FhuD、OmpA、DsbA 信號(hào)肽，得到分泌表達(dá)載體pET22b（+）-PLDo、pET22b（+）-PLDd、pET22b（+）-PLDf，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株，得到分泌表達(dá)菌株P(guān)LD-PelB、PLD-OmpA、PLDDsbA、PLD-FhuD。所用信號(hào)肽及其序列如表2所示。
表2 分泌表達(dá)載體及其信號(hào)肽Table 2 Secreted expression vectors and their signal peptides
表面展示菌株P(guān)LD-EhaA。N 端CtxB 信號(hào)肽序列、EhaA 自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白連接子區(qū)域、β 折疊區(qū)域由擎科生物公司合成，插入pET28a（+）-PLD 載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）進(jìn)行蛋白表達(dá)。
1.2.2 水解酶活檢測(cè)
由于PLD 的轉(zhuǎn)?；富顧z測(cè)方法煩瑣、耗時(shí)，而PLD 的水解酶活與轉(zhuǎn)?；富畲嬖谡嚓P(guān)性［20］，且水解酶活檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速，故在進(jìn)行條件優(yōu)化時(shí)用水解酶活表征轉(zhuǎn)?；富?。采用酶連比色法［21］，通過檢測(cè)膽堿的物質(zhì)的量測(cè)定水解酶活。PLD 的一個(gè)水解酶活單位（U）定義為每分鐘催化底物PC 水解產(chǎn)生1 μmol 膽堿所需的酶量。
分別取胞內(nèi)表達(dá)菌株和分泌表達(dá)菌株的發(fā)酵液1 mL，離心后，用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重懸菌體，超聲破碎，得到PLD 粗酶液。稀釋一定倍數(shù)后，取100 μL 進(jìn)行水解酶活檢測(cè)。取表面展示菌株發(fā)酵液1 mL，離心后用緩沖液重懸稀釋菌體，取100 μL 細(xì)胞懸液檢測(cè)酶活。
1.2.3 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
在水-乙酸乙酯兩相體系中，分別以全細(xì)胞和來(lái)源于胞內(nèi)表達(dá)菌株、分泌表達(dá)菌株的粗酶液為催化劑，催化PC 和L-絲氨酸合成PS［22］。兩相反應(yīng)體系混合液包括3 mL 含10 mg·mL-1PC 的乙酸乙酯溶液、1 mL 含90 mg·mL-1L-絲氨酸和15 mmol·L-1CaCl2的乙酸鈉緩沖液（100 mmol·L-1，pH 5.5）、0.5 mL 粗酶液或全細(xì)胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h，加入4.5 mL Floch 溶液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），離心后取有機(jī)相，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定磷脂。
在純水相體系中，在LIU 等［13］方法的基礎(chǔ)上略做了修改。純水相反應(yīng)體系混合液包括1 mL 含10 mmol·L-1PC 的5% Triton X-100 溶液、1 mL 含40 mmol·L-1L-絲氨酸的100 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）、150 μL 含10 mmol·L-1CaCl2水溶液及1 mL 粗酶液或全細(xì)胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h。采用HPLC 法測(cè)定磷脂。
1.2.4 高效液相色譜檢測(cè)
采用配備紫外檢測(cè)器的安捷倫1260 高效液相色譜儀，選用安捷倫ZORBAX Rx-SIL 硅膠色譜柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），以乙腈、甲醇、85% 磷酸混合液（V∶V∶V=100∶10∶0.8）為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。
1.2.5 掃描電鏡制樣及觀察
（1）固定：將細(xì)菌樣品懸浮于0.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定過夜。倒掉固定液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。再用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。
（2）脫水：依次用體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min。最后用無(wú)水乙醇脫水處理20 min，并將細(xì)胞樣品保存于無(wú)水乙醇中。
（3）干燥：在Hitachi HCP-2 型臨界點(diǎn)干燥儀中干燥。
（4）觀察：鍍膜，將處理好的樣品置于Hitachi SU-8010 型掃描電鏡中觀察。
1.2.6 重組PLD 的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化
LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1。將重組菌BL-PLD 接種至50 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r·min-1搖床過夜培養(yǎng)，得種子液。
MTB（Modified Terrific Broth）培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g·L-1，酵母提取物24 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，K2HPO472 mmol·L-1，KH2PO472 mmol·L-1。將1%種子液接種至150 mL MTB 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至菌濃（發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度）為0.4～0.6，添加IPTG 至濃度為0.1 mmol·L-1，于25 ℃、220 r·min-1繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
采用單因素法，分別探究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)的OD600、IPTG 濃度、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)等對(duì)PLD 表達(dá)量的影響。
2 結(jié)果與討論
2.1 重組菌株
2.1.1 胞內(nèi)表達(dá)菌株
經(jīng)過優(yōu)化，胞內(nèi)表達(dá)菌株的密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）從0.71 提升至0.96，DNA 序列中鳴嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的堿基對(duì)的占比（GC 含量）從71%降至52%。
2.1.2 分泌表達(dá)菌株
信號(hào)肽是用于指導(dǎo)目的蛋白跨膜轉(zhuǎn)移或定位的氨基酸序列。通過將適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列融合至靶蛋白基因的N 端，如大腸桿菌宿主，令異源蛋白分泌至周質(zhì)空間，從而增強(qiáng)其溶解度并避免形成包涵體。不同信號(hào)肽分泌蛋白的途徑不同，參照文獻(xiàn)［23］，選擇PelB、OmpA、FhuD 和DsbA 4 種信號(hào)肽，研究不同信號(hào)肽對(duì)PLD 分泌表達(dá)的差異。
2.1.3 表面展示菌株
ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AIDA-I 將PLD成功展示在大腸桿菌細(xì)胞表面［19］，說明將大腸桿菌作為PLD 展示菌株是可行的，但誘導(dǎo)48 h 后酶活僅為0.074 U·mL-1，可能是因?yàn)樽赞D(zhuǎn)運(yùn)蛋白AIDA-I的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低。另外，TOZAKIDIS 等［24］借助自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA 成功將酯酶展示在大腸桿菌細(xì)胞表面，且獲得較高的酶活，故選擇自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA 在大腸桿菌表面進(jìn)行展示。
EhaA 是來(lái)自大腸桿菌O157：H7 EDL933 基因組的一種自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與PLD 融合的自轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，包括三部分：（1）N 端的CtxB信號(hào)肽［25］；（2）C 末端的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA，包含連接子和β-折疊區(qū)域［26］；（3）PLD 作為“乘客”蛋白，位于N 端與C 端之間。PLD 轉(zhuǎn)運(yùn)過程如圖1（b）所示，CtxB 信號(hào)肽通過Sec 引導(dǎo)PLD 蛋白穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)［27］至周質(zhì)空間，同時(shí)信號(hào)肽被裂解。通過形成孔狀結(jié)構(gòu)，將β-折疊結(jié)構(gòu)域整合至細(xì)胞外膜，而連接子結(jié)構(gòu)域穿過β-折疊結(jié)構(gòu)域并充當(dāng)連接結(jié)構(gòu)，以允許PLD 蛋白暴露在細(xì)胞外部。
圖1 EhaA 自轉(zhuǎn)運(yùn)載體示意Fig.1 Schematic of EhaA autotransporter
2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
圖2 展示了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)的OD600、誘導(dǎo)物濃度對(duì)大腸桿菌表達(dá)PLD 的影響。
圖2 PLD 發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the fermentation conditions
首先，在16～32 ℃條件下誘導(dǎo)PLD 表達(dá)，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)PLD 的水解酶活。圖2（a）表明，在20 ℃時(shí)，PLD 水解酶活最高。隨著溫度上升，酶活急劇下降，說明PLD 更傾向于較低溫度的誘導(dǎo)表達(dá)，溫度對(duì)PLD 的誘導(dǎo)表達(dá)較為關(guān)鍵。
其次，為探究誘導(dǎo)時(shí)的最佳細(xì)胞量，分別在OD600為0.4～1 時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。圖2（b）表明，當(dāng)OD600=0.7時(shí)，PLD 水解酶活最高。若過早誘導(dǎo)PLD 表達(dá)，則不利于菌體生長(zhǎng)，PLD 最終表達(dá)量較低，說明在誘導(dǎo)PLD 表達(dá)前需積累足夠多的細(xì)胞量。當(dāng)OD600＞0.7 時(shí)，隨著OD600的增加，酶活反而降低，這可能是由于菌體生長(zhǎng)已經(jīng)偏離了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體活力下降，導(dǎo)致PLD 表達(dá)量下降。
最后，為探究PLD 表達(dá)的最佳IPTG 濃度，設(shè)置IPTG 濃度為0.05～1.50 mmol·L-1。圖2（c）表明，0.3 mmol·L-1的IPTG 可獲得最佳PLD 酶活。當(dāng)IPTG 濃度超過0.4 mmol·L-1時(shí)，隨著濃度的升高，酶活反而降低，這可能是由于濃度過高導(dǎo)致PLD 形成沒有活性的包涵體，且過高濃度的IPTG 對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從而降低酶活。
2.3 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活的影響
圖3 展示了不同PLD 表達(dá)菌株的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)與PLD 水解酶活的關(guān)系。隨著誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的增加，PLD 水解酶活不斷升高。當(dāng)誘導(dǎo)達(dá)8 h 時(shí)，胞內(nèi)表達(dá)菌株BL-PLD 的水解酶活最高，為0.35 U·mL-1；分泌表達(dá)菌株中的PLD-PelB 水解酶活次之，為0.23 U·mL-1；表面展示菌株P(guān)LD-EhaA 的水解酶活較低，為0.11 U·mL-1。這可能是由于胞內(nèi)表達(dá)菌株和分泌表達(dá)菌株的細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，粗酶液中的PLD與底物PC 的接觸更加充分，故在檢測(cè)酶活的較短時(shí)間內(nèi)，其水解酶活較全細(xì)胞的PLD-EhaA 更高。
圖3 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)PLD 水解酶活的影響Fig.3 Effect of induction time on PLD hydrolysis activity
在分泌表達(dá)菌株中，PLD-PelB的水解酶活最高；其次是PLD-FhuD，其酶活為0.17 U·mL-1；PLDOmpA 和PLD-DsbA 的酶活均在0.10 U·mL-1左右。所以，選擇PelB信號(hào)肽做進(jìn)一步研究。
總之，在PLD 的N 端連接信號(hào)肽后，其酶活反而比未連接信號(hào)肽的菌株更低。這與MISHIMA等［28］的研究結(jié)果類似，由于PLD 蛋白被信號(hào)肽轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間后不斷積累，可能對(duì)宿主細(xì)胞有害，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定甚至丟失，從而降低酶活。
收集誘導(dǎo)表達(dá)PLD 8 h 的大腸桿菌細(xì)胞，用掃描電鏡觀察3 種方式下大腸桿菌細(xì)胞的形態(tài)變化，如圖4 所示。無(wú)質(zhì)粒的對(duì)照菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈短桿狀，兩端鈍圓形，如圖4（a）所示。在3 種表達(dá)方式下大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)均受到一定程度的破壞，如出現(xiàn)不同程度的變形、斷裂、塌陷等，有的細(xì)胞表面形成孔洞，有的細(xì)胞裂解出內(nèi)容物，如圖4（b）～（d）所示。其中，分泌表達(dá)菌株P(guān)LD-PelB 的細(xì)胞變形塌陷情況最為嚴(yán)重。與對(duì)照菌株相比，分泌表達(dá)菌株和胞內(nèi)表達(dá)菌株的細(xì)胞表面更光滑。此外，表達(dá)PLD 蛋白之后的細(xì)胞更長(zhǎng)，這可能是由于PLD 會(huì)影響細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖［29］。
圖4 大腸桿菌的掃描電鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron microscope images of E.coli.
綜上，誘導(dǎo)PLD 表達(dá)的最佳條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)8 h。
2.4 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
2.4.1 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酶促合成PS 產(chǎn)率的影響
菌株BL-PLD 誘導(dǎo)8 h 后，以1 mL 發(fā)酵液破碎后的粗酶液為催化劑，在40 ℃下反應(yīng)12 h 制備PS。比較了純水相和兩相體系的PS 產(chǎn)率，如圖5（a）所示。在純水相體系中，PS 產(chǎn)率僅為13.71%，是兩相體系中PS 產(chǎn)率的40%。這是因?yàn)樵赑LD 與底物PC 反應(yīng)過程中，存在生成磷脂酸的副反應(yīng)，而純水相體系會(huì)促進(jìn)磷脂酸的生成［30］，導(dǎo)致PS 產(chǎn)率下降。故選擇用兩相體系制備PS。
圖5 PS 產(chǎn)率液相檢測(cè)結(jié)果Fig.5 HPLC analysis of PS yield
2.4.2 不同PLD 表達(dá)方式對(duì)PS 產(chǎn)率的影響
為進(jìn)一步獲取PLD-EhaA、PLD-PelB 和BLPLD 3 種菌株的PS 產(chǎn)率，在誘導(dǎo)8 h 后離心收集菌體，按1 g 細(xì)胞加15 mL 緩沖液的比例，分別添加對(duì)應(yīng)體積的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，重懸菌體，取1 mL 細(xì)胞懸液催化PC；另取1 mL 超聲破碎粗酶液催化PC，結(jié)果如圖5（b）所示。可知，無(wú)論是使用粗酶液還是全細(xì)胞催化PC，PLD-EhaA 的PS 產(chǎn)率均較高，其中全細(xì)胞催化的PS 產(chǎn)率可達(dá)59.1%；PLDPelB 和BL-PLD 的PS 產(chǎn)率均在30%左右。
對(duì)于PLD-PelB 和BL-PLD 菌株，細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，PLD 粗酶液與底物PC 接觸更加充分，反應(yīng)效率更高，故粗酶液催化的PS 產(chǎn)率比全細(xì)胞催化高。在兩相體系反應(yīng)前期，可能粗酶液催化底物PC產(chǎn)生PS 的速率較快，但在反應(yīng)后期，有機(jī)溶劑影響了酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響PLD 酶活［31］。故反應(yīng)12 h后，粗酶液催化與全細(xì)胞催化PS 產(chǎn)率相差不大。
對(duì)于PLD-EhaA 菌株，大腸桿菌細(xì)胞通過EhaA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將PLD 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外膜。全細(xì)胞催化PC 能避免有機(jī)溶劑與酶液直接接觸，從而保持PLD 酶活。故PLD-EhaA 菌株全細(xì)胞催化PC的PS 產(chǎn)率較細(xì)胞破碎粗酶液催化的高。
在大腸桿菌細(xì)胞表面展示PLD 的優(yōu)勢(shì)在于，大腸桿菌產(chǎn)生的酶被連接并固定在細(xì)胞表面，避免了費(fèi)時(shí)費(fèi)力且昂貴的酶分離純化步驟［32］，且底物或產(chǎn)物均不需穿過細(xì)胞膜屏障［33］，大大降低了傳質(zhì)阻力。此外，PLD 表面展示方式還可用于PLD 固化，更適合規(guī)?；苽銹S?？傊?，PLD 表面展示是降低生物催化轉(zhuǎn)化過程成本的一種非常有效的方法。
3 結(jié)論
利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，研究了胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和表面展示3 種方式對(duì)PLD 酶活及其磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）催化合成效率的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)PLD 的最佳誘導(dǎo)條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1。在最適條件下，3 種方式的PLD 水解酶活均在誘導(dǎo)表達(dá)8 h 時(shí)達(dá)最高值，分別為0.35，0.23，0.11 U·mL-1。進(jìn)一步比較了胞內(nèi)表達(dá)菌株、分泌表達(dá)菌株以及表面展示菌株的PS 產(chǎn)率，結(jié)果表明，在水-乙酸乙酯兩相體系中，PLD 表面展示菌株的PS 產(chǎn)率最高，為59.1%。采用自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA 對(duì)PLD 進(jìn)行表面展示，用全細(xì)胞催化底物，后期不需要對(duì)蛋白進(jìn)行分離純化，大大降低了底物或產(chǎn)物穿過細(xì)胞膜屏障的傳質(zhì)阻力。研究對(duì)工業(yè)化利用大腸桿菌生產(chǎn)PS 具有一定的指導(dǎo)意義。
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程青，謝志鵬
（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥物生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058）
磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是生物膜磷脂的重要組成成分［1］，可以調(diào)控細(xì)胞膜中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)［2］、平衡情緒［3］、改善記憶力［4］和緩解阿爾茨海默氏病癥狀［5］、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員的恢復(fù)能力［6］。目前，PS 的制備方法主要有化學(xué)提取法和生物酶催化法?；瘜W(xué)提取法成本高、產(chǎn)率低，且動(dòng)物原料存在安全隱患［7］。生物酶催化法，以磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸為原料，以磷脂酶D（phospholipase D，PLD）為催化劑，簡(jiǎn)單高效，反應(yīng)溫和，更適合PS的規(guī)模化生產(chǎn)［8］。
PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 種反應(yīng)：（1）水解反應(yīng)，催化PC 的磷酸二酯鍵水解，生成磷脂酸和膽堿；（2）轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，將PC 的磷脂頭部轉(zhuǎn)移至其他受體醇［9-10］。PLD 廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物的生物膜中［11］。相對(duì)于動(dòng)植物來(lái)源的PLD，微生物來(lái)源的PLD，尤其是鏈霉菌屬（Streptomyces）來(lái)源的PLD，具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)磷脂能力和更廣泛的底物專一性［12］。
野生鏈霉菌表達(dá)PLD 發(fā)酵周期長(zhǎng)且酶活水平低，目前獲得PLD 的常用手段是對(duì)PLD 進(jìn)行分子改造，將其異源表達(dá)到其他工程菌。大腸桿菌具有生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)成本低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是PLD 的主要異源表達(dá)系統(tǒng)，也有研究利用其他宿主菌表達(dá)PLD，如畢赤酵母、變鉛鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等。LIU 等［13］在畢赤酵母表面展示PLD，當(dāng)誘導(dǎo)108 h 時(shí)，轉(zhuǎn)?；盍_(dá)到最大，為315 U·g-1（細(xì)胞干重），但與大腸桿菌表達(dá)PLD 相比，發(fā)酵周期過長(zhǎng)。NAKAZAWA 等［14］通過構(gòu)建大腸桿菌-變鉛鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，在變鉛鏈霉菌中分泌表達(dá)PLD，培養(yǎng)60 h 后酶活高達(dá)30 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸銨沉淀，從培養(yǎng)基上清中分離PLD 蛋白。HUANG 等［15］利用枯草芽孢桿菌WB600 分泌表達(dá)PLD，但需將發(fā)酵液經(jīng)過鎳柱洗脫得到純PLD。HOU 等［16］首次使用谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)PLD，但從培養(yǎng)基上清中獲得的PLD 粗酶液，需使用較為昂貴的腦浸出液培養(yǎng)基。由于PLD 的表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒害作用，在不誘導(dǎo)時(shí)，PLD 的微量滲漏表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞死亡或質(zhì)粒丟失［17］，從而令PLD 產(chǎn)量降低。XIONG 等［18］將大腸桿菌作為PLD 表達(dá)宿主，在質(zhì)粒中加入穩(wěn)定基因，使用嚴(yán)謹(jǐn)型啟動(dòng)子，質(zhì)粒穩(wěn)定性在傳代5 次后仍為100%，5 L 發(fā)酵罐中的酶活達(dá)120 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸鹽沉淀、鎳柱洗脫等復(fù)雜純化過程。ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ADIA-I，在大腸桿菌表面展示PLD，雖然避免了PLD 的純化，但誘導(dǎo)48 h后，酶活僅為0.074 U·mL-1。目前，已有的PLD 表達(dá)方式存在細(xì)胞發(fā)酵周期長(zhǎng)、分離純化步驟煩瑣、培養(yǎng)成本較高等問題。
本研究旨在通過系統(tǒng)性地對(duì)比研究大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和表面展示3 種方式對(duì)PLD 酶活及其PS 催化合成效率的影響，探索全細(xì)胞催化制備PS 的可行性及最適方式，以期大幅縮短PLD 高效活性表達(dá)所需的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，優(yōu)化操作煩瑣、耗時(shí)、成本高昂的PLD 分離純化工序。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 株
大腸桿菌表達(dá)宿主Escherichia coli BL21（DE3）和克隆宿主Escherichia coli DH5α 菌株均為實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2 主要酶與試劑
膽堿氧化酶購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，辣根過氧化物酶購(gòu)于上海生工公司，磷脂酰膽堿（98%）、磷脂酰絲氨酸（99%）購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司，L-絲氨酸（99%）購(gòu)于上海麥克林生化科技公司。
1.2 方 法
1.2.1 重組菌株的構(gòu)建
構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和表面展示3 種方式的PLD 表達(dá)重組菌株，見表1。
表1 表達(dá)PLD 的菌株Table 1 The strains for expression of PLD
胞內(nèi)表達(dá)菌株BL-PLD?；诖竽c桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化Streptomyces halstedii 來(lái)源的pld 基因（AB062136.1），由擎科生物公司合成，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株而得。
采用限制性內(nèi)切酶Hind III 和BamH I 對(duì)合成的pET28a（+）-PLD 載體和pET22b（+）空載體進(jìn)行雙酶切，連接后得到重組質(zhì)粒pET22b（+）-PLDp。以pET22b（+）-PLDp 為模板，將pelB 信號(hào)肽分別替換為FhuD、OmpA、DsbA 信號(hào)肽，得到分泌表達(dá)載體pET22b（+）-PLDo、pET22b（+）-PLDd、pET22b（+）-PLDf，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株，得到分泌表達(dá)菌株P(guān)LD-PelB、PLD-OmpA、PLDDsbA、PLD-FhuD。所用信號(hào)肽及其序列如表2所示。
表2 分泌表達(dá)載體及其信號(hào)肽Table 2 Secreted expression vectors and their signal peptides
表面展示菌株P(guān)LD-EhaA。N 端CtxB 信號(hào)肽序列、EhaA 自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白連接子區(qū)域、β 折疊區(qū)域由擎科生物公司合成，插入pET28a（+）-PLD 載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）進(jìn)行蛋白表達(dá)。
1.2.2 水解酶活檢測(cè)
由于PLD 的轉(zhuǎn)?；富顧z測(cè)方法煩瑣、耗時(shí)，而PLD 的水解酶活與轉(zhuǎn)?；富畲嬖谡嚓P(guān)性［20］，且水解酶活檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速，故在進(jìn)行條件優(yōu)化時(shí)用水解酶活表征轉(zhuǎn)?；富?。采用酶連比色法［21］，通過檢測(cè)膽堿的物質(zhì)的量測(cè)定水解酶活。PLD 的一個(gè)水解酶活單位（U）定義為每分鐘催化底物PC 水解產(chǎn)生1 μmol 膽堿所需的酶量。
分別取胞內(nèi)表達(dá)菌株和分泌表達(dá)菌株的發(fā)酵液1 mL，離心后，用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重懸菌體，超聲破碎，得到PLD 粗酶液。稀釋一定倍數(shù)后，取100 μL 進(jìn)行水解酶活檢測(cè)。取表面展示菌株發(fā)酵液1 mL，離心后用緩沖液重懸稀釋菌體，取100 μL 細(xì)胞懸液檢測(cè)酶活。
1.2.3 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
在水-乙酸乙酯兩相體系中，分別以全細(xì)胞和來(lái)源于胞內(nèi)表達(dá)菌株、分泌表達(dá)菌株的粗酶液為催化劑，催化PC 和L-絲氨酸合成PS［22］。兩相反應(yīng)體系混合液包括3 mL 含10 mg·mL-1PC 的乙酸乙酯溶液、1 mL 含90 mg·mL-1L-絲氨酸和15 mmol·L-1CaCl2的乙酸鈉緩沖液（100 mmol·L-1，pH 5.5）、0.5 mL 粗酶液或全細(xì)胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h，加入4.5 mL Floch 溶液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），離心后取有機(jī)相，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定磷脂。
在純水相體系中，在LIU 等［13］方法的基礎(chǔ)上略做了修改。純水相反應(yīng)體系混合液包括1 mL 含10 mmol·L-1PC 的5% Triton X-100 溶液、1 mL 含40 mmol·L-1L-絲氨酸的100 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）、150 μL 含10 mmol·L-1CaCl2水溶液及1 mL 粗酶液或全細(xì)胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h。采用HPLC 法測(cè)定磷脂。
1.2.4 高效液相色譜檢測(cè)
采用配備紫外檢測(cè)器的安捷倫1260 高效液相色譜儀，選用安捷倫ZORBAX Rx-SIL 硅膠色譜柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），以乙腈、甲醇、85% 磷酸混合液（V∶V∶V=100∶10∶0.8）為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。
1.2.5 掃描電鏡制樣及觀察
（1）固定：將細(xì)菌樣品懸浮于0.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定過夜。倒掉固定液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。再用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。
（2）脫水：依次用體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min。最后用無(wú)水乙醇脫水處理20 min，并將細(xì)胞樣品保存于無(wú)水乙醇中。
（3）干燥：在Hitachi HCP-2 型臨界點(diǎn)干燥儀中干燥。
（4）觀察：鍍膜，將處理好的樣品置于Hitachi SU-8010 型掃描電鏡中觀察。
1.2.6 重組PLD 的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化
LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1。將重組菌BL-PLD 接種至50 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r·min-1搖床過夜培養(yǎng)，得種子液。
MTB（Modified Terrific Broth）培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g·L-1，酵母提取物24 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，K2HPO472 mmol·L-1，KH2PO472 mmol·L-1。將1%種子液接種至150 mL MTB 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至菌濃（發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度）為0.4～0.6，添加IPTG 至濃度為0.1 mmol·L-1，于25 ℃、220 r·min-1繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
采用單因素法，分別探究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)的OD600、IPTG 濃度、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)等對(duì)PLD 表達(dá)量的影響。
2 結(jié)果與討論
2.1 重組菌株
2.1.1 胞內(nèi)表達(dá)菌株
經(jīng)過優(yōu)化，胞內(nèi)表達(dá)菌株的密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）從0.71 提升至0.96，DNA 序列中鳴嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的堿基對(duì)的占比（GC 含量）從71%降至52%。
2.1.2 分泌表達(dá)菌株
信號(hào)肽是用于指導(dǎo)目的蛋白跨膜轉(zhuǎn)移或定位的氨基酸序列。通過將適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列融合至靶蛋白基因的N 端，如大腸桿菌宿主，令異源蛋白分泌至周質(zhì)空間，從而增強(qiáng)其溶解度并避免形成包涵體。不同信號(hào)肽分泌蛋白的途徑不同，參照文獻(xiàn)［23］，選擇PelB、OmpA、FhuD 和DsbA 4 種信號(hào)肽，研究不同信號(hào)肽對(duì)PLD 分泌表達(dá)的差異。
2.1.3 表面展示菌株
ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AIDA-I 將PLD成功展示在大腸桿菌細(xì)胞表面［19］，說明將大腸桿菌作為PLD 展示菌株是可行的，但誘導(dǎo)48 h 后酶活僅為0.074 U·mL-1，可能是因?yàn)樽赞D(zhuǎn)運(yùn)蛋白AIDA-I的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低。另外，TOZAKIDIS 等［24］借助自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA 成功將酯酶展示在大腸桿菌細(xì)胞表面，且獲得較高的酶活，故選擇自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA 在大腸桿菌表面進(jìn)行展示。
EhaA 是來(lái)自大腸桿菌O157：H7 EDL933 基因組的一種自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與PLD 融合的自轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，包括三部分：（1）N 端的CtxB信號(hào)肽［25］；（2）C 末端的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA，包含連接子和β-折疊區(qū)域［26］；（3）PLD 作為“乘客”蛋白，位于N 端與C 端之間。PLD 轉(zhuǎn)運(yùn)過程如圖1（b）所示，CtxB 信號(hào)肽通過Sec 引導(dǎo)PLD 蛋白穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)［27］至周質(zhì)空間，同時(shí)信號(hào)肽被裂解。通過形成孔狀結(jié)構(gòu)，將β-折疊結(jié)構(gòu)域整合至細(xì)胞外膜，而連接子結(jié)構(gòu)域穿過β-折疊結(jié)構(gòu)域并充當(dāng)連接結(jié)構(gòu)，以允許PLD 蛋白暴露在細(xì)胞外部。
圖1 EhaA 自轉(zhuǎn)運(yùn)載體示意Fig.1 Schematic of EhaA autotransporter
2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
圖2 展示了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)的OD600、誘導(dǎo)物濃度對(duì)大腸桿菌表達(dá)PLD 的影響。
圖2 PLD 發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the fermentation conditions
首先，在16～32 ℃條件下誘導(dǎo)PLD 表達(dá)，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)PLD 的水解酶活。圖2（a）表明，在20 ℃時(shí)，PLD 水解酶活最高。隨著溫度上升，酶活急劇下降，說明PLD 更傾向于較低溫度的誘導(dǎo)表達(dá)，溫度對(duì)PLD 的誘導(dǎo)表達(dá)較為關(guān)鍵。
其次，為探究誘導(dǎo)時(shí)的最佳細(xì)胞量，分別在OD600為0.4～1 時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。圖2（b）表明，當(dāng)OD600=0.7時(shí)，PLD 水解酶活最高。若過早誘導(dǎo)PLD 表達(dá)，則不利于菌體生長(zhǎng)，PLD 最終表達(dá)量較低，說明在誘導(dǎo)PLD 表達(dá)前需積累足夠多的細(xì)胞量。當(dāng)OD600＞0.7 時(shí)，隨著OD600的增加，酶活反而降低，這可能是由于菌體生長(zhǎng)已經(jīng)偏離了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體活力下降，導(dǎo)致PLD 表達(dá)量下降。
最后，為探究PLD 表達(dá)的最佳IPTG 濃度，設(shè)置IPTG 濃度為0.05～1.50 mmol·L-1。圖2（c）表明，0.3 mmol·L-1的IPTG 可獲得最佳PLD 酶活。當(dāng)IPTG 濃度超過0.4 mmol·L-1時(shí)，隨著濃度的升高，酶活反而降低，這可能是由于濃度過高導(dǎo)致PLD 形成沒有活性的包涵體，且過高濃度的IPTG 對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從而降低酶活。
2.3 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活的影響
圖3 展示了不同PLD 表達(dá)菌株的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)與PLD 水解酶活的關(guān)系。隨著誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的增加，PLD 水解酶活不斷升高。當(dāng)誘導(dǎo)達(dá)8 h 時(shí)，胞內(nèi)表達(dá)菌株BL-PLD 的水解酶活最高，為0.35 U·mL-1；分泌表達(dá)菌株中的PLD-PelB 水解酶活次之，為0.23 U·mL-1；表面展示菌株P(guān)LD-EhaA 的水解酶活較低，為0.11 U·mL-1。這可能是由于胞內(nèi)表達(dá)菌株和分泌表達(dá)菌株的細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，粗酶液中的PLD與底物PC 的接觸更加充分，故在檢測(cè)酶活的較短時(shí)間內(nèi)，其水解酶活較全細(xì)胞的PLD-EhaA 更高。
圖3 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)PLD 水解酶活的影響Fig.3 Effect of induction time on PLD hydrolysis activity
在分泌表達(dá)菌株中，PLD-PelB的水解酶活最高；其次是PLD-FhuD，其酶活為0.17 U·mL-1；PLDOmpA 和PLD-DsbA 的酶活均在0.10 U·mL-1左右。所以，選擇PelB信號(hào)肽做進(jìn)一步研究。
總之，在PLD 的N 端連接信號(hào)肽后，其酶活反而比未連接信號(hào)肽的菌株更低。這與MISHIMA等［28］的研究結(jié)果類似，由于PLD 蛋白被信號(hào)肽轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間后不斷積累，可能對(duì)宿主細(xì)胞有害，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定甚至丟失，從而降低酶活。
收集誘導(dǎo)表達(dá)PLD 8 h 的大腸桿菌細(xì)胞，用掃描電鏡觀察3 種方式下大腸桿菌細(xì)胞的形態(tài)變化，如圖4 所示。無(wú)質(zhì)粒的對(duì)照菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈短桿狀，兩端鈍圓形，如圖4（a）所示。在3 種表達(dá)方式下大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)均受到一定程度的破壞，如出現(xiàn)不同程度的變形、斷裂、塌陷等，有的細(xì)胞表面形成孔洞，有的細(xì)胞裂解出內(nèi)容物，如圖4（b）～（d）所示。其中，分泌表達(dá)菌株P(guān)LD-PelB 的細(xì)胞變形塌陷情況最為嚴(yán)重。與對(duì)照菌株相比，分泌表達(dá)菌株和胞內(nèi)表達(dá)菌株的細(xì)胞表面更光滑。此外，表達(dá)PLD 蛋白之后的細(xì)胞更長(zhǎng)，這可能是由于PLD 會(huì)影響細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖［29］。
圖4 大腸桿菌的掃描電鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron microscope images of E.coli.
綜上，誘導(dǎo)PLD 表達(dá)的最佳條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)8 h。
2.4 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
2.4.1 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酶促合成PS 產(chǎn)率的影響
菌株BL-PLD 誘導(dǎo)8 h 后，以1 mL 發(fā)酵液破碎后的粗酶液為催化劑，在40 ℃下反應(yīng)12 h 制備PS。比較了純水相和兩相體系的PS 產(chǎn)率，如圖5（a）所示。在純水相體系中，PS 產(chǎn)率僅為13.71%，是兩相體系中PS 產(chǎn)率的40%。這是因?yàn)樵赑LD 與底物PC 反應(yīng)過程中，存在生成磷脂酸的副反應(yīng)，而純水相體系會(huì)促進(jìn)磷脂酸的生成［30］，導(dǎo)致PS 產(chǎn)率下降。故選擇用兩相體系制備PS。
圖5 PS 產(chǎn)率液相檢測(cè)結(jié)果Fig.5 HPLC analysis of PS yield
2.4.2 不同PLD 表達(dá)方式對(duì)PS 產(chǎn)率的影響
為進(jìn)一步獲取PLD-EhaA、PLD-PelB 和BLPLD 3 種菌株的PS 產(chǎn)率，在誘導(dǎo)8 h 后離心收集菌體，按1 g 細(xì)胞加15 mL 緩沖液的比例，分別添加對(duì)應(yīng)體積的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，重懸菌體，取1 mL 細(xì)胞懸液催化PC；另取1 mL 超聲破碎粗酶液催化PC，結(jié)果如圖5（b）所示。可知，無(wú)論是使用粗酶液還是全細(xì)胞催化PC，PLD-EhaA 的PS 產(chǎn)率均較高，其中全細(xì)胞催化的PS 產(chǎn)率可達(dá)59.1%；PLDPelB 和BL-PLD 的PS 產(chǎn)率均在30%左右。
對(duì)于PLD-PelB 和BL-PLD 菌株，細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，PLD 粗酶液與底物PC 接觸更加充分，反應(yīng)效率更高，故粗酶液催化的PS 產(chǎn)率比全細(xì)胞催化高。在兩相體系反應(yīng)前期，可能粗酶液催化底物PC產(chǎn)生PS 的速率較快，但在反應(yīng)后期，有機(jī)溶劑影響了酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響PLD 酶活［31］。故反應(yīng)12 h后，粗酶液催化與全細(xì)胞催化PS 產(chǎn)率相差不大。
對(duì)于PLD-EhaA 菌株，大腸桿菌細(xì)胞通過EhaA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將PLD 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外膜。全細(xì)胞催化PC 能避免有機(jī)溶劑與酶液直接接觸，從而保持PLD 酶活。故PLD-EhaA 菌株全細(xì)胞催化PC的PS 產(chǎn)率較細(xì)胞破碎粗酶液催化的高。
在大腸桿菌細(xì)胞表面展示PLD 的優(yōu)勢(shì)在于，大腸桿菌產(chǎn)生的酶被連接并固定在細(xì)胞表面，避免了費(fèi)時(shí)費(fèi)力且昂貴的酶分離純化步驟［32］，且底物或產(chǎn)物均不需穿過細(xì)胞膜屏障［33］，大大降低了傳質(zhì)阻力。此外，PLD 表面展示方式還可用于PLD 固化，更適合規(guī)?；苽銹S?？傊?，PLD 表面展示是降低生物催化轉(zhuǎn)化過程成本的一種非常有效的方法。
3 結(jié)論
利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，研究了胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和表面展示3 種方式對(duì)PLD 酶活及其磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）催化合成效率的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)PLD 的最佳誘導(dǎo)條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1。在最適條件下，3 種方式的PLD 水解酶活均在誘導(dǎo)表達(dá)8 h 時(shí)達(dá)最高值，分別為0.35，0.23，0.11 U·mL-1。進(jìn)一步比較了胞內(nèi)表達(dá)菌株、分泌表達(dá)菌株以及表面展示菌株的PS 產(chǎn)率，結(jié)果表明，在水-乙酸乙酯兩相體系中，PLD 表面展示菌株的PS 產(chǎn)率最高，為59.1%。采用自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EhaA 對(duì)PLD 進(jìn)行表面展示，用全細(xì)胞催化底物，后期不需要對(duì)蛋白進(jìn)行分離純化，大大降低了底物或產(chǎn)物穿過細(xì)胞膜屏障的傳質(zhì)阻力。研究對(duì)工業(yè)化利用大腸桿菌生產(chǎn)PS 具有一定的指導(dǎo)意義。
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