崔艷麗，李順堯，張?zhí)煊?，張敏燕，鮑祥祥，毛旸易

（1.浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310058；2.鄭州財(cái)經(jīng)學(xué)院，河南 鄭州 450044；3.武漢大學(xué)，湖北 武漢 430072）

碳達(dá)峰碳中和是一個(gè)多維、立體、完整的系統(tǒng)工程。21 世紀(jì)已從“石油精煉”依賴(lài)向“生物精煉”時(shí)代開(kāi)啟。纖維素是地球上最豐富的天然有機(jī)物，占植物界碳量的50%以上。纖維素由于具有可持續(xù)性、可降解性、生態(tài)協(xié)調(diào)性及多羥基衍生化能力強(qiáng)等特點(diǎn)廣受青睞，特別是對(duì)功能性纖維素衍生物的研究與開(kāi)發(fā)。提取油脂后的米糠中大約含有50%纖維、20%蛋白質(zhì)以及10%植酸鈣等。常見(jiàn)的纖維素結(jié)構(gòu)修飾有物理修飾、化學(xué)修飾（硫酸化、磷酸化、乙?；龋┖蜕锕こ绦揎棥＝?jīng)生物改造后纖維素分子量和單糖的分布發(fā)生變化［1-2］。本文通過(guò)對(duì)發(fā)酵后的米糠纖維素進(jìn)行化學(xué)改造，制備帶陰離子的纖維素衍生物，在文物保護(hù)、農(nóng)產(chǎn)品保存、日常防護(hù)等中用于抗真菌。全世界有500 多萬(wàn)種真菌，侵襲性霉菌問(wèn)題日益嚴(yán)重，如文物保存中易受霉菌侵害，農(nóng)作物在運(yùn)輸、保存中由于受霉菌侵害被大量丟棄等，人類(lèi)面臨變異微生物的劫難。以往用抗真菌劑進(jìn)行接觸性消殺，對(duì)人體具有一定的毒性，且會(huì)引起微生物變異產(chǎn)生耐藥性。PERFECT［3］在抑制真菌途徑、靶點(diǎn)和作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究中，對(duì)第1～第3 代抗真菌劑進(jìn)行了總結(jié)，指出多糖衍生物是未來(lái)的抗菌劑前沿，其具有成膜性，能作為物理屏障阻礙病菌侵入，克服了現(xiàn)有技術(shù)的弱點(diǎn)，且對(duì)保護(hù)對(duì)象生態(tài)友好，易被接受；帶電荷的纖維素可通過(guò)其攜帶的電荷與微生物表面直接作用，由于其獨(dú)特的抗微生物途徑，不懼怕微生物的變異及不同的微生物品種來(lái)源，從而具有抑制微生物感染或直接殺傷微生物使其失去感染的能力［3-5］。

現(xiàn)有大多纖維素的衍生物反應(yīng)條件有待提升，如利用離子液體、不易處理的DMSO 等有機(jī)溶劑、無(wú)機(jī)鹽混合物等，成本高、后處理麻煩、轉(zhuǎn)化率低等［6-10］。本文首次將經(jīng)微生物改造的纖維素作為原料，在水相條件下采用陰離子醚化劑（3-氯-2-羥基丙磺酸鈉，CHPASA）通過(guò)一鍋法進(jìn)行陰離子化，反應(yīng)中使用的氫氧化鈉溶液既作為反應(yīng)物，又作為溶劑，還具有催化劑作用；反應(yīng)條件溫和，取代度適中，轉(zhuǎn)化率較高。采用元素分析、核磁共振、傅里葉紅外光譜（FTIR）等方法表征纖維素衍生物的組成和結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了抑真菌生物評(píng)估。纖維素陰離子衍生物具有可降解、生態(tài)環(huán)保、易接受等優(yōu)點(diǎn)，可用于文保材料如皮革、紙張、石材等的抗菌保護(hù)；同時(shí)因其具有親和、低價(jià)等特點(diǎn)，可用于農(nóng)產(chǎn)品的保存；在大范圍的防疫抗菌助劑等應(yīng)用中亦具有潛力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，上海），冷凍干燥器（FE-1A-50，上海），元素分析儀（vario MICRO cube，德國(guó)），紅外光譜儀（Nicolet iS 10，美國(guó)），核磁共振儀（Bruker Avance Ⅲ 500 MHz，德國(guó)）。發(fā)酵米糠（酵母發(fā)酵7 d，自制），3-氯-2-羥基-三甲基磺酸鈉（上海，分析純），氫氧化鈉（上海，分析純），鹽酸（上海，分析純），去離子水。

1.2 纖維素陰離子衍生物的制備

稱(chēng)取干燥的發(fā)酵米糠1 g，置于燒瓶中，加入l4% NaOH 溶液18 mL，攪拌，隨后加入3-氯-2-羥基丙磺酸鈉。在一定溫度（室溫，50 ℃，70 ℃，90 ℃）下反應(yīng)12 h，冷卻后用稀鹽酸溶液中和，用8 000 Da分子質(zhì)量的透析袋透析48 h，冷凍干燥，稱(chēng)重，放入干燥器備用。

1.3 元素分析與取代度

采用元素分析儀測(cè)試陰離子纖維素衍生物樣品中的含硫量（S%），推算陰離子基團(tuán)取代度（DS）。DS 為纖維素大分子每個(gè)失水葡萄糖單元上被取代基團(tuán)的平均羥基數(shù)。S%與DS 的關(guān)系為

1.4 紅外光譜與取代基團(tuán)

干燥樣品在研缽中與KBr 混合研磨，壓片后在400～4 000 cm-1范圍進(jìn)行FTIR 表征分析。

1.5 體外抑真菌活性評(píng)價(jià)

調(diào)整好菌懸液（選用黑曲霉、出芽短梗霉和嗜松青霉）的密度，并均勻涂布于凝結(jié)的平板培養(yǎng)基。先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濾紙（直徑6 mm）滅菌，分別蘸取一定濃度發(fā)酵纖維素陰離子衍生物Y1 的水溶液，風(fēng)干后貼于平板表面，其中1 片為滅菌后的濾紙，用于空白對(duì)照，3 片為處理后的濾紙，在平板培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)48 h，測(cè)定抑菌圈大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素與CHPASA 反應(yīng)

纖維素是由D-吡喃葡萄糖單元以β-1，4 苷鍵脫水而成的均多糖，具有復(fù)雜的四級(jí)結(jié)構(gòu)。每個(gè)葡萄糖殘基上有3 個(gè)羥基，其中6 位上的屬于伯羥基，2，3位上的屬于仲羥基。一般情況下伯羥基的反應(yīng)能力比仲羥基強(qiáng)，且具有空間位阻小的優(yōu)勢(shì)；在氫氧化鈉作用下，陰離子醚化劑自身發(fā)生反應(yīng)，即3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的氯與鄰位的羥基形成環(huán)氧化合物，環(huán)氧化合物活性高，在堿性條件下迅速與纖維素發(fā)生親核取代反應(yīng)，將陰離子基團(tuán)引至纖維素羥基的氧原子上，獲得陰離子纖維素衍生物，具有綠色環(huán)保的特點(diǎn)，不需要有機(jī)溶劑，與醚化劑共同作用，便可打開(kāi)纖維素的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)發(fā)酵的纖維素，也會(huì)破壞一定的分子高級(jí)結(jié)構(gòu)，去掉部分基團(tuán)，從而使纖維素大分子羥基更易反應(yīng)。

2.2 反應(yīng)體系的選擇

纖維素大分子內(nèi)部及分子之間存在氫鍵，難以在常規(guī)的溶液或熔融狀態(tài)下發(fā)生反應(yīng)，因而其應(yīng)用大受限制。已有報(bào)道認(rèn)為，所有的有機(jī)溶劑、無(wú)機(jī)混合溶劑和離子液體等都是為了破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)攻纖維素羥基的反應(yīng)，首要的是破壞其氫鍵網(wǎng)絡(luò)。本文采用經(jīng)酵母發(fā)酵7 d 的米糠纖維素，通過(guò)脫油、脫水獲得易參與反應(yīng)的粗纖維；為方便后處理且降低成本，將一定濃度NaOH 溶液作為反應(yīng)體系，在此體系中，NaOH 不僅可以作為溶劑，破壞纖維素的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而且可作為反應(yīng)試劑，進(jìn)攻CHPASA 的氯原子，同時(shí)可作為催化劑，去掉纖維素羥基中的氫，改變其環(huán)氧結(jié)構(gòu)，使親核反應(yīng)更易進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)初期，體系為棕色分散液，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，纖維素網(wǎng)絡(luò)被打開(kāi)，得到半透明渾濁液，說(shuō)明纖維素分子已遭其他分子攻擊，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，得到新的纖維素衍生物分子，其形態(tài)亦由不透明的棕色固體原料變?yōu)闇\黃色固體產(chǎn)物。陰離子醚化劑先生成反應(yīng)活性強(qiáng)的環(huán)氧化合物，其實(shí)質(zhì)就是用堿催化烷氧基進(jìn)攻羥基形成醚。

圖1 纖維素結(jié)構(gòu)與氫鍵分布［12］Fig.1 Cellulose structure and its hydrogen bond distribution

圖2 陰離子醚化劑與纖維素的反應(yīng)Fig.2 Etherification of fermented cellulose with CHPASA

2.3 反應(yīng)條件對(duì)取代度的影響

前期的探索實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系的NaOH/CHPASA 物質(zhì)的量之比、CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比均可影響產(chǎn)物的反應(yīng)取代度。反應(yīng)時(shí)間取12 h。

溫度對(duì)纖維素衍生物取代度的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，適當(dāng)升高溫度，可加快分子的運(yùn)動(dòng)，有利于促進(jìn)親核反應(yīng)，提高取代度，但是溫度過(guò)高，醚化劑會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)，不利于主反應(yīng)的發(fā)生。

表1 溫度對(duì)陰離子纖維素取代度的影響Table 1 Effect of temperature on degree of substitution of anionic cellulose

一般情況下醚化劑的投料更多，因?yàn)? 個(gè)葡萄糖殘基有3 個(gè)未反應(yīng)的羥基，CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比為9，說(shuō)明針對(duì)一個(gè)單糖殘基的1 個(gè)羥基有3 個(gè)醚化劑參與進(jìn)攻反應(yīng)；由表2 可知，一味增加CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比，雖能提高取代度，但提高有限甚至有所減小，綜合考慮環(huán)保與成本，取CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比為7。

表2 CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比對(duì)陰離子纖維素取代度的影響Table 2 Effect of CHPASA/cellulose molar ratio on degree of substitution of anion cellulose

體系的酸堿度對(duì)反應(yīng)影響很大，當(dāng)堿性偏強(qiáng)時(shí)，醚化劑產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，影響主反應(yīng)。但需保持適當(dāng)?shù)膲A性，以保證環(huán)氧的形成和羥基的去質(zhì)子化。由表3 可知，當(dāng)NaOH/CHPASA 物質(zhì)的量之比為1時(shí)，取代度最高。

表4 纖維素陰離子衍生物Y1 的抑菌效果Table 4 Antifungal effect of cellulose derivative Y1

綜上，優(yōu)化反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度65 ℃，NaOH/CHPASA 物質(zhì)的量之比1、CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比7。

2.4 核磁共振圖

圖3 為纖維素陰離子衍生物Y1 的1H-13C NMR譜圖（溶劑：D2O，溫度：25 ℃），橫坐標(biāo)為1H 化學(xué)位移，縱坐標(biāo)為13C 化學(xué)位移。

圖3 發(fā)酵纖維素陰離子衍生物Y1 的二維NMR 譜圖Fig.3 2D 1H-13C NMR spectrum of cellulose derivative Y1

從圖3 中可看到，Y1 中有9 種碳，與氫譜的化學(xué)位移大小對(duì)應(yīng)，并且是單取代；（5.31×10-6，99.33×10-6）處為葡萄糖單體異頭碳的化學(xué)位移［11］；相關(guān)點(diǎn)并不雜亂，貌似單糖產(chǎn)物的圖譜，說(shuō)明經(jīng)過(guò)發(fā)酵后纖維素更易反應(yīng)，并且其大分子已展開(kāi)，無(wú)其他基團(tuán)存在；化學(xué)位移（3.10×10-6，53.73×10-6）處為與磺酸基連接的亞基，這充分說(shuō)明已成功引入了陰離子醚化劑基團(tuán)；其他7 個(gè)點(diǎn)的氫譜化學(xué)位移從3.49×10-6至4.20×10-6不等，碳譜化學(xué)位移從60.09×10-6至76.13×10-6分別為葡萄糖單元5 個(gè)碳與醚基上另外2 個(gè)碳的歸屬。

2.5 傅里葉紅外光譜圖

圖4 為400～4 000 cm-1的發(fā)酵纖維素與發(fā)酵纖維素陰離子衍生物的FTIR 譜。產(chǎn)物與原料比較，呈現(xiàn)了一些特異吸收峰。由圖4 可知，3 415.96 cm-1附近出現(xiàn)的較強(qiáng)吸收峰是由分子O—H 伸縮振動(dòng)引起的；2 926.81 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰由亞甲基伸縮振動(dòng)引起；1 639.97 cm-1附近的峰為羥基與自由水形成的氫鍵吸收峰；這3 個(gè)吸收峰構(gòu)成了多糖的特征吸收峰。在1 043.33 cm-1處，由C—O 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生；在615.94 cm-1附近有1 個(gè)S—O 特征吸收峰。核磁共振譜圖亦證明，纖維素與陰離子醚化劑反應(yīng)后，帶陰離子的基團(tuán)被成功引入大分子中。

圖4 發(fā)酵米糠纖維素陰離子衍生物Y1 與發(fā)酵米糠纖維素FTIR 譜圖Fig.4 Comparison of infrared spectra between cellulose derivative Y1 and fermented cellulose

3 抑制真菌實(shí)驗(yàn)

抑制真菌實(shí)驗(yàn)選定的含菌量約為1×107～2×107CFU·mL-1，纖維素陰離子衍生物Y1 的濃度為40 mg·mL-1。纖維素陰離子衍生物Y1 對(duì)3 種真菌的抑菌效果均表現(xiàn)為中敏，對(duì)黑曲霉的抑菌效果相對(duì)較強(qiáng)?？紤]纖維素陰離子衍生物Y1 具有生態(tài)、可降解等優(yōu)勢(shì)，在文物保護(hù)、農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)存及長(zhǎng)期抗疫防護(hù)等方面具有應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

研究了發(fā)酵纖維素轉(zhuǎn)化為陰離子衍生物的綠色策略，得到的優(yōu)化條件為反應(yīng)溫度65 ℃，NaOH/CHPASA 物質(zhì)的量之比1、CHPASA/纖維素物質(zhì)的量之比7，獲得了取代度為0.65 的纖維素衍生物。通過(guò)元素分析、核磁共振、FTIR，表征了纖維素衍生物的結(jié)構(gòu)。