何欣，黃穎，暴正瀚，孟慧，李浩凌，魏建和，楊云*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 海口 570311

沉香為常綠喬木瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（AquilariaLam.）或擬沉香屬（GyrinopsGaertn.）植物含樹脂的木材[1]。白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg 是我國出產(chǎn)沉香的主要樹種，也是《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版收載的國產(chǎn)藥用沉香的唯一正品基原植物[2]。沉香作為傳統(tǒng)名貴藥材和“龍?zhí)闯流辍彼拇竺阒椎馁F細(xì)香料，在中國、馬來西亞、老撾、越南等國家和歐美地區(qū)國家應(yīng)用廣泛[3-5]。但由于長期無節(jié)制砍伐，沉香屬植物資源逐漸減少，已達(dá)瀕危[6-7]。目前，所有沉香屬及擬沉香屬物種均被列為瀕危物種[8]。

種植的白木香樹需要遭受外界傷害（真菌侵染或物理、化學(xué)傷害），經(jīng)長時(shí)間積累，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生沉香[9]。為了解決野生資源瀕危、市場(chǎng)高品質(zhì)沉香資源短缺的問題，許多人工誘導(dǎo)技術(shù)被發(fā)明應(yīng)用于沉香生產(chǎn)[10-15]。通體結(jié)香技術(shù)（Agar-WIT）[15-16]作為目前中國和世界其他沉香產(chǎn)區(qū)應(yīng)用最廣泛的人工結(jié)香技術(shù)，具有成本低、產(chǎn)量高、操作簡便等特點(diǎn)[17-18]，所產(chǎn)通體香具有藥用安全性[19-20]，明顯優(yōu)于火烙法、結(jié)菌法、半斷干法等其他傳統(tǒng)人工結(jié)香技術(shù)[12]，已在中國及東南亞國家超45 萬株沉香樹上使用[21]。其具體操作方法為選擇晴天在距離地面50 cm 處的白木香樹體上鉆孔，孔深至木質(zhì)部，用輸液裝置輸送結(jié)香液至小孔內(nèi)，通過植物自身的蒸騰作用將高效安全的結(jié)香液輸送至植物的莖干、枝條等部位，6～12 個(gè)月后，可在樹干中形成沉香，而后整株伐倒即得[22]。

近年來，通體結(jié)香技術(shù)被廣泛應(yīng)用于許多國家的沉香生產(chǎn)，為了該技術(shù)能更好地應(yīng)用和推廣，有學(xué)者對(duì)結(jié)香產(chǎn)地[8,18,21]、結(jié)香時(shí)間[23-24]、白木香胸徑、鉆孔高度[25]等通體結(jié)香技術(shù)影響因素及其對(duì)產(chǎn)香的影響進(jìn)行了探究，但尚未有對(duì)該技術(shù)本身操作優(yōu)化升級(jí)的研究報(bào)道。因此，本研究探究高壓輸液的最佳輸液壓力，在晴天、雨天、夜晚、低溫結(jié)香環(huán)境下，通過對(duì)比高壓輸液和常壓輸液2 種通體結(jié)香技術(shù)的輸液時(shí)間，分析2 種通體香的性狀、顯微結(jié)構(gòu)、結(jié)香率、浸出物、特征圖譜及沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，評(píng)價(jià)高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)的可行性，為通體結(jié)香技術(shù)的升級(jí)和在國內(nèi)外更好地應(yīng)用推廣提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

沉香采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所海口研發(fā)中心，為試驗(yàn)田5 年生白木香樹。選取樹體直徑7 cm 左右（離地1 m 處）、無蟲蛀霉斑、外觀健康、無結(jié)香痕跡的筆直單桿樹，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所楊云研究員鑒定為白木香Aquilria sinensis（Lour.）Gilg。憑證標(biāo)本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標(biāo)本館。

1.2 儀器

CM1950 型冰凍切片機(jī)（德國Leica 公司）；ECLIPSE80i 型生物顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（江蘇科技儀器有限公司）；Mili-Q 型純水儀（美國Millipore 公司）；2695/2475型高效液相色譜儀[沃特世科技（上海）有限公司]；AL104-IC型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070A型恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試藥

沉香四醇對(duì)照品（批號(hào)：111980-201904，純度：98.6%）、沉香對(duì)照藥材（批號(hào)：121222-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；“通香一號(hào)”結(jié)香液為本課題組發(fā)明的沉香誘導(dǎo)結(jié)香液；FSC 22 Blue 冷凍包埋劑（美國Surgipath 公司）；GF254薄層色譜板（批號(hào)：HX17444229，德國Merck 公司）；乙腈、甲酸（HPLC 級(jí)，賽默飛世爾科技中國有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 結(jié)香處理

高壓輸液壓力考察：在距離地面1 m 處，沿樹體垂直方向鉆2 個(gè)小孔，輸液管連接高壓輸液瓶，分別在常壓和10、20、30 MPa 4 種不同壓力下采用通體結(jié)香技術(shù)輸液處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次，記錄輸液時(shí)間，確定高壓輸液的最佳壓力。

通體結(jié)香處理：在晴天、雨天、夜晚、低溫條件下，按上述結(jié)香操作步驟，分別于20 MPa和常壓下采用通體結(jié)香技術(shù)結(jié)香，每個(gè)處理重復(fù)3 次，記錄輸液時(shí)間，結(jié)香6個(gè)月后收樣，樣品信息見表1。

表1 高壓不同結(jié)香環(huán)境條件的沉香樣品信息

2.2 樣品前處理

伐倒的整棵沉香樹鋸掉樹枝和上下方白木部分，剝除外皮，截成長20 cm 的小段，干燥，留取部分沉香樣品塊用于后續(xù)結(jié)香率計(jì)算及顯微鑒別，按海南省地方標(biāo)準(zhǔn)《白木香通體結(jié)香樹木剖香技術(shù)規(guī)程》（DB45/T 257—2013）[26]要求，將白木和腐爛部位等未結(jié)香部分剔除，剖取沉香，香片打粉后分別過二號(hào)篩和三號(hào)篩，備用。

2.3 沉香結(jié)香率計(jì)算

采收后的沉香樹段分別于上、中、下3 段位置，切取厚度為3 cm 左右的莖段。正上方分別拍取各莖段的橫截面圖，按公式（1）計(jì)算每棵樹的結(jié)香率。采用Photoshop 像素法[24]計(jì)算出各莖段的橫截面平均像素（NC）和結(jié)香區(qū)域平均像素（NA），結(jié)香區(qū)域與橫截面像素?cái)?shù)之比等于結(jié)香層面積（SA）與橫截面面積（SC）之比，即每株樹的結(jié)香率。

2.4 顯微鑒別

將厚度約為0.5 cm 的沉香樣品在70 ℃熱水浴中浸泡6 h 直至沉香樣品塊完全軟化，取出晾干后，修剪成合適大小的方形樣品小塊（包含腐爛層、沉香層和白木層），用適量冷凍包埋劑包埋，冷凍切片機(jī)切取100 μm 的薄片，水合氯醛透化劑中透化6 h，裝片，置于4 倍物鏡的顯微鏡下觀察。

2.5 浸出物

按《中國藥典》2020 年版（四部）[27]通則2201項(xiàng)下醇溶性熱浸法測(cè)定浸出物含量。

2.6 薄層鑒別

稱取混合均勻的沉香樣品粉末（過二號(hào)篩）0.5 g，乙醚30 mL提取，超聲振蕩1 h，濾過，蒸干濾液，殘?jiān)尤燃淄? mL 溶解，作為供試品溶液。另取沉香對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。參照《中國藥典》2020年版[2]薄層色譜法（通則0502），吸取上述2種溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）條件下展開，取出后晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.7 特征圖譜和沉香四醇含量測(cè)定

按照《中國藥典》2020 年版方法[2]測(cè)定特征圖譜和沉香四醇含量。

3 結(jié)果

3.1 確定高壓輸液最佳壓力

輸液法通體結(jié)香技術(shù)不同輸液壓力的輸液時(shí)間見圖1。不同輸液壓力輸液時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），10、20、30 MPa較常壓均能大幅度縮短通體結(jié)香技術(shù)輸液時(shí)間，高壓輸液效率較常壓可提高216%～497%。其中，20 MPa 壓力下輸液時(shí)間最短，輸液效率最高，平均輸液時(shí)間為31 min，較常壓輸液效率提高497%，為高壓輸液最佳壓力。

圖1 輸液法通體結(jié)香技術(shù)不同輸液壓力的輸液時(shí)間（,n=3）

3.2 輸液時(shí)間

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)的輸液時(shí)間見圖2。與常壓相比，20 MPa在晴天、夜晚、雨天、低溫4種結(jié)香環(huán)境下，均能顯著縮短輸液時(shí)間（P<0.01），輸液效率可提高129%～497%，以晴天時(shí)提高效果最顯著，輸液時(shí)間可縮短83%。其中，20 MPa 組和常壓均以晴天時(shí)的輸液時(shí)間最短，優(yōu)于其他三組，不同結(jié)香環(huán)境條件輸液時(shí)間從短到長分別為晴天、夜晚、低溫、雨天。

圖2 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)的輸液時(shí)間（,n=3）

3.3 性狀

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的橫截面見圖3，由內(nèi)至外可分為腐爛層、沉香層、過渡層和白木層。20 MPa 組通體香沉香層顏色較常壓深，且均有點(diǎn)狀沉香向外擴(kuò)散的趨勢(shì)。晴天20 MPa 組通體香沉香層與常壓相比，從偶見淺褐色虛線變?yōu)樽睾谏B續(xù)實(shí)線，且在環(huán)形沉香層外可見1 圈明顯的棕色星點(diǎn)狀溢出，晴天組均無明顯阻隔層形成。夜晚20 MPa 組通體香較常壓通體香沉香層顏色加深，阻隔層明顯減少，由淺棕色虛線，可見1 圈較厚白色阻隔層變?yōu)橐话霝樯钭厣珜?shí)線、一半為淺棕色虛線，阻隔層僅虛線部分可見。雨天、低溫20 MPa 組通體香沉香層呈現(xiàn)明顯棕黑色實(shí)線，且有深棕色星點(diǎn)狀溢出，雨天20 MPa 組未見明顯阻隔層形成，雨天常壓有較少不明顯阻隔層。

圖3 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香性狀

3.4 結(jié)香率

通體結(jié)香技術(shù)通過高壓輸液產(chǎn)沉香的結(jié)香率見圖4，20 MPa 組通體香的平均結(jié)香率為11.69%，與常壓通體香的平均結(jié)香率（10.82%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，20 MPa 組和常壓組中晴天、雨天、低溫的結(jié)香率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；常壓夜晚時(shí)的結(jié)香率顯著低于晴天（P<0.05），僅為8.15%。

圖4 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的結(jié)香率（,n=3）

3.5 顯微特征

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的顯微結(jié)構(gòu)見圖5，所有樣品均可觀察到導(dǎo)管、射線和木間韌皮部等顯微結(jié)構(gòu)；木間韌皮部呈“島”狀、條帶狀或橢圓狀，細(xì)胞壁薄，內(nèi)含黃棕色或棕色樹脂；射線寬1～2 列細(xì)胞，呈類長方形；充滿黃棕色或棕色樹脂，多與木間韌皮部相交；導(dǎo)管呈多角形或類圓形的單孔或復(fù)孔，少數(shù)導(dǎo)管有樹脂填充。20 MPa 組通體香木間韌皮部樹脂較常壓色度深、填充度高，與性狀觀察結(jié)果一致。晴天、夜晚、雨天、低溫不同結(jié)香環(huán)境條件的木間韌皮部樹脂的填充度和色度也存在一定差異，晴天組樹脂呈黃棕色或棕褐色，明顯優(yōu)于其他三組。夜晚常壓觀察到明顯的阻隔層結(jié)構(gòu)，雨天常壓、雨天20 MPa 組、低溫20 MPa 組觀察到木間韌皮部異常膨大，上下2 個(gè)相連成團(tuán)狀，推測(cè)為阻隔層形成的前體結(jié)構(gòu)。

圖5 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香顯微特征（×4）

3.6 沉香的浸出物含量

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖6，20 MPa 壓力不同結(jié)香環(huán)境條件下所產(chǎn)通體香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均已達(dá)到《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)，按浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低排序分別為晴天（16.33%）、低溫（15.24%）、雨天（14.89%）和夜晚（14.11%），平均浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.14%，與常壓通體香平均浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（13.61%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。常壓晴天、雨天、低溫時(shí)通體香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于10.0%，且與20 MPa 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。常壓夜晚時(shí)通體香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，僅為9.66%，未達(dá)到《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)，顯著低于其他處理（P<0.05）。

圖6 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）

3.7 沉香的薄層色譜

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香樣品的薄層色譜鑒別見圖7。所有樣品薄層色譜上的熒光斑點(diǎn)與沉香對(duì)照藥材一致。結(jié)果表明，高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)在晴天、夜晚、雨天、低溫不同結(jié)香環(huán)境條件下結(jié)香處理獲得的樹脂均為沉香，符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。

圖7 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香樣品的薄層色譜圖

3.8 沉香四醇含量測(cè)定

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖8。高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.1%，符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。20 MPa 組通體香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.27%～0.65%，平均值為0.45%，與常壓通體香沉香四醇的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.54%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。常壓中晴天的通體香沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.77%，夜晚時(shí)最低為0.18%。晴天、雨天、低溫時(shí)20 MPa組與常壓組通體香沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常壓夜晚時(shí)的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于20 MPa組（P<0.05）。

圖8 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）

3.9 特征圖譜

高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香特征圖譜見圖9。通過高壓輸液和常壓輸液所產(chǎn)沉香樣品的特征圖譜均有6 個(gè)特征峰，與《中國藥典》2020 年版沉香特征圖譜的6 個(gè)特征峰相對(duì)應(yīng)，符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。

圖9 高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香特征圖譜

4 討論

實(shí)際生產(chǎn)中，通體結(jié)香技術(shù)受天氣影響較大，為了達(dá)到較好的輸液效果，通常需要在晴朗、光照充足、溫度>25 ℃的上午結(jié)香[22]。但本研究中常壓操作時(shí)僅晴天的輸液時(shí)間就長達(dá)3 h，夜晚、低溫、雨天等條件下輸液時(shí)間更長，如雨天的輸液時(shí)間甚至是晴天的6.5 倍。這說明常壓操作存在輸液時(shí)間較長的特點(diǎn)，且無法實(shí)現(xiàn)全年、全天結(jié)香，大大降低了該通體結(jié)香技術(shù)實(shí)施的效率。本研究發(fā)現(xiàn)，通過提高輸液壓力能顯著減少通體結(jié)香技術(shù)的輸液時(shí)間，晴天、夜晚、低溫和雨天20 MPa壓力輸液（簡稱高壓輸液）通體結(jié)香技術(shù)的輸液效率能提高129%～497%，高壓輸液時(shí)晴天的輸液時(shí)間可縮短到31 min，大大節(jié)約了實(shí)際生產(chǎn)中的操作時(shí)間。因此，高壓輸液能打破環(huán)境條件對(duì)通體結(jié)香技術(shù)的應(yīng)用限制，大幅度提高輸液效率，適用于實(shí)際生產(chǎn)。

本研究中高壓通體香的品質(zhì)均符合《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)，平均結(jié)香率、平均浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和平均沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)11.69%、15.14%和0.45%，與常壓結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。晴天、雨天、低溫時(shí)高壓通體香與常壓通體香的結(jié)香率、浸出物含量和沉香四醇含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，品質(zhì)較為相似；夜晚高壓通體香的浸出物含量和沉香四醇含量顯著高于常壓通體香，品質(zhì)優(yōu)于常壓。這說明高壓輸液不會(huì)對(duì)通體結(jié)香技術(shù)造成不利影響，不會(huì)降低所產(chǎn)通體香品質(zhì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，各環(huán)境條件下高壓輸液通體香與常壓輸液通體香的浸出物含量與沉香四醇含量無正向相關(guān)性。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通體結(jié)香技術(shù)產(chǎn)生沉香的過程會(huì)伴隨阻隔層的形成，即在沉香層和過渡層之間形成1 圈約1～5 mm 厚的白色帶狀結(jié)構(gòu)。阻隔層的形成原因是沉香層外圍的部分木間韌皮部脫分化重新分裂，這是為了將受到傷害的組織和健康組織分隔開，阻止傷害在樹體內(nèi)擴(kuò)展[28]。本研究中也觀察到部分常壓輸液通體香有1 圈明顯較厚的阻隔層，而高壓輸液通體香阻隔層明顯減少，較常壓輸液在環(huán)形結(jié)香層外出現(xiàn)結(jié)香點(diǎn)狀向外擴(kuò)散現(xiàn)象，推測(cè)高壓有可能延緩阻隔層的形成和積累，但該結(jié)論還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

針對(duì)全球高品質(zhì)沉香需求越來越多的現(xiàn)狀，結(jié)香技術(shù)也亟待升級(jí)更新。本研究采用高壓操作對(duì)通體結(jié)香技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)，在晴天、夜晚、雨天、低溫4 種不同結(jié)香環(huán)境條件下，探究高壓輸液對(duì)通體結(jié)香技術(shù)輸液效率及產(chǎn)沉香品質(zhì)的影響，結(jié)果表明20 MPa為高壓輸液法通體結(jié)香技術(shù)的最佳輸液壓力，能顯著提高通體結(jié)香技術(shù)的輸液效率，突破天氣和氣候的限制，可在夜晚、雨天、低溫等環(huán)境開展結(jié)香工作且不影響所產(chǎn)沉香品質(zhì)，具有可行性和可操作性。研究結(jié)果為通體結(jié)香技術(shù)的升級(jí)和實(shí)際應(yīng)用推廣提供了依據(jù)和參考。