張金環(huán)，程艷宇，李桂紅，李偉霞，朱歡

(天津市乳品食品監(jiān)測(cè)中心有限公司，天津 300392)

姜是一種藥用和食用植物[1]，由于其日益凸顯的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，種植面積迅速擴(kuò)張。我國(guó)是世界上生姜種植面積最大和產(chǎn)量最高的國(guó)家，生姜年產(chǎn)量已達(dá)到1 000 萬(wàn)t，約占世界總產(chǎn)量45%。生姜在生長(zhǎng)和貯存期間，通常會(huì)使用農(nóng)藥來(lái)防治害蟲(chóng)和病害[2]，因此，姜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)尤為重要。

生姜中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[3-4]、液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-7]、液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8-10]以及高分辨質(zhì)譜法(Q-TOFMS)[11-14]等。GC、LC 方法與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法相比，不但存在定性能力不足，而且一次性可檢測(cè)的農(nóng)藥種類也有局限性。Q-TOFMS 可采集更為全面的化合物信息，定性優(yōu)勢(shì)突出，但所需儀器價(jià)格過(guò)于昂貴。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，具有高靈敏度、高選擇性、高回收率和高通量等優(yōu)點(diǎn)。農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取[15]、基質(zhì)固相分散萃取、固相微萃取[8]以及QuEChERS[9-12,16]等。

為減少傳統(tǒng)QuEChERS[16-17]方法的基質(zhì)效應(yīng)，提高其回收率，擬通過(guò)優(yōu)化提取溶劑和凈化方法，選擇乙腈為提取劑，基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對(duì)姜中農(nóng)藥及代謝物殘留進(jìn)行快速檢測(cè)分析，為農(nóng)藥殘留提供一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的分析方法，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

生姜(天津地區(qū)市售)；農(nóng)藥及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品：噠螨靈，嘧菌酯，辛硫磷，蟲(chóng)酰肼，吡唑醚菌酯，多菌靈，啶蟲(chóng)脒，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，霜霉威，咪鮮胺，滅蠅胺，氯蟲(chóng)苯甲酰胺，多效唑，氟啶脲，烯酰嗎啉，噻蟲(chóng)嗪，吡蟲(chóng)啉，氯吡脲，克百威及其代謝物3-羥基克百威、涕滅威及其代謝物涕滅威砜、涕滅威亞砜，甲萘威，滅多威，氧樂(lè)果，抗蚜威，樂(lè)果，甲霜靈，嘧霉胺，噻蟲(chóng)胺，氟硅唑，氯唑磷，戊唑醇，三唑酮，啶酰菌胺，毒死蜱，噻嗪酮，茚蟲(chóng)威，滅幼脲，氟蟲(chóng)腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜(天津阿爾塔)；甲醇、乙腈(色譜純，默克)；乙酸銨(德國(guó)SIGMA 公司)；氯化鈉(分析純)；所有用水均為超純水；0.22 μm 有機(jī)相濾膜。吸附劑：十八烷基鍵合硅膠(C18：43~60 μm)、N-丙基乙二胺鍵合硅膠(PSA：40~60 μm)、GCB(40~120 μm)(CNW，中國(guó))

SCIEX 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀配Waters I Class超高效液相色譜；IKA T25 數(shù)顯型分散機(jī)(德國(guó)IKA公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL)配制

準(zhǔn)確移取1.0mL 農(nóng)藥或代謝物標(biāo)準(zhǔn)品(1000μg/mL)，用甲醇溶解并定容至10 mL，避光-18 ℃以下保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00 μg/mL)配制

移取一定量農(nóng)藥或代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中用甲醇定容至刻度，避光-18 ℃以下保存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g(精確至0.01 g)姜試樣于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 乙腈，10 000 r/min 均質(zhì)提取1.0 min。向勻漿后的樣品中加入5 g 氯化鈉，于5 000 r/min 離心提取5 min，取2 mL 上清液置于裝有150 mg 無(wú)水硫酸鎂、25 mg PSA 和2.5 mg GCB的離心管中，渦旋1 min，于5 000 r/min 離心提取5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，測(cè)定備用。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相：A 相：含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液，B 相：乙腈，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL，柱溫：40 ℃；分析時(shí)間：8 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正負(fù)切換模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣及流量：氮?dú)猓?5.0 μL/min；GS1 及流量：氮?dú)猓?5 μL/min；GS2 及流量：氮?dú)猓?5 μL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器參數(shù)

將200 ng/mL 每種農(nóng)藥或代謝物標(biāo)準(zhǔn)品分別由針泵直接注入質(zhì)譜，優(yōu)化MRM 離子對(duì)。全掃描模式下(m/z50~1 000)進(jìn)行母離子掃描。針對(duì)母離子，測(cè)試并優(yōu)化去簇電壓(DP)。選擇優(yōu)化后母離子在MRM 模式下掃描產(chǎn)物離子，分別為每種化合物選擇2 個(gè)子離子，同時(shí)優(yōu)化子離子的碰撞電壓(CE)。定量和定性離子、去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 色譜條件

選擇性能優(yōu)異、穩(wěn)定性好、載樣量和分離度高的Waters ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相色譜柱，并比較了色譜柱50、100 mm 2 種長(zhǎng)度對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明各農(nóng)藥及代謝物在ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱上保留時(shí)間和分離度均比較理想。

甲醇和乙腈是常用的2 種有機(jī)流動(dòng)相，基于乙腈黏度較小、系統(tǒng)壓力低、分離度好，選擇并比較了反相色譜常用的流動(dòng)相體系乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液和乙腈-0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨水溶液。乙酸銨能促進(jìn)化合物的離子化效率，且加入甲酸利于目標(biāo)化合物響應(yīng)增強(qiáng)、峰形變尖銳、靈敏度變高。結(jié)果表明，以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨水溶液為梯度洗脫流動(dòng)相，各農(nóng)藥及代謝物峰形良好、響應(yīng)值高。

2.3 提取溶劑

考察了乙腈、乙酸乙酯和甲醇3 種提取溶劑對(duì)各農(nóng)藥及代謝物在姜空白基質(zhì)中加標(biāo)100 μg/kg 回收率的影響。結(jié)果表明：乙腈為提取劑時(shí)，它們的回收率為85%~103%，符合GB/T 27404—2008 附錄F中對(duì)回收率范圍的要求(被測(cè)組分含量為0.1~1.0 mg/kg時(shí)，回收率范圍為80%~110%)；乙酸乙酯為提取劑時(shí)，噠螨靈和滅蠅胺回收率分別為73%和62%；甲醇為提取劑時(shí)，各農(nóng)藥及代謝物回收率為64%~129%，不符合GB/T 27404—2008 附錄F 中對(duì)回收率范圍的要求。因此，選擇乙腈作為提取劑。

2.4 吸附劑

QuEChERS 是通過(guò)填料與樣品基質(zhì)干擾物質(zhì)相互作用吸附雜質(zhì)，達(dá)到凈化除雜質(zhì)目的。常用吸附劑有PSA(N-丙基乙二胺)、C18(十八烷基硅膠鍵合相)、石墨化碳黑(GCB)、無(wú)水硫酸鎂等。PSA 為反相固定相或陰離子交換固定相，能有效去除提取液中極性物質(zhì)，如有機(jī)酸、糖類等碳水化合物，但PSA的過(guò)量使用會(huì)使具有-NH2、-OH、-SH 等官能團(tuán)農(nóng)藥被吸附，檢測(cè)結(jié)果偏低；C18可以有效去除姜提取液中脂類物質(zhì)，如脂肪、甾醇和揮發(fā)性油；GCB 主要用于去除樣品中色素和固醇類雜質(zhì)。無(wú)水硫酸鎂則主要用于去除萃取液中的水分。

采用空白基質(zhì)加標(biāo)100 μg/kg 回收法比較了吸附劑及其用量對(duì)農(nóng)藥及代謝物提取效率的影響：無(wú)水硫酸鎂(300 mg)，PSA(25、50、100 mg)，GCB(2.5、5.0、10.0 mg)。結(jié)果表明：無(wú)水硫酸鎂為吸附劑時(shí)，滅蠅胺回收率低于50%，多菌靈和戊唑醇回收率為71%~76%；GCB 為吸附劑時(shí)，多菌靈、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、吡唑醚菌酯、嘧霉胺和滅蠅胺回收率為20%~65%，且隨著GCB 用量增加，回收率呈下降趨勢(shì)；PSA 為吸附劑時(shí)，各組分回收率比較理想。后經(jīng)各組分的復(fù)配試驗(yàn)，綜合比較樣品凈化效果及對(duì)色譜柱和儀器的影響，選擇無(wú)水硫酸鎂(300 mg)、GCB(5.0 mg)、PSA(50 mg)為凈化劑，在加標(biāo)水平為100 μg/kg 時(shí)，各化合物的回收率為85%~103%。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

用姜空白基質(zhì)提取液將各農(nóng)藥及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1、2、5、10、20、50、100、200 μg/kg系列濃度基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。各農(nóng)藥及代謝物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限(信噪比S/N≥3)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，各農(nóng)藥及代謝物的線性回歸方程的線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以3 倍基線噪音所對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為方法的檢出限，10 倍基線噪音所對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為方法的定量限，得到38 種農(nóng)藥及6 種代謝物的定量限為3.0~5.0 μg/kg，檢出限為1.0~2.0 μg/kg(表3)。

表3 加標(biāo)回收率及精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.6 精密度和準(zhǔn)確度

選擇一份上述農(nóng)藥殘留均未檢出的空白樣品，分別添加10、20、100 μg/kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，按照優(yōu)化條件進(jìn)行樣品前處理后分析測(cè)定，加標(biāo)回收率為71.9%~102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%~8.9%，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7 方法應(yīng)用

基于所建立方法，對(duì)市售50 份生姜樣品農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)，按檢出率由低到高排列，依次為噻蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪、咪鮮胺、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、滅蠅胺、氯吡脲、吡唑醚菌酯，檢出率為2.0%~11.2%，殘留含量為0.011~0.345 mg/kg，其中3 份姜中2 種農(nóng)藥超出了最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

采用QuEChERS 前處理法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，建立了生姜中多種農(nóng)藥及代謝物殘留的同時(shí)檢測(cè)方法。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，各農(nóng)藥LOD 為1~3 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線r≥0.995，平均回收率為71.9%~102.2%，RSD 為1.1%~8.9%；能夠滿足生姜中多種農(nóng)藥及代謝物殘留的快速檢測(cè)需要。所建立檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、高效靈敏、準(zhǔn)確，可為生姜中相關(guān)農(nóng)藥及代謝物殘留監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。