何曉梅, 倪夢(mèng)茹, 汪軍杰, 朱健忠, 宋 程, 侯雪芹, 劉昌利

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012;2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室,安徽 六安 237012)

中藥黃精為百合科黃精屬草本植物多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)、滇黃精(PolygonatumkingianumColl et Hemsl)和黃精(PolygonatumsibircumDelar. ex Redoute)的干燥根狀莖,是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,收錄于《中國(guó)藥典》2020年版一部[1]。其性甘味平,具有補(bǔ)氣益腎、健脾益精、滋陰潤(rùn)肺、延年益壽的功效[2],含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿、醌類化合物、植物甾醇、木脂素、酚類、氨基酸和微量元素等[3]成分,具有抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗衰老、保護(hù)腎功能、改善記憶力等[4-5]藥理作用;此外,黃精的塊莖可以制成茶或藥酒,或與肉類一起烹飪[6],因此黃精是具有藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的藥食同源植物[7]。目前對(duì)黃精生物活性成分的研究主要集中于多糖,包括黃精多糖的提取、純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)分析及藥理評(píng)價(jià)[8-9],而通過水提、醇沉、離心、洗滌,獲得醇沉物(制備黃精多糖的原料)后,上清部分棄之不用。研究表明黃精水提物中含有較多的黃酮和酚類物質(zhì)[10-12],而黃酮和酚類物質(zhì)是植物中廣泛存在的抗氧化活性成分。多花黃精主產(chǎn)于貴州、湖南、安徽、云南、浙江、福建等省,生長(zhǎng)于山地林下、灌叢或山坡的半蔭處。近年來,由于市場(chǎng)對(duì)中藥黃精需求量的增加,引發(fā)藥農(nóng)過度采挖,導(dǎo)致野生黃精資源瀕臨枯竭,同時(shí)黃精的品質(zhì)和產(chǎn)量還受其生長(zhǎng)環(huán)境和栽培方式的影響[13]。基于上述原因,當(dāng)前大別山區(qū)林下栽培多花黃精的產(chǎn)量已經(jīng)提高很多,開展黃精深加工,提高產(chǎn)品附加值,積極推進(jìn)大別山區(qū)黃精產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。本研究以大別山林下仿野生多花黃精為研究對(duì)象,通過水提醇沉洗滌分別獲得醇沉物和上清液濃縮冷凍干燥干粉,測(cè)定醇沉物和上清干粉中多糖、總酚和黃酮含量,以還原力和清除自由基能力為指標(biāo),探究二者的抗氧化活性,旨在篩選最佳活性部位,為進(jìn)一步研究和利用多花黃精作為天然抗氧化劑提供理論依據(jù),也為提高多花黃精的附加值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

多花黃精(金寨潤(rùn)元生物科技有限公司);葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司);2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,上海蓓瑯生物科技有限公司);L-抗壞血酸(Vc,索萊寶科技有限公司);1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH,上海鼓臣生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-5200紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DD5型臺(tái)式大容量低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司);FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多花黃精提取物制備 將多花黃精根、莖粉末水提溶液醇沉、離心、洗滌后獲得黃精醇沉物和上清液[14],其中,黃精醇沉物揮干乙醇后用適量蒸餾水溶解,置于-20 ℃保存,醇沉上清液減壓濃縮到一定體積,置于-20 ℃冰箱冷凍,然后將凍實(shí)的二者置于冷凍干燥機(jī)(-60 ℃,20 Pa)冷凍干燥得醇沉物和上清干粉,備用。

1.2.2 提取物各組分含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量[15],建立葡萄糖濃度(x)-吸光度(y)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程：y=7.691x+0.098,R2=0.997 4,葡萄糖質(zhì)量濃度在0～0.10 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。采用FoLin-CiocaLteu比色法測(cè)定總酚含量,建立沒食子酸質(zhì)量濃度(x)-吸光度(y)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程：y=0.018x+0.028 2,R2=0.991 7,沒食子酸質(zhì)量濃度在0～50 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定總黃酮含量,建立蘆丁質(zhì)量濃度(x)-吸光度(y)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程：y=1.358 7x+0.000 8,R2=0.991 7,蘆丁質(zhì)量濃度在0～0.10 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 提取物各組分含量測(cè)定 分別配制合適質(zhì)量濃度的醇沉物和上清干粉溶液,與各標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制同法依次測(cè)定各樣品溶液中多糖、總酚和總黃酮吸光度(OD584 nm、OD763 nm、OD510 nm),代入回歸方程計(jì)算出各樣品中多糖、總酚和總黃酮的含量。

1.2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 鐵離子還原能力測(cè)定 向試管中依次加入0.2～2.0 mL待測(cè)液(30 μg/mL Vc溶液、10 mg/mL醇沉物溶液、2 mg/mL上清干粉溶液),加PBS(pH 6.6)至3.0 mL,加1.5 mL 10%(g/mL)鐵氰化鉀溶液,旋渦混合后于50 ℃水浴20 min,迅速水浴冷卻至室溫,加1.5 mL 10%(V/V)三氯乙酸、2.5 mL無水乙醇、0.3 mL 0.1%三氯化鐵溶液,旋渦混合后靜置5 min。于700 nm下測(cè)各樣品吸光度,重復(fù)3次取平均值[16]。樣品還原能力強(qiáng)弱以吸光度大小表示。

1.2.3.2 ABTS+·清除能力測(cè)定 精密配制7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液,等體積混合后避光反應(yīng)12 h以上,得ABTS+·儲(chǔ)備液[17]。將儲(chǔ)備液稀釋10倍至734 nm下吸光度為0.700±0.020,即得ABTS+·工作液。取干凈試管,向每組試管中分別加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL待測(cè)液(40 μg/mL Vc溶液、20 mg/mL醇沉物溶液、40 mg/mL精制多糖溶液、5 mg/mL上清干粉溶液),加去離子水至1.0 mL,加ABTS+·工作液5.0 mL,混勻后避光反應(yīng)10 min,于734 nm下測(cè)吸光度。記0號(hào)組吸光度為A0,1～10組吸光度為An(n取1～10),計(jì)算各組樣品清除率,取平均值。

1.2.3.3 DPPH·清除能力測(cè)定 取干凈試管,向每組試管中分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL待測(cè)液(20 μg/mL Vc溶液、10 mg/mL醇沉物溶液、30 mg/mL精制多糖溶液、2 mg/mL上清干粉溶液),加去離子水至2.0 mL,加2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液,混勻后避光反應(yīng)30 min,于517 nm測(cè)吸光度。記0組吸光度為A0,1～10組吸光度為An(n取1～10),計(jì)算各組樣品清除率,取平均值[18]。

1.2.4 抗氧化能力 分別計(jì)算半抑制濃度(IC50)、半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)和自由基清除能力(AE),比較醇沉物和上清干粉的抗氧化能力[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物得率及其主要活性成分含量

由醇沉物和上清干粉二者得率可知(表1),多花黃精水溶性物質(zhì)得率達(dá)到58.45%,其中醇沉物得率約為上清干粉得率的2.5倍。醇沉物和上清干粉中都含有較高含量的多糖,且上清干粉中多糖含量高于醇沉物,可能還有較多的多糖溶于乙醇溶液而沒有沉淀于醇沉物中[20]。因此,上清干粉中總酚、黃酮含量均高于醇沉物。

表1 提取物得率及其主要活性成分含量Table 1 Extraction yield and content of its main active components

2.2 抗氧化活性研究

2.2.1 鐵離子還原能力 還原性物質(zhì)將鐵氰化鉀中的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵,產(chǎn)生亞鐵氰化鉀,游離的Fe3+與亞鐵氰化鉀結(jié)合生成藍(lán)色的普魯士藍(lán),在700 nm下產(chǎn)生最大吸收。相同條件下,不同濃度與種類的還原性物質(zhì)還原產(chǎn)生亞鐵氰化鉀的多少,體現(xiàn)了還原能力的強(qiáng)弱,并通過與Fe3+結(jié)合后的吸光度大小體現(xiàn)出來,吸光度越大還原能力越強(qiáng)[21]。以Vc為陽性對(duì)照,各樣品對(duì)鐵離子還原能力測(cè)定結(jié)果如圖1～3,各樣品的還原能力均隨著濃度增加而呈上升趨勢(shì)。由此可知,各樣品總還原能力大小為：Vc>上清干粉>醇沉物。

圖1 Vc對(duì)鐵離子的還原能力Fig.1 Reduction ability of VC to Fe3+

圖2 醇沉物對(duì)鐵離子的還原能力Fig.2 Reduction ability of alcohol precipitates to Fe3+

圖3 上清干粉對(duì)鐵離子的還原能力Fig.3 Reduction ability of supernatant dry powder to Fe3+

2.2.2 ABTS+·清除能力 ABTS與強(qiáng)氧化劑反應(yīng),可以生成藍(lán)綠色的ABTS+·,該自由基在734 nm處有最大紫外吸收。ABTS+·與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)后變成無色,向一定濃度ABTS+·溶液中加入抗氧化物質(zhì),通過吸光度的減小值判斷被清除自由基的多少,從而評(píng)價(jià)物質(zhì)的體外抗氧化能力[22]。由圖4～6及表2可知,在研究的濃度范圍內(nèi),各樣品對(duì)ABTS+·清除能力先隨著濃度增加呈線性增強(qiáng),再趨于平緩。Vc、醇沉物、上清干粉的IC50分別為12.27 μg/mL、10.8 mg/mL、1.8 mg/mL;AE值(mL/μg)分別為8.24×10-2、1.05×10-4、5.88×10-4;通過比較可知,各樣品清除ABTS+·能力大小為：Vc>上清干粉>醇沉物。

圖4 Vc對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging ability of Vc to ABTS+·

圖5 醇沉物對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.5 The scavenging ability of alcohol precipitates to ABTS+·

圖6 上清干粉對(duì)ABTS+·的清除能力 Fig.6 The scavenging ability of supernatant dry powder to ABTS+·

表2 ABTS+·清除能力比較Table 2 Comparison of ABTS+·scavenging capacity

2.2.3 DPPH·清除能力 DPPH·是一種性質(zhì)穩(wěn)定的自由基,在517 nm波長(zhǎng)下有最大吸收,常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的體外抗氧化能力。DPPH·乙醇溶液呈紫色,在與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)后變成無色物質(zhì)。通過在一定濃度的DPPH溶液中加入抗氧化物質(zhì),再通過測(cè)定溶液在517 nm下吸光度大小衡量剩余自由基的量而計(jì)算出被清除的自由基的量,從而評(píng)價(jià)物質(zhì)的體外抗氧化能力[23]。如圖7～9及表3所示,各樣品清除DPPH·能力先隨著濃度增加呈線性增強(qiáng),再趨于平緩。Vc、醇沉物、上清干粉的IC50分別為4.07 μg/mL、6.6 mg/mL、0.5 mg/mL;AE(mL/μg)分別為2.86×10-1、2.54×10-4、2.23×10-3,通過比較可知,各樣品清除DPPH·能力大小為：Vc>上清干粉>醇沉物。

圖7 Vc對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 The scavenging ability of Vc to DPPH·

圖8 醇沉物對(duì)DPPH·的清除能力Fig.8 The scavenging ability of the alcohol precipitate to DPPH·

圖9 上清干粉對(duì)DPPH·的清除能力Fig.9 The scavenging ability of the supernatant dry power to DPPH·

表3 DPPH·清除能力比較Table 3 DPPH·scavenging capacity comparison

3 結(jié)論與討論

本研究在分析多花黃精醇沉物及醇沉上清的物質(zhì)組成基礎(chǔ)上,測(cè)定了醇沉物及醇沉上清干粉的抗氧化活性。結(jié)果表明,醇沉上清干粉中多糖、黃酮和總酚含量均高于醇沉物;且醇沉物和上清干粉的抗氧化能力有較大的差別,相同濃度的上清干粉抗氧化能力高于醇沉物;低濃度使用時(shí),上清干粉抗氧化能力不及Vc,但隨濃度增加,其還原能力及抗氧化能力逐漸增強(qiáng),基本和Vc相當(dāng)。

目前,多花黃精研究較多的為大分子多糖和甾體皂苷。糖類分為單糖、低聚糖、多糖及其衍生物,是中藥中廣泛存在的成分,但在研究多糖時(shí)由于醇沉后棄上清而得不到充分利用。黃酮類化合物是一類廣泛分布于植物體內(nèi)的次生代謝物,在黃精屬植物中分離出了6種,研究較多的為高異黃酮類[24],其他成分有待研究。隨著天然活性物質(zhì)藥用的逐漸興起,植物多酚作為一種源于綠色植物的生物材料將被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健等多個(gè)領(lǐng)域,然而,關(guān)于黃精中總酚的研究鮮有報(bào)道。綜上,無論是多花黃精醇沉物還是上清干粉中都含有黃酮和總酚,二者抗氧化活性的發(fā)揮可能與它們的協(xié)同作用有關(guān),另外,根據(jù)醇沉物和上清干粉中多糖含量及獲得的途徑,其組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)可能不同,有待進(jìn)一步研究。