宋曉東,吳秋月,朱培冉,劉雪艷1,,周宏健,李衛(wèi)巍,夏欣一(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 1013;. 中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,南京 1000;3. 連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇連云港 000)

角膜營養(yǎng)不良癥是一組少見的且與家族性遺傳相關(guān)的原發(fā)性雙側(cè)致盲性角膜疾病,患者一般伴有眼部疼痛、有刺激癥狀、暫時(shí)性視力模糊、視力下降、虹視和霧視等臨床癥狀。目前,在約50%的角膜營養(yǎng)不良病例中發(fā)現(xiàn)了特定的遺傳背景?，F(xiàn)已證實(shí)有33個(gè)致病基因與角膜營養(yǎng)不良有關(guān),包括角蛋白(keratin 3,KRT3)、磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol-3-phosphate5-kinase type,PIP5K3)、鋅指蛋白1(zinc finger protein 1,ZFP1)、轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因(pransforming growth factor beta inducer gene,TGFBI)等[1]。研究證實(shí),顆粒狀角膜營養(yǎng)不良、Thiel-Behnke角膜營養(yǎng)不良、Reis-Bücklers角膜營養(yǎng)不良和格子狀角膜營養(yǎng)不良等均可由TGFBI基因突變引起,這些疾病均以常染色體顯性遺傳方式遺傳[2]。角膜營養(yǎng)不良相關(guān)致病基因的分子遺傳學(xué)研究對(duì)臨床診斷起到積極的指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料 先證者(Ⅲ-1),男,42歲,因3年前出現(xiàn)角膜炎反復(fù)發(fā)作,左眼視力漸進(jìn)性下降,于2016年7月中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院眼科就診?；颊吲加醒鄄坎贿m,無惡心嘔吐、頭痛、頭暈,無黑影飄動(dòng)、視物變形、暗點(diǎn)、視野缺損、無眼前閃光感、眩光、眩暈等現(xiàn)象。左眼視力0.02,雙眼結(jié)膜無充血,前房深淺正常,房水清,虹膜紋理清,色正常,瞳孔圓,直徑2.9 mm,對(duì)光反射靈敏,晶體尚透明,眼底窺視不清,裂隙燈下角膜中央部呈輕度彌漫性混濁,上皮層有不規(guī)則的分支狀白色細(xì)條和混濁點(diǎn),交織成網(wǎng)絡(luò)狀,臨床確定診斷為格子狀角膜營養(yǎng)不良。先證者奶奶(Ⅰ-2)、父親(Ⅱ-1)也伴有視力下降等眼部不適。家系中的患者除上述眼部角膜異常外,均無其他全身疾病或異常。家系內(nèi)正常成員未檢出眼部及其他相關(guān)系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2023DZGZR-035),各研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及DNA提取 使用EDTA-K2抗凝采血管通過肘部靜脈采血的方式采集家系成員血液樣本3 mL,按照DNA提取試劑盒說明書提取外周血DNA樣本,并置于-80 ℃保存。

1.2.2全外顯子組測序 將先證者DNA樣本送至北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心公司進(jìn)行全外顯子組高通量測序。用Burrow-Wheeler比對(duì)工具將測序讀數(shù)與人類參考基因組(HG19/GRCh37)進(jìn)行比對(duì)。利用Verita Trekker@變異位點(diǎn)檢測系統(tǒng)和Enliven@變異位點(diǎn)注釋解讀系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3PCR擴(kuò)增 查詢美國國立生物技術(shù)信息中心官方網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取TGFBI全基因序列,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)TGFBI基因4號(hào)外顯子和8號(hào)外顯子的引物序列,Exon 4上游引物序列:5′-CCCCAGAGGCCATCCCTCCT-3′,下游引物序列:5′-CCGGGCAGACGGAGGTCATC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為225 bp,引物Tm值為56.5 ℃;Exon 8上游引物序列:5′-GTGACCTGAGTCTGTTTGG-3′,下游引物序列:5′-GAAGTCGCCCAAAGATCTCT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為342 bp,引物Tm值為52 ℃。引物均由上海華大基因公司合成。以基因組DNA為模板擴(kuò)增TGFBI基因。PCR反應(yīng)混合物為25 μL,包括10×緩沖液2.5 μL,2.5 mmol/L MgCl21.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL, 700 ng/L DNA模板2 μL, 5 U/μL Taq聚合酶0.25 μL, ddH2O 14.75 μL。循環(huán)參數(shù):95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,57～62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,通過20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所得PCR產(chǎn)物,采用凝膠電泳成像系統(tǒng)檢測目的片段大小,以判定目的PCR產(chǎn)物。

1.2.4Sanger測序及序列比對(duì) 取PCR產(chǎn)物送深圳華大基因測序公司進(jìn)行突變位點(diǎn)的Sanger測序,使用BLAST序列分析工具將測序結(jié)果與GenBank中記錄的野生型TGFBI基因序列進(jìn)行比較,確定突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1先證者家系遺傳特征 角膜營養(yǎng)不良癥在該家系中世代連續(xù)傳遞,系譜分析符合常染色體顯性遺傳的特征,見圖1。

注:□為男性,○為女性,■為男性患者,●為女性患者,↗為先證者。圖1 先證者家系圖譜

2.2全外顯子組測序結(jié)果 經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn),先證者TGFBI基因(位于5號(hào)染色體)有2個(gè)與角膜營養(yǎng)不良相關(guān)性較高的變異,其中1個(gè)變異是4號(hào)外顯子c.370C>T(p.R124C)雜合突變,即TGFBI基因的第370位堿基由C變?yōu)門,密碼子由CGC變?yōu)門GC,編碼第124位氨基酸由精氨酸R變?yōu)榘腚装彼酑;另1個(gè)變異是8號(hào)外顯子c.1007A>T(p.E336V)雜合突變,即TGFBI基因的第1 007位堿基由A變?yōu)門,密碼子由AGC變?yōu)門GC,編碼第336位氨基酸由谷氨酸E變?yōu)槔i氨酸V,見表1。

表1 先證者全外顯子組測序結(jié)果

2.3Sanger測序驗(yàn)證 先證者在TGFBI基因上發(fā)生c.370C>T(p.R124C)和c.1007A>T(p.E336V)2個(gè)雜合突變。先證者父親(Ⅱ-1)、家系其他家系成員(Ⅰ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-7、Ⅱ-9、Ⅲ-1、Ⅲ-3、Ⅲ-7、Ⅲ-11、Ⅲ-14、Ⅳ-2)患者通過Sanger測序僅發(fā)現(xiàn)了TGFBIc.370C>T(p.R124C)雜合突變。先證者母親和其余家系正常成員經(jīng)Sanger測序未檢測出TGFBI基因突變(圖2、3)。

注:A,先證者(Ⅲ-1)Sanger測序圖;B,先證者父親(Ⅱ-1)和家系其他患者Sanger測序圖;A、B均提示TGFBI基因4號(hào)外顯子c.370C>T雜合突變;C,先證者母親(Ⅱ-2)和家系正常成員Sanger測序圖,提示TGFBI基因4號(hào)外顯子無突變。圖2 TGFBI基因4號(hào)外顯子c.370C>T(p.R124C)位點(diǎn)驗(yàn)證

注:A,先證者(Ⅲ-1)Sanger測序圖,提示TGFBI基因8號(hào)外顯子c.1007A>T雜合突變;B,先證者父親(Ⅱ-1)和家系其他患者Sanger測序圖,提示無突變;C,先證者母親(Ⅱ-2)和家系正常成員Sanger測序圖,提示無突變。圖3 TGFBI基因8號(hào)外顯子c.1007A>T(p.E336V)位點(diǎn)驗(yàn)證

3 討論

TGFBI基因是由Skonier等[3]首次分離出來的,并被其鑒定為人肺腺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因,位于第5號(hào)染色體的長臂上(5q31),所編碼的蛋白質(zhì)在皮膚和角膜組織中起重要作用。自Munier等[4]首次報(bào)道TGFBI基因突變導(dǎo)致常染色體顯性遺傳角膜營養(yǎng)不良,目前已發(fā)現(xiàn)多種不同突變與角膜營養(yǎng)不良有關(guān)[1]。TGFBI基因連鎖角膜營養(yǎng)不良的典型臨床表現(xiàn)為雙側(cè)眼角膜透明度逐漸喪失,常導(dǎo)致角膜糜爛復(fù)發(fā),視力受損[5]。本研究中先證者和家系中其他患者的癥狀也驗(yàn)證了該報(bào)道的結(jié)果。

本研究中先證者檢出TGFBIc.370C>T(p.R124C)雜合突變,與既往報(bào)道角膜營養(yǎng)不良突變基因檢測的研究結(jié)果[6-7]相吻合,提示R124代表了常染色體顯性角膜營養(yǎng)不良患者基因組中的突變熱點(diǎn)。TGFBIc.370C>T(p.R124C)雜合突變通常為常染色體顯性遺傳,即代表父母一方至少有一人是該基因攜帶者,或是該患者自身基因發(fā)生了突變。本研究對(duì)先證者父母及其家系成員進(jìn)行了基因檢測,其父親和家系中患者為TGFBIc.370C>T(p.R124C)雜合突變信息攜帶者,而其母親和家系中健康成員基因檢測未見該突變,由此可判斷遺傳共分離。上述結(jié)論得到了國內(nèi)另一項(xiàng)研究的支持[8],該研究報(bào)道了中國3個(gè)家系患者均存在TGFBI基因突變且均發(fā)生在密碼子R124位點(diǎn),TGFBI基因突變與疾病表型在3個(gè)家系中共分離。本研究中先證者的基因檢測還顯示了TGFBIc.1007A>T(p.E336V)雜合突變,但是在Sanger測序驗(yàn)證中,該家系其余患者均未檢測到此基因突變,因而TGFBIc.1007A>T(p.E336V)突變?cè)诩蚁抵胁淮嬖谂c表型共分離現(xiàn)象,排除其致病可能性。

目前角膜營養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,其可能的解釋是突變位點(diǎn)導(dǎo)致TGFBI基因編碼的角膜上皮素(kerato-epithelin,KE)構(gòu)象改變,從而發(fā)生酶解反應(yīng),其降解產(chǎn)物誘導(dǎo)角膜成纖維細(xì)胞凋亡,異常角膜自噬功能不良,不能清理KE蛋白或其降解產(chǎn)物,從而導(dǎo)致病理性淀粉樣蛋白沉積物特異性在角膜堆積,引起一系列臨床癥狀[9]。Kitamoto等[2]建立TGFBI-R124C突變小鼠模型以表征人類角膜營養(yǎng)不良,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFBI蛋白在純合子TGFBI-R124C突變小鼠的角膜沉積顯著增加,證實(shí)了該突變蛋白的致病作用;小鼠角膜上皮傷口愈合明顯延遲,解釋了角膜營養(yǎng)不良患者角膜上皮反復(fù)糜爛的表現(xiàn)。

綜上所述,本研究通過對(duì)1個(gè)角膜營養(yǎng)不良家系進(jìn)行突變鑒定,發(fā)現(xiàn)了TGFBIc.370C>T(p.R124C)雜合突變是導(dǎo)致該家系發(fā)病的原因。該病例豐富了江蘇地區(qū)角膜營養(yǎng)不良基因變異與臨床表型譜,基因檢測為角膜營養(yǎng)不良癥的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷以及未來可能開展的基因治療提供了依據(jù)[10]。本研究尚有不足之處,未來仍需要探尋TGFBI基因突變導(dǎo)致角膜營養(yǎng)不良癥形成和病程發(fā)展的機(jī)制。