劉海濤,侯金鳳,寇晉萍,劉琦,齊麟（北京市藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

門冬氨酸鳥氨酸為L-鳥氨酸和L-門冬氨酸通過化學(xué)合成制備得到的穩(wěn)定的二肽化合物。該品能直接參與肝細胞代謝，并能激活肝臟解毒功能中的兩個關(guān)鍵酶，從而有效地改善肝功能，恢復(fù)機體能量平衡。主要用于治療因急慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎等所致的高血氨癥[1]。門冬氨酸鳥氨酸最早于20世紀70年代在德國用于臨床，并被美國FDA批準用于治療肝性腦病。目前常用的劑型有粉針劑、顆粒劑、注射液，其中顆粒劑適用于患者早期及日常治療，服用方便，安全有效[2]。

門冬氨酸鳥氨酸本身紫外吸收較弱，其含量通常采用柱前衍生HPLC法[3]測定，這種方法對于輔料較多的顆粒劑中有關(guān)物質(zhì)的檢查不太適合，一方面因為衍生試劑干擾較大，另一方面是衍生后產(chǎn)物不穩(wěn)定，影響準確性。也有文獻采用HPLC法測定門冬氨酸鳥氨酸原料、注射劑有關(guān)物質(zhì)的報道[4-5]，但顆粒劑有關(guān)物質(zhì)的報道基本沒有。鑒于此，本文通過對門冬氨酸鳥氨酸基于合成路線的雜質(zhì)譜分析，嘗試建立了使用氨基柱HPLC方法測定門冬氨酸鳥氨酸顆粒有關(guān)物質(zhì)，明確了需要重點關(guān)注的非工藝雜質(zhì)，新方法能夠保證主成分與雜質(zhì)及輔料良好分離，雜質(zhì)檢出限均小于供試品濃度的0.002%，故而具有靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點。具體報道如下。

1 儀器與試藥

儀器與試藥具體內(nèi)容見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 雜質(zhì)譜分析

2.1.1 工藝雜質(zhì)分析 門冬氨酸鳥氨酸的合成路線見圖1。從門冬氨酸鳥氨酸的合成路線可以看出，起始原料富馬酸可能由于反應(yīng)不充分而殘留在終產(chǎn)品中，因此將其定為工藝雜質(zhì)。馬來酸為起始原料富馬酸的同分異構(gòu)體，蘋果酸為L-天冬氨酸制備過程中可能產(chǎn)生的副產(chǎn)物，精氨酸為L-鳥氨酸制備過程中可能產(chǎn)生的副產(chǎn)物，MNA-III則作為最后一步中和反應(yīng)的副產(chǎn)物，均定為工藝雜質(zhì)。

圖1 門冬氨酸鳥氨酸合成路線圖

2.1.2 降解雜質(zhì)分析 L-鳥氨酸分子結(jié)構(gòu)中的5-位氨基在酸堿及高溫等條件下進攻羧酸發(fā)生分子內(nèi)的關(guān)環(huán)反應(yīng)得到MNA-I。具體產(chǎn)生機理見圖2。

圖2 MNA-I的降解機理圖

L-天冬氨酸分子結(jié)構(gòu)中的氨基進攻另一分子結(jié)構(gòu)中的4-位羧基發(fā)生分子間的縮合反應(yīng)得到MNA-II。具體產(chǎn)生機理見圖3。

圖3 MNA-II的降解機理圖

由原料藥的合成工藝研究可知，馬來酸、蘋果酸、精氨酸、富馬酸均為門冬氨酸鳥氨酸合成工藝中的工藝雜質(zhì)，因此在原料藥中進行研究和控制，不在制劑中進行控制。MNA-III雖然定為工藝雜質(zhì)，但研究中發(fā)現(xiàn)高溫條件下該雜質(zhì)有增大趨勢，因此將其在制劑中進行研究，但不作為特定雜質(zhì)控制。由原料藥和制劑的雜質(zhì)分析及質(zhì)量研究可知，MNA-I和MNA-II為門冬氨酸鳥氨酸的降解雜質(zhì)，且在制劑的影響因素試驗高溫條件中，MNA-I的含量有所增長，故不僅在原料藥中控制，還要在制劑中研究與控制。

2.2 有關(guān)物質(zhì)檢查方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil XBP-NH2（250×4.6mm，5μm）；流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液[取磷酸二氫鉀2.72g，加水500ml溶解后，加入濃氨溶液5ml，用水稀釋至1000ml，混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH值至（5.60±0.05）]-乙腈（40∶60）；柱溫：30℃；流速：1.3ml/min；UV檢測器（檢測波長205nm）；進樣量：20μl。

2.2.2 溶液的制備及測定法 系統(tǒng)適用性溶液：取門冬氨酸鳥氨酸、MNA-Ⅰ、MNA-Ⅱ、MNA-Ⅲ對照品各適量，精密稱定，分別加流動相定量稀釋制成每1ml中約含門冬氨酸鳥氨酸4mg、MNA-Ⅰ12μg、MNA-Ⅱ6μg、MNA-Ⅲ 8μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

供試品溶液：取本品10袋，精密稱定，計算平均裝量。研細，取細粉適量（約相當(dāng)于門冬氨酸鳥氨酸0.4g），精密稱定，置100ml量瓶中，加0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液40ml使其溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。測定法：精密量取對照溶液20μl，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的5%-10%；精密量取對照品混合溶液和供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至門冬氨酸保留時間的6倍。系統(tǒng)適用性及供試品溶液的典型色譜圖見圖4和圖5。

圖4 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖（1為MNA-Ⅲ峰，2為MNA-Ⅰ峰，3為門冬氨酸峰，4為鳥氨酸峰，5為MNA-Ⅱ峰）

圖5 供試品溶液色譜圖（1為輔料峰，2為未知雜質(zhì)峰，3為MNA-Ⅰ峰，4為鳥氨酸峰，5為MNA-Ⅱ峰）

2.2.3 方法學(xué)考察 專屬性試驗：各峰間分離度大于1.5，符合要求。所用輔料在該測定條件下對雜質(zhì)檢查無干擾。門冬氨酸鳥氨酸原料、國內(nèi)產(chǎn)品和原研產(chǎn)品，在所設(shè)計的酸、堿、氧化和高溫降解條件下均不穩(wěn)定，MNA-I含量均有所增長，堿和氧化條件下降解較為劇烈，MNA-I含量增長較多，并產(chǎn)生較大（大于1%）的未知雜質(zhì)。在光照破壞條件下穩(wěn)定，此色譜條件能將新增雜質(zhì)與主峰完全分離；主峰峰純度合格；物料守恒。方法專屬性強。線性關(guān)系考察：取門冬氨酸鳥氨酸雜質(zhì)MNA-I、MNA-II和MNAIII對照品各適量，用流動相溶解并稀釋制成每1ml含各組分約0.04mg的溶液，作為混合母液；精密量取混合母液1ml、8ml、2ml、3ml、4ml和8ml，分別置20ml、100ml、20ml、20ml、20ml、20ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別作為雜質(zhì)線性1-6號溶液。取混合母液，直接作為雜質(zhì)線性7號溶液。精密量取上述溶液各20μl，注入液相色譜儀，按初步擬定的有關(guān)物質(zhì)方法測定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸。門冬氨酸鳥氨酸在4.055-81.106μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=2786x+565.2，r=0.9992；MNA-Ⅰ在2.099-41.982μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=39280x-5615，r=0.9999；MNA-Ⅱ在1.864-37.285μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=16708x-3300，r=0.9999；MNA-Ⅲ在1.989-39.788μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=9189x-512.3，r=0.9999；當(dāng)有關(guān)物質(zhì)檢查時，門冬氨酸鳥氨酸對照溶液濃度為8μg/ml，MNA-I限度濃度為12μg/ml，MNA-II限度濃度為6μg/ml，MNA-Ⅲ限度濃度為8μg/ml，均滿足測定要求。

檢測限考察：取對照品溶液逐級稀釋，測定各組分檢測限，MNA-I檢測限為0.414ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.00021%；MNA-Ⅱ檢測限為3.880ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.00194%；MNA-Ⅲ檢測限為0.793ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.00040%；門冬氨酸檢測限為20.118ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.01006%；鳥氨酸檢測限為80.471ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.04024%；各雜質(zhì)檢測限信噪比均約為3，符合要求。

定量限考察：取對照品溶液逐級稀釋，測定各組分定量限，MNA-I定量限為2.068ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.00103%；MNA-Ⅱ定量限為7.761ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.00388%；MNA-Ⅲ定量限為1.587ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.00079%；門冬氨酸定量限為40.236ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.02012%；鳥氨酸定量限為160.942ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.08047%；各雜質(zhì)定量限信噪比均約為10，符合要求。

溶液穩(wěn)定性：對照品混合溶液進行溶液穩(wěn)定性考察，結(jié)果在25.2h內(nèi)，各成分峰面積的RSD均小于2.0%，說明對照品混合溶液在25.2h內(nèi)穩(wěn)定； 國產(chǎn)顆粒、國外市售Hepa-Merz?顆粒供試品溶液穩(wěn)定性考察，結(jié)果在25.2h內(nèi)均未檢出新雜質(zhì)，且各已有雜質(zhì)含量均沒有明顯變化，說明供試品溶液在25.2h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足檢測要求。

準確度考察：各雜質(zhì)高、中、低不同濃度回收率均在85%-115%之間；MNA-I回收率平均值為98.3 %，RSD為3.23%，小于5.0%；MNA-II回收率平均值為111.2%，RSD為2.00%，小于5.0%；MNA-III回收率平均值為98.7%，RSD為4.97%，小于5.0%；各雜質(zhì)高、中、低不同濃度回收率均在85%-115%之間，說明方法準確度較高。

系統(tǒng)適用性：取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)測定6次，各峰間的分離度均大于1.5，出峰順序依次為MNA-III、MNA-I、門冬氨酸、鳥氨酸與MNA-II。說明系統(tǒng)適用性符合要求。

耐用性考察：取系統(tǒng)適用性溶液，調(diào)整色譜條件后進樣測定，流速為1.1-1.5ml/min，柱溫為25℃-35℃，流動相pH為5.4-5.8，流動相緩沖液與乙腈的比例為43∶57-37∶63范圍內(nèi)，各雜質(zhì)間分離度符合要求，方法耐用；換用不同品牌色譜柱時，系統(tǒng)適用性溶液中MNA-Ⅰ與門冬氨酸峰無法分離，說明本方法對不同品牌色譜柱不耐用。色譜柱的品牌推薦Agela Venusil XBPNH2。為保證各組分峰保留時間的穩(wěn)定，將pH值嚴格控制在（5.60±0.05）范圍內(nèi)。

3 討論

3.1 雜質(zhì)譜分析中可以看到，MNA-Ⅰ（L-鳥氨酸內(nèi)酰胺）為L-鳥氨酸分子內(nèi)的關(guān)環(huán)反應(yīng)生成，MNA-II為L-天冬氨酸分子間的縮合反應(yīng)生成，分子內(nèi)的關(guān)環(huán)反應(yīng)在通常的酸堿環(huán)境或高溫條件下即可發(fā)生，分子間的縮合反應(yīng)生成則需要較為苛刻的催化條件，因此雜質(zhì)MNA-Ⅰ是門冬氨酸鳥氨酸原料和制劑中產(chǎn)生的主要已知雜質(zhì)，應(yīng)對其重點關(guān)注。

3.2 顆粒劑通常會使用較多的粘合劑和矯味劑，酸堿變化會導(dǎo)致雜質(zhì)MNA-Ⅰ的生成，因此盡量避免使用可能會顯著改變pH值的輔料，選擇較為中性溫和的粘合劑和矯味劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、無水枸櫞酸、甘露醇、草莓香精等。

3.3 有關(guān)物質(zhì)檢查法的選擇：目前可選擇的方法有中國藥典2020年版門冬氨酸鳥氨酸原料有關(guān)物質(zhì)測定法以及門冬氨酸鳥氨酸原料藥生產(chǎn)商廠家標(biāo)準中有關(guān)物質(zhì)檢測方法，中國藥典2020年版門冬氨酸鳥氨酸原料標(biāo)準方法中，各峰間分離度最小為6.11，而原料藥生產(chǎn)商廠家標(biāo)準方法中，門冬氨酸與MNA-II分離度為1.05，不能有效分離。故參考中國藥典2020年版門冬氨酸鳥氨酸原料標(biāo)準擬定本品的有關(guān)物質(zhì)檢測方法。

3.4 色譜柱的選擇 在實驗過程中曾分別試驗過waters NH2（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo NH2（250mm×4.6mm，5μm）等各主要品牌的氨基色譜柱，但分離效能均沒有Agela Venusil XBP-NH2（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱效果好，方法學(xué)考察耐用性試驗中也可以看到，其他品牌色譜柱均不能使MNA-Ⅰ與門冬氨酸有效分離，因此本方法推薦使用Agela Venusil XBP-NH2色譜柱。

3.5 我國作為仿制藥大國，仿制藥質(zhì)量參差不齊，對藥品的安全性和有效性評價造成了嚴重影響。為全面提高仿制藥的內(nèi)在品質(zhì)和制藥企業(yè)的綜合能力，同時確保人民用藥安全，并降低醫(yī)療費用的支出，開展仿制藥一致性評價工作十分必要。本研究建立的有關(guān)物質(zhì)測定法同時考察了原料藥、國內(nèi)顆粒和原研顆粒在強制降解條件下的雜質(zhì)變化情況，并測定了國內(nèi)顆粒和原研顆粒的樣品結(jié)果，為門冬氨酸鳥氨酸顆粒劑的一致性評價工作提供了重要的方法依據(jù)。