李 麗,馮 旭,賀付蒙,馮珊珊,李鳳蘭,胡寶忠,2,徐永清

(1.東北農業(yè)大學生命科學學院, 黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈爾濱學院,黑龍江哈爾濱 150086)

擴展蛋白(expansin)是一類具有非水解活性的細胞壁松弛蛋白,于1992年由Mcqueen等在黃瓜(Cucumissativus)的下胚軸中首次被發(fā)現[1-2]。植物擴展蛋白可分為EXPA、EXPB、EXLA和EXLB四個亞家族,由信號肽、結合區(qū)和催化區(qū)組成[3]。研究表明,擴展蛋白不僅參與植物的發(fā)育進程(細胞生長、組織分化、根毛發(fā)生、花粉管伸長、果實軟化等[4-6]),而且也參與植物對干旱、低溫等逆境脅迫響應過程,如低溫脅迫下,西葫蘆(Cucurbita pepo)和矮牽牛(Petunia hybrida)中擴展蛋白基因的表達量顯著增加[7-8];大麥(Hordeum vulgare)中擴展蛋白基因HvEXPB7受干旱脅迫誘導表達,以促進根毛生長的作用方式提高植株的干旱脅迫耐受性[9];白菜(Brassica rapa)擴展蛋白基因BrEXLB1的過表達植株中,該基因的表達與營養(yǎng)生長期的耐旱性和光合作用呈正相關[10]。此外,擴展蛋白在植物應對鹽、重金屬等脅迫過程中也發(fā)揮著重要功能[11]。

低溫脅迫是影響農作物生產的主要非生物脅迫之一,嚴重威脅農業(yè)生產和糧食安全[12-13]。高抗寒冬小麥品種東農冬麥2號在極寒條件下可以安全越冬,具有寶貴的抗性基因資源[14]。本課題組前期研究結果表明,東農冬麥2號分蘗節(jié)中TaEXPB7-B基因的表達受低溫和脫落酸處理誘導,且過表達TaEXPB7-B、TaEXPA8-B/D、TaEXPA7-A/B/D基因均可顯著促進擬南芥的生長以及對低溫脅迫的耐受性[15-17]。馮珊珊等[18]從東農冬麥2號中克隆了TaEXPA12-A/B/D基因,這3個基因在干旱、脫落酸、茉莉酸甲酯及水楊酸等處理下均上調表達,說明其可能參與冬小麥對非生物脅迫的響應。

為進一步鑒定TaEXPB12-A/B/D基因的功能,以東農冬麥2號為試驗材料,通過農桿菌介導的遺傳轉化體系,將TaEXPB12-A/B/D三個基因分別轉入模式植物擬南芥中,同時探討了TaEXPB12-A/B/D基因對于植物生長和低溫耐受性的影響,以期為冬小麥擴展蛋白的相關研究提供新的理論基礎,同時為寒地作物分子育種提供優(yōu)質的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗所用小麥材料為高抗寒冬小麥品種東農冬麥2號,擬南芥材料為Colombia野生型,均由東北農業(yè)大學植物資源與分子生物學實驗室提供。

1.2 載體及菌株

植物雙元表達載體pBI121(CaMV 35S啟動子驅動,含有Kan抗性)由東北農業(yè)大學植物資源與分子生物學實驗室提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購于北京全式金生物有限公司,根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)GV3101購于上海唯地生物有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 含HA標簽重組PBI121-TaEXPB12-A/B/D表達載體的構建

參考馮珊珊等[18]的方法進行TaEXPB12-A/B/D基因的克隆,通過PCR分別在TaEXPB12-A/B/D三個基因的上游添加XbaI酶切位點和HA標簽序列,下游添加BamHI酶切位點,所用PCR引物見表1。利用限制性內切酶XbaI和BamHI對上述PCR產物和pBI121載體進行雙酶切,酶切產物經純化后用T4連接酶連接,并轉化至大腸桿菌中,然后送哈爾濱擎科生物公司進行測序。

1.3.2 表達載體轉化農桿菌

分別將含HA標簽的pBI121-TaEXPA12-A/B/D三個表達載體轉化至根癌農桿菌感受態(tài)細胞GV3101中,對陽性菌落進行PCR鑒定,所用PCR引物見表1。

1.3.3 擬南芥的遺傳轉化

通過農桿菌介導的方法轉化擬南芥,具體參考Feng等[15]的方法進行。利用PCR及Western-blot方法分別對陽性轉基因擬南芥植株進行鑒定,試驗所用PCR引物見表1,Western-blot試驗所用抗體為Anti-HA,蛋白質提取、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳所用試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司,方法詳見說明書。

1.3.4 轉基因擬南芥的形態(tài)學觀察

分別將野生型和T3代轉基因擬南芥的種子播種于裝有1/2 MS培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Kan)的平皿上,在無菌室培養(yǎng)(16 h/8 h光周期,25 ℃/20 ℃晝夜溫度)7 d后,觀察植株根系的生長情況;待擬南芥生長至4葉期時,移栽至營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1),培養(yǎng)條件同上,14 d后觀察葉片的生長情況,21 d后觀察并測定株高。將擬南芥種子播種于裝有1/2 MS培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Kan)的垂直板上,10 d后觀察側根的生長情況。

1.3.5 低溫脅迫下轉基因擬南芥的表型觀察及生理指標測定

取在營養(yǎng)體中生長至40 d且長勢一致的擬南芥植株,一部分置于-20℃的環(huán)境中,冷馴化30 min后取出,于正常條件下培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計存活率;一部分置于4℃培養(yǎng)箱中模擬低溫脅迫處理,分別于處理后0、3、6、12、24和48 h對全株進行取樣,進行生理指標的測定,其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖含量的測定均參照蘇州科銘生物技術有限公司所購試劑盒的說明書進行。

1.4 數據統(tǒng)計

所有試驗均至少重復3次(n≥10),數據顯示為平均值±標準差,用GraphPad Prism 7 進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 含HA標簽重組pBI121-TaEXPA12-A/B/D表達載體的構建

分別在TaEXPB12-A/B/D三個基因的上游添加XbaI酶切位點和HA標簽序列,下游添加BamHI酶切位點,PCR結果如圖1所示。對pBI121表達載體和上述PCR產物進行雙酶切并連接,連接產物轉化至大腸桿菌后,挑取菌落進行PCR鑒定,陽性菌落的PCR檢測結果如圖2所示。將測序結果正確的pBI121-TaEXPA12-A/B/D載體分別轉化至根癌農桿菌感受態(tài)細胞GV3101中,陽性菌落的PCR鑒定結果如圖3所示,條帶大小與圖1和圖2一致,表明已成功獲得含有pBI121-TaEXPA12-A/B/D載體的根癌農桿菌。

M: DL2000; 1: TaEXPB12-A; 2: TaEXPB12-B; 3: TaEXPB12-D.圖1 TaEXPB12-A/B/D基因添加酶切位點的PCR結果Fig. 1 PCR results of TaEXPB12-A/B/D genes with the added restriction enzyme sites

M: DL2000; 1: pBI121-TaEXPB12-A; 2: pBI121-TaEXPB12-B; 3: pBI121-TaEXPB12-D.圖2 pBI121-TaEXPB12-A/B/D重組載體的菌落PCR結果Fig. 2 Colony PCR results of pBI121-TaEXPA12-A/B/D recombinant vectors

M: DL2000; A1 and A2: pBI121-TaEXPB12-A; B1 and B2: pBI121-TaEXPB12-B; D1 and D2: pBI121-TaEXPB12-D.圖3 含有pBI121-TaEXPB12-A/B/D載體農桿菌的PCR鑒定結果Fig. 3 PCR identification results of Agrobacterium containing pBI121-TaEXPB12-A/B/D vectors

2.2 轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥植株的篩選與鑒定

將野生型和轉基因植株T0代的種子播種在含有50 mg·L-1Kan的1/2 MS培養(yǎng)基中進行篩選,結果如圖4A所示。將陽性植株(T1代)移至營養(yǎng)缽中培養(yǎng),以此模式篩選至T3代植株。對T3代植株分別進行PCR和Western-blot,結果(圖4B和4C)表明,TaEXPB12-A/B/D基因已成功轉化至擬南芥的基因組中,且其編碼的蛋白已表達。

2.3 T3代轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的形態(tài)學分析

對在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d的擬南芥植株進行根部觀察,并測定其根長,結果(圖5A,5B)顯示,TaEXPB12-A/B/D三個基因的過表達顯著促進了擬南芥根的伸長和根毛的生長。對在垂直平板上生長10 d的擬南芥植株進行側根觀察,結果(圖5C)顯示,轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的平均側根數目分別為39、40和39,約為野生型的2倍。對轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的葉片及株高進行觀察并測定,結果(表2)顯示,轉基因擬南芥的葉片數目約為野生型的1.6倍,葉寬約為野生型的1.7倍,差異均達顯著水平,但轉基因擬南芥的株高與野生型無顯著差異。

A:根長;B:根毛形態(tài);C:側根數目。A: Root length; B: Root hair morphology; C: Lateral root number.圖5 野生型和轉基因擬南芥的根長、根毛形態(tài)和側根數目比較Fig. 5 Comparisons of root length, root hair morphology and lateral roots number between wild-type and transgenic Arabidopsis

表2 野生型和轉基因擬南芥的葉片數目、葉寬和株高比較Table 2 Comparisons of leaf number, leaf width, and plant height between wild type and transgenic Arabidopsis

2.4 低溫脅迫對轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥植株的影響

將野生型和轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥置于-20℃的環(huán)境中冷馴化30 min后,發(fā)現野生型和轉基因擬南芥均受到了不同程度的傷害,表現為植株葉片萎蔫、顏色加深,但轉基因擬南芥受到的傷害略小于野生型。繼續(xù)在正常條件下培養(yǎng)7 d后,野生型和轉基因擬南芥均恢復正常生長,轉基因TaEXPB12-A/B/D擬南芥的存活率分別為79%、75%和71%,約為野生型的1.8倍(圖6)。這說明TaEXPB12-A/B/D基因的過表達提高了擬南芥的抗寒能力。

A:表型;B:存活率,**表示轉基因植株與野生型的存活率在0.01水平上差異顯著。A: Phenotype; B: Survival rate, ** indicates significant difference of survival rate between wild type and transgenic plants at 0.01 level.圖6 -20 ℃處理下野生型和轉基因擬南芥的表型和存活率比較Fig. 6 Comparisons of phenotype and survival rate between wild type and transgenic Arabidopsis under -20 ℃ treatment

同時,對野生型和轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥在4 ℃低溫脅迫下的生理指標進行測定,結果(表3)顯示,在4℃處理各時間點,轉基因擬南芥的抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性均高于野生型,而MDA含量相對較低。其中,轉TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的SOD活性在4℃處理0～48 h均顯著高于野生型;POD活性在4℃處理6～24 h均顯著高于野生型;CAT活性在4℃處理3～48 h均顯著高于野生型;MDA含量在4℃處理3 h均顯著低于野生型。植株中Pro和可溶性糖含量測定結果顯示,在4℃處理各時間點,轉基因擬南芥的Pro含量均高于野生型,其中在4 ℃處理0、3、12和48 h差異達顯著水平;除4 ℃處理0和6 h外的其他時間點,轉基因擬南芥的可溶性糖含量均顯著高于野生型。

表3 4℃處理下野生型和轉基因擬南芥中的生理指標Table 3 Physiological indices in wild type and transgenic Arabidopsis under 4 ℃ treatment

3 討論

研究發(fā)現,在擬南芥中過表達水稻擴展蛋白基因OsEXPA17和小麥擴展蛋白基因TaEXPB1A,均能顯著促進擬南芥根系網絡的建成,并提高生物量,進而促進植株生長[19-20]。本研究發(fā)現,轉基因擬南芥的根長和側根數目均明顯高于野生型,說明TaEXPB12-A/B/D基因顯著促進了轉基因擬南芥根的生長,有利于植株在干旱脅迫條件下更有效地吸收土壤中的水分和養(yǎng)分。Cho等[21]研究表明,在擬南芥中過表達擴展蛋白基因AtEXP10增加了植株的葉面積,相反,抑制其表達則導致葉面積減小。本研究發(fā)現,TaEXPB12-A/B/D基因能顯著增加擬南芥的葉寬,有助于提高葉面積。葉面積作為植物光合作用的重要指標之一,葉面積越大,經濟效益越高[22]。因此,TaEXPB12-A/B/D可作為農業(yè)分子育種中提高小麥產量的候選基因。

在低溫脅迫下,植物對氧的利用效率降低,過量的氧在細胞內代謝生成活性氧(ROS)[23],從而啟動氧化應激反應,包括蛋白質氧化、脂質過氧化和DNA損傷,甚至造成細胞死亡[24],使植物細胞膜的完整性喪失,而較高水平的抗氧化酶活性有助于清除植物體內的ROS,維持細胞膜的穩(wěn)定性。Liu等[25]研究發(fā)現,在擬南芥中過表達新疆沙冬青(Ammopiptanthusnanus)擴展蛋白基因AnEXPA1和AnEXPA2,可增強擬南芥對低溫脅迫的抗性,且轉基因植株清除ROS的能力及抗氧化酶的活性也均顯著提高。本研究發(fā)現,在4 ℃低溫脅迫下,過表達TaEXPB12-A/B/D三個基因的擬南芥植株中SOD、POD、CAT的活性均高于野生型,且MDA的含量較低。低溫脅迫下植物中某些小分子物質(如脯氨酸、可溶性糖等)的含量增加,可維持細胞滲透壓,減少細胞損傷[26]。Zhang等[27]研究發(fā)現,在熱、干旱、鹽、鎘等脅迫下,過表達白毛楊(Populustomentosa)擴展蛋白基因PttEXPA8的煙草葉片細胞電解質滲漏減少,滲透調節(jié)水平升高。本研究發(fā)現,低溫脅迫下轉基因擬南芥的可溶性糖、Pro的含量均高于野生型。這些結果表明,擴展蛋白基因可提高轉基因植株的抗氧化能力和滲透調節(jié)能力,從而提高植株在逆境脅迫下的耐受性和存活率,推測TaEXPB12-A/B/D三個基因在清除ROS和維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面也發(fā)揮著重要作用。TaEXPB12-A/B/D基因參與高寒地區(qū)冬小麥的低溫脅迫響應過程,其相關分子機制還需要進一步的研究。