趙連彩,古麗米熱·阿勒木江,鐘俐
(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830017)
AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-Responsive Factor)是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1],也是植物發(fā)育中最重要的基因譜系之一,通常由60~70個(gè)氨基酸殘基組成3個(gè)反向平行的β-折疊和1個(gè)α-螺旋構(gòu)成AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域.它們不僅參與植物的發(fā)育過(guò)程,在應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)中也執(zhí)行一定的功能[2].
根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量,將AP2/ERF家族分為AP2和ERF兩個(gè)亞家族(圖1).AP2亞家族包含2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,即AP2-R1和AP2-R2[3],在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育中起著調(diào)節(jié)作用;ERF亞家族僅具有1個(gè)AP2-R1結(jié)構(gòu)域,在應(yīng)激反應(yīng)和組織發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用[4].根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的相似性,AP2/ERF基因家族被分為4個(gè)亞家族:AP2、ERF、RAV和Soloist[5].AP2亞家族包含2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,分為euAP2譜系和ANT譜系,對(duì)植物的生殖器官(如花、胚珠、萼片)和果實(shí)的發(fā)育有很大影響[6].ERF亞家族包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,分為DREB譜系和ERF譜系,在植物發(fā)育和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用,也參與環(huán)境應(yīng)激或病原體刺激的相關(guān)信號(hào)通路[7].RAV亞家族由AP2和B3 DNA結(jié)構(gòu)域組成,在抗病和應(yīng)激耐受方面具有顯著的作用[8].Soloist亞家族是只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域的最小群體,雖然這種蛋白質(zhì)也含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,但其序列和基因結(jié)構(gòu)與ERF有很大差異[2],主要參與水楊酸途徑中的病原體防御和鹽脅迫反應(yīng)[9].從模式植物到普通作物,AP2、ERF、RAV和Soloist成員均具有保守性和多樣性.
圖1 AP2/ERF基因家族分類(lèi)
AP2亞家族包括euAP2和ANT兩個(gè)譜系,與euAP2譜系相比,ANT譜系不具有miR172識(shí)別位點(diǎn),而是通過(guò)特定的氨基酸特征進(jìn)行區(qū)分[10].為深入了解AP2亞家族成員的功能,本文對(duì)AP2亞家族兩個(gè)譜系的分類(lèi)及各成員的特點(diǎn)、功能進(jìn)行了綜述.
AP2屬于AP2/ERF家族中最古老的譜系之一[11].一個(gè)典型的AP2基因中有8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,包括1個(gè)乙烯響應(yīng)元件、2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域、2個(gè)兩親性抑制基序、1個(gè)核定位信號(hào)序列、1個(gè)連接域和1個(gè)miR172靶位點(diǎn).AP2基因在花的各個(gè)結(jié)構(gòu)中均有表達(dá),在控制花、果實(shí)和種子發(fā)育中起到重要作用[12].在擬南芥發(fā)育的每一個(gè)階段以及六大器官中都檢測(cè)到了AP2轉(zhuǎn)錄物.
1.1.1 調(diào)控花發(fā)育
AP2可以影響花分生組織、決定花器官的同一性,同時(shí)在確定花器官身份和調(diào)節(jié)花同源基因的表達(dá)方面起作用[13].AP2基因功能的缺失突變使花分生組織對(duì)促進(jìn)或抑制花發(fā)育的信號(hào)高度敏感[14],也表現(xiàn)出花器官缺陷,導(dǎo)致其在花發(fā)育的ABC模型中被賦予A類(lèi)功能[15].在擬南芥中,通過(guò)酵母雙雜發(fā)現(xiàn)AP2通過(guò)招募TPL和AtHDA19以調(diào)節(jié)B類(lèi)基因的表達(dá),從而限制花瓣的外邊界,通過(guò)抑制E類(lèi)基因SEP3控制花輪的外邊界.AP2作為花同源異型基因控制著它的生長(zhǎng),防止花瓣向外擴(kuò)散,AP2現(xiàn)在已經(jīng)被證明可以直接限制花中B、C和E類(lèi)基因的表達(dá)域[16].AP2基因在擬南芥中突變導(dǎo)致將花器官轉(zhuǎn)化為生殖器官,表現(xiàn)出萼片和花瓣分別向胚珠和雄蕊同源轉(zhuǎn)化.在矮牽牛中,分離出PhAP2A、PhAP2B和PhAP2C 3個(gè)AP2類(lèi)基因,原位雜交顯示這3個(gè)基因與擬南芥AP2為直系同源物.但PhAP2B、PhAP2C與PhAP2A相比,在花發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出幾乎互補(bǔ)的表達(dá)模式.反向遺傳學(xué)策略表明,PhAP2A對(duì)矮牽?;ū话l(fā)育可能不是必需的,但PhAP2A能夠恢復(fù)突變體中的同源異形轉(zhuǎn)化[17].
1.1.2 調(diào)控干細(xì)胞
AP2在維系莖頂端分生組織[18]和控制花干細(xì)胞[19]方面起作用.在擬南芥中,AP2的等位基因L28突變后,莖頂端分生組織的干細(xì)胞停止分化.遺傳分析表明,AP2通過(guò)調(diào)控WUS-CLV3在干細(xì)胞中發(fā)揮作用.而在花干細(xì)胞中,AP2通過(guò)拮抗花中心的AG活性發(fā)揮作用.在花發(fā)育的第六階段,AG可以直接作用于WUS位點(diǎn)來(lái)終止WUS的表達(dá),也可以間接作用在其靶基因KNU 上來(lái)終止WUS的表達(dá),以促進(jìn)花的決定性[20].
1.1.3 調(diào)控種子發(fā)育
AP2在控制種子發(fā)育方面起作用.AP2突變種子缺乏一種稱(chēng)為小柱的種皮細(xì)胞結(jié)構(gòu),并且比野生型種子形狀更不規(guī)則,這表明正常種皮發(fā)育需要AP2的調(diào)節(jié).透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)擬南芥ap2突變體比野生型種子的細(xì)胞大,確定AP2基因可以限制種子珠被中細(xì)胞的大小,從而控制種子的大??;利用RNA凝膠印跡分析和RT-PCR分析了AP2的活性對(duì)控制種子質(zhì)量的重要性,確定其通過(guò)母體孢子和胚乳基因組控制擬南芥種子質(zhì)量[21].在鳳梨中,AfAP2-2基因的過(guò)度表達(dá)使種子變小并延遲開(kāi)花,可能是開(kāi)花、種子大小和重量的負(fù)調(diào)節(jié)因子[22].將落葉松LaAP2L1基因過(guò)表達(dá)到模式植物擬南芥中,不僅導(dǎo)致細(xì)胞增殖增強(qiáng),而且延長(zhǎng)了生長(zhǎng)時(shí)間,使擬南芥的種子產(chǎn)量增加到200%以上[23].
SMZ(SCHLAFMUTZE)和SNZ(SCHNARCHZAPFEN)是來(lái)自AP2亞家族的花抑制因子[24],它們的表達(dá)水平在植物生長(zhǎng)的早期達(dá)到峰值,并隨著植物的衰老而降低[25].SMZ最初是在激活標(biāo)記中篩選確定的,因?yàn)樗哂酗@性的晚開(kāi)花表型,而SNZ是SMZ的同源基因,高表達(dá)時(shí)抑制開(kāi)花[26].在擬南芥中,抽薹和開(kāi)花受硝酸鹽調(diào)控,硝酸鹽通過(guò)激活赤霉素途徑來(lái)控制SMZ和SNZ的轉(zhuǎn)錄水平,增加硝酸鹽的濃度會(huì)延遲開(kāi)花,從而調(diào)節(jié)擬南芥的開(kāi)花時(shí)間[24].
TOEs屬于AP2亞家族,在擬南芥中有3個(gè)成員,包括TOE1、TOE2和TOE3,它通過(guò)調(diào)節(jié)光周期信號(hào)組分CO(CONSTANS)抑制并調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間[27].據(jù)報(bào)道,SMZ、SNZ和TOEs都冗余地作為開(kāi)花的阻遏物,以相互獨(dú)立又彼此協(xié)同的方式控制開(kāi)花,它們之間存在復(fù)雜的反饋監(jiān)管機(jī)制[28].
TOE1可通過(guò)結(jié)合FT(FLOWERING LOCUST)和抑制CO的轉(zhuǎn)錄活性負(fù)調(diào)控FT的表達(dá)和開(kāi)花.在擬南芥中,將TOE1基因進(jìn)行突變,突變體開(kāi)花時(shí)間提前;在toe1 toe2雙突變體中,這種效應(yīng)增強(qiáng),證明TOE1和TOE2均可抑制開(kāi)花[25].TOE3很可能與TOE1和TOE2一起冗余地抑制開(kāi)花,它在花器官形成期間,對(duì)于擬南芥花型的形成至關(guān)重要.但是在鹽穗木中,HcTOE3是一種冷調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)冷凍脅迫有正向調(diào)節(jié)作用[29].
ANT譜系屬于AP2亞家族,但兩者之間的差別在于ANT的AP2-R1與AP2-R2結(jié)構(gòu)域分別插入了10 aa和1 aa.根據(jù)前結(jié)構(gòu)域序列和其它特定基序的長(zhǎng)度,ANT譜系進(jìn)一步細(xì)分為basalANT亞譜系和euANT亞譜系[30].euANT亞譜系由一個(gè)較長(zhǎng)的前結(jié)構(gòu)域和保守基序構(gòu)成,包括euANT2、euANT3和euANT4,而basalANT亞譜系僅有一個(gè)較短的前結(jié)構(gòu)域[31-32].
ANT(AINTEGUMENTA)與AIL(AINTEGUMENTA-like)都含有兩個(gè)典型的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域首次在擬南芥AP2蛋白中發(fā)現(xiàn)[31].其中AIL屬于較為保守的一類(lèi),主要編碼花器官生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因,參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育和非生物脅迫反應(yīng),在發(fā)育過(guò)程中起著核心作用.
2.1.1 ANT維持細(xì)胞分生組織
ANT參與維持細(xì)胞分生,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量來(lái)控制器官大小.在金魚(yú)草中,利用黃瓜花葉病毒載體(CMVA1)誘導(dǎo)VIGS感染金魚(yú)草,與未感染植物相比,感染A1∶ANT金魚(yú)草的花和葉明顯減小,而細(xì)胞大小差異并不明顯[32].大白菜BrANT-1基因轉(zhuǎn)化擬南芥,利用掃描電鏡觀察葉表皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株比野生型植株的細(xì)胞數(shù)量增加了50%以上,而細(xì)胞大小僅減小了不到6%.因此,該轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量從而增大葉面積[33].同時(shí)在擬南芥中過(guò)表達(dá)或敲除AtANT,擬南芥的細(xì)胞數(shù)量和側(cè)生芽的大小均發(fā)生了改變[34].
2.1.2 ANT調(diào)控種子發(fā)育
在擬南芥中,ANT調(diào)節(jié)了胚珠珠被的起始和胚珠的發(fā)育,過(guò)表達(dá)ANT會(huì)導(dǎo)致種子的體積增加.MEE45是一種B3型轉(zhuǎn)錄因子,是胚珠珠被啟動(dòng)和發(fā)育時(shí)所必需的,它可以直接與ANT基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,激活A(yù)NT基因轉(zhuǎn)錄,ANT又可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素合成基因,從而調(diào)控種子的生長(zhǎng)[35].
2.1.3 ANT與AIL冗余調(diào)控花器官生長(zhǎng)
ANT在花器官生長(zhǎng)方面起重要的調(diào)節(jié)作用,且以冗余的方式與AILs一同起作用.當(dāng)AIL5、AIL6或AIL7功能喪失時(shí),對(duì)花的表型沒(méi)有影響;當(dāng)植物喪失ANT功能時(shí)[36],AIL5、AIL6與AIL7對(duì)花的發(fā)育有獨(dú)特的貢獻(xiàn).通常,AILs通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)量或細(xì)胞大小在調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[37].ANT基因缺失突變導(dǎo)致花的體積減小,而AIL6基因缺失突變卻不影響花的外觀;在ant ail6雙突變體中,花的體積會(huì)進(jìn)一步減小,這表明AIL6也有助于器官生長(zhǎng).ANT或AIL6過(guò)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生更大的花,表明這兩種基因都可以促進(jìn)花器官的生長(zhǎng).另外,AIL5和AIL7也在花發(fā)育中表達(dá),這兩個(gè)基因已經(jīng)被證明與AIL6一起調(diào)節(jié)嫩枝葉序和側(cè)根起始[38].
BBM(BABY BOOM)最早發(fā)現(xiàn)于甘藍(lán)型油菜小孢子發(fā)生過(guò)程中[39],參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞全能性,主要在植物胚的發(fā)生、細(xì)胞增殖、再生、植物轉(zhuǎn)化和無(wú)配子生殖等多種信號(hào)發(fā)育途徑中起作用[40].
2.2.1 調(diào)控胚胎發(fā)生
利用RNA-seq對(duì)不同時(shí)間段未成熟胚外植體的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了一些與控制胚胎發(fā)生的基因高度相似的序列,如轉(zhuǎn)錄因子BABY BOOM、LEAFY COTYLEDON和AGAMOUS,以及重要的體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體樣激酶(SERK)基因.其中BBM 基因與已知胚胎發(fā)生途徑中發(fā)揮作用的GLP、GST、PIN、WOX、LEC2和AGL15等基因共表達(dá)[41].
2.2.2 調(diào)控細(xì)胞增殖
BBM 通過(guò)異位表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞增殖.在擬南芥幼苗中,通過(guò)DNA微陣列分析的方法和翻譯后調(diào)節(jié)BBM∶GR蛋白與放線菌酮鑒定出一些由AtBBM直接激活的靶基因,這些靶基因已經(jīng)被證明參與分生組織的生長(zhǎng)以及與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂相關(guān)的細(xì)胞壁的合成[42-43].以上結(jié)果提示,BBM可通過(guò)激活與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂相關(guān)的基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖.
2.2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞再生
通過(guò)構(gòu)建毛白楊PtBBM 過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至愈傷后獲得大量體細(xì)胞胚,進(jìn)而獲得再生植株.因而PtBBM 可作為毛白楊轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因,無(wú)需使用任何抗生素即可獲得轉(zhuǎn)基因毛白楊植株[44].
2.2.4 誘導(dǎo)無(wú)配子生殖
在珍珠粟中,通過(guò)RT-PCR技術(shù)證明了PSASGR-BBML基因在受精前的卵細(xì)胞中表達(dá),從而誘導(dǎo)孤雌生殖,并產(chǎn)生單倍體后代.而包含PSASGR-BBML基因3′端RNAi結(jié)構(gòu)的無(wú)融合生殖F1轉(zhuǎn)基因植物中,PSASGRBBML表達(dá)量的減少導(dǎo)致孤雌生殖胚胎減少,胚胎細(xì)胞數(shù)量減少[43].以上證據(jù)表明PSASGR-BBML在無(wú)配子生殖中起著重要作用.
總的來(lái)說(shuō),BBM主要負(fù)責(zé)分化和維持分生組織,并且與PLT1、PLT2、BBM和PLT3/AIL6在根分生組織和胚胎分化中起著冗余作用[45].
PLT(PLETHORA)是決定植物干細(xì)胞命運(yùn)、維持分生組織、控制細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化進(jìn)程的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子[46].
2.3.1 決定干細(xì)胞的命運(yùn)
PLT1和PLT2的表達(dá)域與根部干細(xì)胞生態(tài)位相關(guān),它們對(duì)靜止中心的特異性和干細(xì)胞活性至關(guān)重要,plt1 plt2雙突變體的表型需要特定的干細(xì)胞維持,且過(guò)度表達(dá)PLT1和PLT2導(dǎo)致生長(zhǎng)區(qū)域的異位誘導(dǎo)[47-48].
2.3.2 維持細(xì)胞分生組織
PLT1和PLT2是維持根分生組織和分生組織邊界位置的主要調(diào)節(jié)因子.PLT1-4對(duì)于根的形成必不可少,該基因的突變導(dǎo)致植物產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷,有時(shí)甚至缺乏根和下胚軸.PLT3、PLT5和PLT7在側(cè)根原基中表達(dá),是側(cè)根形成過(guò)程中分生組織基因激活的關(guān)鍵,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)側(cè)根發(fā)育并防止側(cè)根原基彼此靠近形成[47].在水稻中,OsPLT8/CRL5可被生長(zhǎng)素誘導(dǎo),并通過(guò)抑制細(xì)胞分裂素信號(hào)發(fā)揮作用[49],這表明類(lèi)似的調(diào)節(jié)途徑可能在花序分生組織中起作用.
2.3.3 控制植物細(xì)胞的增殖和細(xì)胞分化的進(jìn)程
在擬南芥中,AtAIL/PLT被認(rèn)為是擬南芥根和芽發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[50],其可利用不同的遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂以及根和芽中細(xì)胞分化的時(shí)間.AtPLT的表達(dá)會(huì)激活與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因,而且AtPLT的水平越高,激活效果越明顯,隨著AtPLT水平逐漸降低,激活效果也逐漸減弱.AtPLT激活的基因會(huì)優(yōu)先在分生組織分裂區(qū)表達(dá),而受AtPLT抑制的基因大都在延伸區(qū)和分化區(qū)表達(dá),表明它不僅維持了細(xì)胞的分裂狀態(tài),也防止細(xì)胞的分化,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)[51].
以擬南芥為例,basalANT亞譜系成員包括WRI1(WRINKLED1)、WRI3(WRINKLED3)、WRI4(WRINK LED4)和ADAP.
2.4.1 WRI1成員
WRI1轉(zhuǎn)錄因子有兩個(gè)AP2/ERF結(jié)合域,含有VYL、IDR和PEST等基序,在所表征的WRI1蛋白中高度保守[52],是參與種子代謝的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子.
WRI1中的AP2結(jié)構(gòu)域與AW-box([CnTnG](n)7[CG])結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪酸的生物合成.已經(jīng)證明了WRI1參與調(diào)控糖酵解的基因和脂肪酸合成的酶基因(如ACCase和FAS)[53].對(duì)水稻的研究顯示,WRI1直系同源物(OsWRI1)在水稻種子發(fā)育過(guò)程中廣泛表達(dá)[54].擬南芥AtWRI3和AtWRI4的突變未對(duì)種子脂肪酸生物合成基因轉(zhuǎn)錄造成影響[55],但對(duì)其它組織中的脂肪酸合成非常必要.AtWRI3和AtWRI4的表達(dá)定位于營(yíng)養(yǎng)組織和花,激活角質(zhì)層蠟質(zhì)的產(chǎn)生[56].目前,有關(guān)WRI3的報(bào)道較少.
2.4.2 AtWRI4成員
AtWRI4主要負(fù)責(zé)控制擬南芥莖中表皮蠟的生物合成.AtWRI4主要在莖表皮中表達(dá),負(fù)責(zé)合成莖表皮蠟.擬南芥突變體atwri4相對(duì)野生型莖中的總蠟含量降低,但是它們?cè)谌~或角果中沒(méi)有顯著改變[56].在蘋(píng)果中,MpWRI4通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成基因(如LACS1、KCR1、PAS2、ECR和WSD1)來(lái)影響蠟質(zhì)生物合成[57].
2.4.3 ADAP成員
ADAP參與了脫落酸(ABA)反應(yīng)[58],一方面調(diào)節(jié)種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng),同時(shí)也對(duì)非生物脅迫作出積極響應(yīng)[59].研究顯示ADAP與ARIA互作,而ARIA又可與控制ABA基因的BZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ABF2互作,進(jìn)而調(diào)節(jié)ABA反應(yīng).擬南芥突變體atadap的發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)都顯著優(yōu)于野生型,表明AtADAP是一種參與植物發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子.同時(shí)該突變體變得對(duì)ABA不敏感,提示AtADAP參與調(diào)節(jié)了ABA反應(yīng).在干旱和高鹽脅迫下,突變體atadap在干旱脅迫下的平均存活率低于野生型,而在高鹽脅迫下的種子萌發(fā)率顯著高于野生型,揭示AtADAP參與了植物對(duì)干旱和高鹽的響應(yīng)[60].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AtADAP是在植物防御中發(fā)揮重要作用的硫代葡萄糖苷GSL生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)因子[61].
AP2/ERF是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族,其功能涉及許多生理過(guò)程,包括植物的形態(tài)發(fā)生、對(duì)脅迫的響應(yīng)及代謝物調(diào)節(jié)等.盡管開(kāi)展了AP2亞家族大多數(shù)成員的研究,但有關(guān)WRI3和ADAP的報(bào)道較少,且對(duì)其研究主要處于基因功能驗(yàn)證階段.未來(lái)有關(guān)AP2亞家族的研究應(yīng)著重闡明其分子機(jī)制及涉及的信號(hào)通路,同時(shí)如何與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合仍然是廣大科研工作者未來(lái)要攻克的難題,從而為分子育種提供新方案、新策略,以培育出更優(yōu)良的新品種.