李永波　魯琳　方會(huì)見(jiàn)　崔德周　孟福燕　黃琛　隋新霞　樊慶琦　楚秀生

關(guān)鍵詞：小麥：非生物脅迫：DREB4轉(zhuǎn)錄因子：多克隆抗體

中圖分類號(hào)：S512.1：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023） 03-0009-06

干旱、鹽、高溫、冷等各種非生物脅迫會(huì)嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量。DREB蛋白含有一個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，可以和順式作用元件DRE核心序列（A/GCCGAC）發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而應(yīng)對(duì)各種非生物脅迫。到目前為止，DREB轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、大豆、水稻、玉米、大麥和小麥等多種植物中被鑒定出來(lái)。DREB分為六大類（DREB1～6），其中，DREB1在擬南芥、水稻、玉米中主要應(yīng)答冷脅迫，DREB2主要應(yīng)答干旱、鹽脅迫，DREB3參與ABA和糖信號(hào)途徑，DREB4應(yīng)答干旱、冷脅迫及在乙烯與茉莉酸途徑中起作用，DREB5參與應(yīng)答干旱、冷脅迫，DREB6應(yīng)答干旱、鹽脅迫。大量研究已驗(yàn)證了DREB在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫中的功能。如在小麥中過(guò)表達(dá)擬南芥DREBIA、大豆GmDREB1或棉花Gh DREB基因，可通過(guò)提高根系活力、光合作用及滲透調(diào)節(jié)能力提高小麥的抗旱性；在擬南芥中過(guò)表達(dá)大豆GmDREB2、GmDREB3或小麥Ta DREB3基因，可提高擬南芥抗旱、耐鹽、耐高溫及抗凍性；過(guò)表達(dá)GmDREB6基因，可增強(qiáng)大豆的耐鹽能力。

然而，目前幾乎所有關(guān)于DREB的研究是集中在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，缺乏蛋白質(zhì)水平上的調(diào)控研究，且DREB蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能是否通過(guò)磷酸化、乙?；鹊鞍姿缴系恼{(diào)控尚未可知，因此，研究識(shí)別內(nèi)源性DREB蛋白的特異性多克隆抗體，對(duì)于DREB在蛋白水平的調(diào)控研究具有非常重要的意義。

本研究通過(guò)對(duì)小麥中已有的DREB4A、4B和4C進(jìn)行序列分析，選取DREB4A進(jìn)行原核表達(dá)、純化，并以其作為抗原，首次制備出可識(shí)別小麥內(nèi)源DREB4蛋白的多克隆抗體，以期為進(jìn)一步研究植物DREB4在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)理提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試小麥品種為濟(jì)麥379，由山東省審定（魯審麥20210017）。取其幼苗期根、葉為材料進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 DREB4序列分析與合成

本研究通過(guò)DNAMAN8軟件對(duì)NCBI中提交的DREB4A（AY781354.1）、4B（AY781355.1）和4C（AY781356.1）序列進(jìn)行分析；DREB4A序列的合成由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行。

1.3 DREB4A載體構(gòu)建、原核表達(dá)及純化

將上述合成的DREB4A序列與大腸桿菌表達(dá)載體PET30a通過(guò)同源重組的方法（pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，CU201-02，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α（北京擎科生物科技有限公司）感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置15 min.42℃水浴熱激90s，再冰上放置2 min，加入1 mL無(wú)任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、210r/min水平搖th，然后取100μL菌液，涂于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取10個(gè)單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取2個(gè)陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)的單克隆由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序正確的單克隆進(jìn)行搖菌、質(zhì)粒提?。ㄙ|(zhì)粒小提試劑盒，DP103，北京天根生化科技有限公司）。將提取好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B121（ DE3）感受態(tài)細(xì)胞（CD701-02，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）中，剩余步驟同DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。挑單克隆，置于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后吸取1 mL菌液，加入到300 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液OD值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為50 mmol/L的IPTG（G5042-1G，武漢塞維爾生物科技有限公司）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28℃過(guò)夜培養(yǎng)；菌液于6000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用1×PBS（ phosphate buffer saline）清洗沉淀1次，然后加入40 mL lxPBS重懸，超聲破碎（開(kāi)3s，關(guān)3s；共計(jì)30 min），6000 r/min離心10min，分別將沉淀、上清液進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)。利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（P2226，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）對(duì)上清液進(jìn)行純化，然后置于透析袋中4℃過(guò)夜透析，將透析后的蛋白置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4小麥DREB4多克隆抗體制備

選取實(shí)驗(yàn)級(jí)日本大耳白兔和新西蘭大白兔各1只，飼養(yǎng)體重至1～2 kg時(shí)，用注射器將充分混勻的1mL完全弗氏佐劑（液體石蠟：羊毛脂=2：1）和0.3 mg DREB4A融合蛋白對(duì)每只兔子進(jìn)行皮下注射第1針，標(biāo)記為第1天；第12天，將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑（完全弗氏佐劑+終濃度20 mg／mL的卡介苗）和0.15 mg融合蛋白對(duì)每只兔子進(jìn)行皮下注射第2針；第26天，將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑和0.15 mg融合蛋白對(duì)每只兔子進(jìn)行肌肉注射第3針；第40天，將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑和0.15 mg融合蛋白對(duì)每只兔子進(jìn)行肌肉注射第4針：第53天，取兔子血清進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

1.5 Western blot分析

利用植物組織蛋白裂解液提取小麥幼苗期根、葉部的總蛋白（植物蛋白提取試劑盒，CW0885，康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），配制15%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳：通過(guò)濕法轉(zhuǎn)膜，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，然后將膜放人含有2%脫脂奶粉的TBS（25 mmol/LTris-HCl，137 mmol/L NaCl）中，封閉1h；加入DREB4多克隆抗體（1：1000稀釋于2%脫脂奶粉中），4℃過(guò)夜；用TBST（TBS+20%吐溫-20）洗滌3次后，向封閉液中加入堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）標(biāo)記的二抗，緩慢搖動(dòng)24 h，然后TBST洗滌3次，每次10 min;最后用發(fā)色液（TBS 10 mL，5% NBT 45μL，5% BCIP 35μL）進(jìn)行發(fā)色。

1.6免疫組織化學(xué)法進(jìn)行亞細(xì)胞定位

將小麥葉片下表皮撕下，置于4%多聚甲醛中，室溫放置24 h，棄掉多聚甲醛，用1×PBS清洗3次，加入2%脫脂奶粉于37℃封閉30 min，然后在4℃下加入DREB4多克隆抗體（1：200稀釋于2%脫脂奶粉中）過(guò)夜；用PBS洗滌3次后，加入1μL二抗（山羊抗兔-Alexa Fluor 555抗體）和10mL BSA，37℃繼續(xù)孵育th，然后用TBS清洗3次，在室溫下用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DA-PI，AnaSpec Inc.， San Jose， CA，USA）染色10 min，然后用TBS清洗3次，置于熒光顯微鏡（HT7700，Hitachi，Tokyo，Japan）下觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1小麥DREB4序列分析

在普通小麥中，DREB4存在DREB4A、4B、4C三種轉(zhuǎn)錄本，其中，DREB4A編碼394個(gè)氨基酸，分子量為42.8 kDa；DREB4B編碼346個(gè)氨基酸，分子量為37.7 kDa；DREB4C編碼68個(gè)氨基酸，分子量為7.1 kDa（圖1）。三個(gè)蛋白氨基酸序列的保守性為61.28%，第1～25位的氨基酸完全一致，其中，DREB4B除第26～73位氨基酸缺失外，其它位置的氨基酸與DREB4A完全一致。DREB4A、4B和4C存在序列間的差異，可能是應(yīng)對(duì)不同非生物脅迫產(chǎn)生的可變剪切所致。

2.2小麥DREB4A的原核表達(dá)

鑒于DREB4A的氨基酸序列最長(zhǎng)，選其進(jìn)行后續(xù)分析。首先，將人工合成的DREB4A序列與表達(dá)載體PET30a連接后，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，上清液中的蛋白純化后進(jìn)行SDS -PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，在大約50 kDa處出現(xiàn)清晰的蛋白條帶（圖2），與預(yù)期的蛋白分子量相符，表明DREB4A成功表達(dá)。

2.3 DREB4多克隆抗體的制備

本研究以上述獲得的純化DREB4A融合蛋白為抗原免疫兔子，從兔血清中獲取了DREB4多克隆抗體。Western blot結(jié)果顯示，該抗體在目的蛋白位置清楚地識(shí)別到DREB4A蛋白（圖3）。

2.4 DREB4多克隆抗體對(duì)小麥內(nèi)源性DREB4蛋白的識(shí)別及特異性檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該抗體能否識(shí)別小麥內(nèi)源性DREB4蛋白，分別提取小麥苗期根、葉總蛋白進(jìn)行免疫識(shí)別。Westem blot結(jié)果顯示，僅在37 kDa處檢測(cè)到清晰的蛋白條帶，這與預(yù)測(cè)的DREB4B蛋白分子量一致（圖4）。表明該抗體可以識(shí)別小麥內(nèi)源性DREB4B蛋白，而且特異性好，可以用于后續(xù)植物DREB分子機(jī)理的相關(guān)研究。

2.5 DREB4亞細(xì)胞定位分析

DREB4定位于細(xì)胞核中（圖5），與前人報(bào)道的DREB轉(zhuǎn)錄因子核定位的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了該抗體特異性較好，可用于開(kāi)展免疫組織或細(xì)胞化學(xué)研究的可行性。

3討論與結(jié)論

DREB是一類抗非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，目前主要用于抗逆轉(zhuǎn)基因植物的培育及相關(guān)分子機(jī)理的解析。小麥DREB4蛋白是一種對(duì)動(dòng)物和人類無(wú)危害的蛋白，將其用于糧食作物抗逆性轉(zhuǎn)基因改良有著廣闊的市場(chǎng)前景。DREB4在小麥中存在三種轉(zhuǎn)錄形式（DREB4A、4B和4C），其中，DREB4A編碼的多肽鏈最長(zhǎng)，涵蓋的蛋白信息最豐富，推測(cè)由此蛋白作為抗原產(chǎn)生的抗體可識(shí)別DREB4的所有三種形式，因此本研究利用DREB4A蛋白作為抗原，進(jìn)行了DREB4多克隆抗體的制備。經(jīng)過(guò)抗原上清蛋白的純化、免疫注射，最終研制出能識(shí)別小麥內(nèi)源性DREB4蛋白的多克隆抗體。

盡管從植物中已克隆出多種類型的DREB基因，但由于其抗體類型匱乏以及識(shí)別內(nèi)源性蛋白抗體的空白，導(dǎo)致有關(guān)DREB在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。目前，只有擬南芥DREBIA的抗體制備成功，且僅對(duì)大腸桿菌中表達(dá)的擬南芥DREBIA融合蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。本研究首次開(kāi)發(fā)了特異性識(shí)別小麥內(nèi)源DREB4蛋白的多克隆抗體，既豐富了植物DREB的抗體類型，也為進(jìn)一步推動(dòng)DREB在蛋白水平上的研究提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

利用本研究制備的DREB4多克隆抗體檢測(cè)小麥苗期根、葉內(nèi)源性DREB4蛋白時(shí)，僅識(shí)別到了DREB4B蛋白條帶，與預(yù)測(cè)的該抗體能識(shí)別小麥中DREB4三種蛋白形式的結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)镈REB4具有組織器官以及不同發(fā)育階段表達(dá)特異性，在小麥苗期根、葉中主要以DREB4B的形式表達(dá)，而在花、籽粒等其它組織器官以及不同發(fā)育階段中則以其它形式表達(dá)；另外，DREB4在不同小麥品種中的表達(dá)形式也可能存在一定的差異，本研究所用小麥品種濟(jì)麥379為抗旱節(jié)水型品種，在其苗期根、葉中主要以DREB4B的形式表達(dá)，但在其它類型的小麥品種中以哪種形式表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

傳統(tǒng)DREB基因亞細(xì)胞定位是采用構(gòu)建DREB-GFP過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入組織或細(xì)胞中的方法進(jìn)行定位，而本研究是利用該抗體對(duì)內(nèi)源DREB4進(jìn)行免疫定位，與傳統(tǒng)方法相比可避免因過(guò)表達(dá)造成目的蛋白移位的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)DREB4A進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)、純化，并以此作為抗原成功制備出可識(shí)別小麥內(nèi)源性DREB4蛋白的高度特異性多克隆抗體，可為深入研究植物DREB4在蛋白水平上參與非生物脅迫的調(diào)控機(jī)理奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。