張思華 彌春霞 虞軼俊 劉國群 朱春權田文昊 朱練峰 曹小闖 張均華* 孔亞麗*

（1 牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157011；2 中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點實驗室，杭州 311400；3 浙江省耕地質(zhì)量與肥料管理總站，杭州 310020；4衢州市柯城區(qū)美麗鄉(xiāng)村建設中心，浙江 衢州 324002；#共同第一作者；*通迅作者：zhangjunhua@caas.cn；kongyali@caas.cn）

鹽堿化土地是指土壤中的Na+、Cl-、Mg2+、Ca2+、SO42-和CO32-等鹽分離子過量累積而影響作物正常生長的土地。由于人為和環(huán)境等因素引起的土壤鹽堿化問題，已成為限制中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一[1]。目前我國鹽堿化土地面積約占全國可利用土地面積的5%，且受到潛在鹽堿化危害的土地有1 750萬hm2[2]。因此，鹽堿化土地的恢復和再利用始終是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)耕作中不容小覷的問題。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一。由于人口基數(shù)不斷增加，對水稻的需求量也越來越大。據(jù)估計，在全球范圍內(nèi)有50%的水稻產(chǎn)量受到土壤鹽堿化影響[3]。因此，通過生物技術手段提高水稻的耐鹽堿性，探究水稻耐鹽堿性的具體機制尤為重要[4]。在鹽堿脅迫下植物生長受到多方面的抑制作用，例如離子毒害、氧化脅迫和滲透脅迫等[5]，植物為了使自身的生理代謝能夠正常進行，主動去積累脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來降低細胞滲透勢，保持滲透平衡[6]，在一定程度上緩解鹽堿脅迫對其的傷害。正常條件下植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生與釋放處于一種動態(tài)平衡，當受到脅迫時，這種平衡將會被破壞，使ROS 大量積累發(fā)生膜質(zhì)過氧化反應。而超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）是酶促防御系統(tǒng)中重要的酶類，這些酶可以清除細胞內(nèi)過多的自由基，使ROS 在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定，使植物可以正常生長。利用植物與微生物的共生關系對鹽堿土地進行改良和恢復是一種綠色有效的生物方法，其中叢枝菌根（AM）真菌受到廣泛關注。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一種普遍存在于自然界的共生微生物。一些研究發(fā)現(xiàn)，它能與大約80%的植物物種形成共生關系，促進脅迫條件下植物的養(yǎng)分吸收和滲透調(diào)節(jié)[7]。KRISHNAMOORTHY 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AMF 處理以及AMF 和相關細菌共同作用可以緩解鹽脅迫對玉米生長、養(yǎng)分吸收的抑制。MIN 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AMF 與玉米共生提高了玉米植株中SS、SP 和蘋果酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度。KUMAR 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，經(jīng)AM 處理的麻風樹幼苗生物量高于未接種處理，且葉片膜損傷較小，SS 含量較高。張良等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫下，接種AMF 不僅可以提高星星草的抗氧化酶活性，還可以在一定程度上通過改變土壤質(zhì)地來保護植物免受侵害。目前AMF 促進植物耐鹽堿性的研究多集中于旱地作物，其提高水稻耐鹽堿性及其機理的研究鮮見報道。本研究以水稻為材料，通過盆栽沙培試驗，模擬鹽堿環(huán)境，研究鹽堿脅迫下接種AMF 對水稻生長、抗氧化酶活性和滲透物質(zhì)積累的影響，揭示AMF 調(diào)控水稻抗鹽堿性的生理機制，以期為提高水稻在鹽堿區(qū)域的產(chǎn)量提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為津源85（耐鹽堿品種）和遼粳763（鹽堿敏感品種），種子由中國水稻研究所提供，播種前浸泡2 d 后進行催芽。供試菌種為一種主要在根內(nèi)形成其孢子的叢枝菌根真菌——根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices，編號BGC BJ09），購于北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所。以沙子∶蛭石∶珍珠巖（V∶V∶V）=1∶1∶1 為生長基質(zhì)，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌。培養(yǎng)盆缽為規(guī)格11.5 cm×9.5 cm×12.0 cm（上口徑×下口徑×高）的無孔不透明塑料花盆，使用前用75%酒精消毒殺菌。

1.2 試驗設計

于2022 年1 月3 日至3 月14 日在中國水稻研究所溫室進行沙培盆栽試驗。設置4 個處理：CK，不接種AMF+非鹽堿脅迫；SA，鹽堿脅迫+不接種AMF；AMF，非鹽堿脅迫+接種AMF；SA+AMF，鹽堿脅迫+接種AMF。每個處理4 次重復，每個水稻品種種16 盆，共32盆。接種處理每盆裝滅菌基質(zhì)770 g 和5 g 菌劑，未接種處理每盆只裝滅菌基質(zhì)770 g。移苗時選取高度一致、具有4 片真葉的水稻幼苗移栽到培養(yǎng)盆缽中，每盆3 叢，每叢2 株，培養(yǎng)期間每隔2 d 澆1 次Hoagland 營養(yǎng)液，每次100 mL。鹽堿脅迫處理選擇2 種中性鹽（NaCl、Na2SO4）和2 種堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）以1∶9∶9∶1 的配比配制濃度為100 mmol/L 的鹽堿溶液，從第45 天開始，每隔3 d 澆1 次，每次20 mL，共處理10次。

1.3 測定指標與方法

鹽堿處理第30 天時，采集水稻植株樣品進行生長與生理指標的測定。將植株地上部于105 ℃烘箱殺青30 min 后，調(diào)節(jié)溫度為75 ℃烘至恒質(zhì)量然后用萬分之一天平測定水稻生物量；菌根侵染率參考王思雨等[12]的臺盼藍染色法；過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量采用碘化鉀比色法和硫代巴比妥酸法測定；SOD、CAT、POD 和APX 活性均用蘇州科銘生物技術公司試劑盒進行測定；Pro、SS 和SP 含量參考李合生等[13]的茚三酮顯色法、蒽酮硫酸法和考馬斯亮藍法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2018 軟件繪制柱形圖；采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理，計算平均值和標準差；使用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對水稻植株生長和菌根侵染率的影響

從表1 可見，與CK 相比，AMF 處理并不能顯著增加植株的生物量和株高；與CK 相比，SA 處理后津源85 和遼粳763 的株高、地上部干物質(zhì)量和根部干物質(zhì)量 分 別 降 低12.31% 、39.07% 、62.07% 和14.47% 、24.46%、60.16%；與SA 處理相比，SA+AMF 處理后津源85 和遼粳763 的株高、地上部和根部干物質(zhì)量分別提高10.08%、28.45%、42.07%和4.33%、19.57%、49.59%。菌根侵染率可以作為AMF 提高植物抗逆性效果的指標。鹽堿脅迫下，津源85 和遼粳763 的菌根侵染率均有所降低。

表1 不同處理下水稻生物量、株高和菌根侵染率

2.2 對水稻植株MDA 和H2O2 含量的影響

從圖1 可見，與CK 相比，AMF 處理下兩品種的MDA 和H2O2含量無顯著差異，而鹽堿脅迫會顯著增加兩品種的MDA 和H2O2含量，津源85 和遼粳763 植株葉片MDA 和H2O2含量分別顯著提高56.25%、30.05%和39.64%、16.31%。SA+AMF 處理下津源85 和遼粳763 植株葉片MDA 和H2O2含量則分別較SA 處理降低了19.84%、10.18%和3.70%、10.03%。不同品種間MDA 含量差異顯著，遼粳763 在CK、SA、AMF、SA+AMF 處理下的MDA 含量分別是津源85 的3.8、3.4、3.7、3.9 倍。由此可以看出，在脅迫條件下津源85 具有較高的抵抗能力，受到的損傷更輕。

圖1 不同處理下水稻植株的MDA 和H2O2 含量

2.3 鹽堿脅迫下AMF 對水稻植株抗氧化酶的影響

由圖2 可知，與CK 相比，AMF 處理下津源85 和遼粳763 的SOD 活性分別提高13.39%和4.38%，POD分別提高14.96%和13.37%，CAT 分別提高32.55%和10.61%，APX 分別提高19.38%和26.02%。鹽堿脅迫會抑制SOD、POD、CAT 和APX 的活性，鹽堿脅迫下，津源85 和遼粳763 在接種AMF（SA+AMF）后的SOD 活性較SA 處理分別提高20.67%和13.91%，POD 活性分別提高36.97%和52.85%，CAT 活性分別提高161.48%和35.26%，APX 活性分別提高93.68%和20.64%?？梢?，無論在鹽堿脅迫還是非脅迫條件下，接種AMF 均會提高水稻抗氧化酶活性，相比于遼粳763，AMF 對鹽堿脅迫下津源85 的酶活性提升更為顯著。

圖2 不同處理下水稻植株抗氧化酶活性

2.4 鹽堿脅迫下AMF 對水稻植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3 可知，無論津源85 還是遼粳763，CK 和AMF 處理間滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)差異不顯著。與CK 相比，SA處理的津源85 和遼粳763 Pro、SS 和SP 含量分別提高19.70%、34.82%、17.56%和34.50%、19.42%、12.05%。鹽堿脅迫條件下，與SA 處理相比，SA+AMF 處理的津源85 和遼粳763 Pro、SS 和SP 含量分別提高30.27%、13.59%、9.87%和26.58%、11.38%、9.37%?？梢?，在鹽堿脅迫下接種AMF 可顯著提升水稻葉片Pro、SS 與SP等滲透物質(zhì)的積累，這可能是因為其能通過改善滲透平衡，降低細胞水勢來緩解鹽堿脅迫的影響。

圖3 不同處理下水稻植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

3 討論

3.1 叢枝菌根促進鹽堿脅迫下水稻的生長

AMF 成功定殖宿主植物后會對其生長發(fā)育和養(yǎng)分吸收等產(chǎn)生直接或間接的影響，進而增強其對逆境的抵抗能力[14]。菌根侵染率反映了菌根形成和共生真菌對植物的親和力，可衡量其生態(tài)適應性[15]。EVELIN等[16]和SHARIFI 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，由于菌絲生長和形成孢子時受到鹽分的不利影響，AMF 侵染率會因鹽脅迫的存在而降低。本研究發(fā)現(xiàn)，AMF 可以成功侵染水稻植株且侵染率可達60%～70%，鹽堿混合脅迫會顯著降低AMF 侵染率，其中津源85 的定殖率要比遼粳763高，這可能是因為其具有更高的耐鹽堿性，進而營造了更優(yōu)越的根際環(huán)境，有利于叢枝菌根與水稻根系之間的互利共生[18]。鹽堿脅迫下定殖的AMF 可以顯著提高水稻株高、地上部和地下部干物質(zhì)量，這與前人在西瓜、紫花苜蓿以及牧草等旱地植物上的研究結(jié)果一致[19-21]。本研究表明，相對于鹽堿敏感品種遼粳763，AMF 對鹽堿脅迫下耐鹽堿水稻品種津源85 的株高及地上部干物質(zhì)量提升更為顯著，這可能是因為津源85 品種具有較高的AMF 定殖率，能更顯著促進其從所處環(huán)境中獲取水分和養(yǎng)分，緩解鹽堿脅迫危害。但是，在未脅迫條件下接種AMF 對這2 個水稻品種的株高和生物量均無顯著促進作用，與在紫花苜蓿[20]以及西瓜[19]幼苗上的研究結(jié)果不一致。這可能是AMF 對不同植物的菌根依賴性不同所致，也可能是環(huán)境條件等原因引起。此外，有研究表明，不同AMF 菌株的促生效果不同，例如，在西瓜上接種3 種不同的AMF 菌株后發(fā)現(xiàn)，摩西球囊霉（Glomus mosseae）侵染率最高、植株干物質(zhì)量更高[19]，表明植株的生長可能同時受到菌株促生能力的調(diào)控。

3.2 叢枝菌根能提高鹽堿脅迫下抗氧化酶活性和降低MDA 和H2O2 含量

在鹽堿脅迫條件下活性氧的過度合成對植物的其他代謝過程有毒害作用。MDA 和H2O2在植物體內(nèi)的含量可以在一定程度上反應植物受損傷程度和對逆境的抵抗能力。本研究表明，鹽堿脅迫下，2 個水稻品種葉片的MDA 與H2O2含量均顯著上升，這說明鹽堿脅迫加快了植物自由基產(chǎn)生的速度，使膜脂過氧化作用增強，引起膜脂的過氧化損傷。為了中和ROS，防止細胞氧化損傷，植物上調(diào)抗氧化防御系統(tǒng)。植物抗氧化系統(tǒng)可以通過SOD、POD、APX 和CAT 來消除因鹽堿脅迫而產(chǎn)生的過量ROS，減少活性氧自由基對膜質(zhì)的傷害和保護膜結(jié)構的完整性[22]。本研究中，無論是脅迫還是非脅迫條件下，2 個水稻品種接種AMF 后均不同程度提高了植株SOD、POD、CAT 和APX 活性，這可能是因為AMF 通過幫助SOD 和CAT 等抗氧化酶快速吸收其各自所需的微量元素，增強酶輔利用率而提高酶活力[23]，同時鹽堿脅迫下接種AMF，過氧化物酶系統(tǒng)活性提升，增強了活性氧的清除能力、減少MDA 與H2O2的過度積累，防止膜質(zhì)過氧化和增強對光合器官氧化脅迫的抵抗能力[24-25]。因此本研究證明，AMF 介入鹽堿脅迫可以通過提高SOD、POD 和CAT 等活性，降低水稻葉片MDA 和H2O2含量，緩解植物氧化損傷。

3.3 叢枝菌根影響鹽堿脅迫下水稻的滲透調(diào)節(jié)

在鹽堿脅迫下，植物可以通過滲透調(diào)節(jié)維持細胞膨脹和滲透平衡來穩(wěn)定亞細胞結(jié)構[26]。Pro、SS 和SP 是重要的滲透調(diào)節(jié)劑，它們通過維持細胞組織的含水量，從而幫助植物正常生長。AMF 對植物Pro 積累的作用效果不一[17,27]。本試驗中，鹽堿脅迫顯著增加了水稻體內(nèi)的Pro 含量，接種AMF 后其含量進一步增加（圖3），說明AMF 可能通過增強外部菌根菌絲對水分和養(yǎng)分的吸收，促進Pro 積累[28]，提高其滲透調(diào)節(jié)能力，避免脅迫下細胞的脫水死亡。逆境下SS 的積累也是水稻應對脅迫條件的重要生理響應，在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。本試驗中，與SA 處理相比，鹽堿脅迫下接種AMF 能夠誘導植株產(chǎn)生更多的SS，說明AMF 可能具有促進SS 間接轉(zhuǎn)化為Pro 和提供碳架參與新蛋白質(zhì)合成的作用[29]。接種AMF 后，脅迫下SP 含量的顯著增加，不但可以緩解因土壤低水勢對植物造成的迫害，還能在一定程度上提高水稻的耐鹽堿性。

4 結(jié)論

溫室盆栽條件下，根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices，編號BGC BJ09）可以成功侵染津源85 和遼粳763。鹽堿脅迫會降低菌根侵染率，耐鹽堿水稻品種津源85 與AMF 更能建立良好的共生關系。在鹽堿脅迫條件下，通過接種AMF 可以通過增強抗氧化酶（SOD、POD、CAT 和APX）活性和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（Pro、SS 和SP）含量來提高鹽堿脅迫下水稻植株的抗氧化能力與滲透調(diào)節(jié)能力，且對不同鹽堿敏感水稻品種的促生效果不同。因此，本試驗結(jié)果為鹽堿地區(qū)不同植物的叢枝菌根真菌接種研究提供了數(shù)據(jù)參考，為提高鹽堿土地的利用率增加了可能性。