鄧羿駃　王孟清　謝靜　胡燕　曾潔　羅菁　姚冰

〔摘要〕 目的 探討五虎湯通過(guò)調(diào)控miRNA-146a對(duì)幼齡哮喘大鼠氣道重塑的影響。方法 SPF級(jí)幼齡雌性SD大鼠80只，先隨機(jī)將20只作為空白組，60只作為造模組。造模組采用卵清白蛋白聯(lián)合氫氧化鋁五點(diǎn)注射法致敏以及卵清白蛋白霧化激發(fā)哮喘。兩組各隨機(jī)抽取10只檢測(cè)氣道反應(yīng)性，評(píng)判造模是否成功。造模成功后，剩下的10只空白組大鼠作為正常組，50只造模組大鼠隨機(jī)分為5組（模型組、五虎湯低劑量組、五虎湯中劑量組、五虎湯高劑量組、地塞米松組），每組10只。五虎湯高、中、低劑量組分別灌胃五虎湯4.428、2.214、1.107 g/kg，地塞米松組灌胃地塞米松0.075 mg/kg，正常組及模型組灌胃等容積生理鹽水，1次/d，連續(xù)2周后處理大鼠。氣道反應(yīng)性檢測(cè)大鼠氣道阻力；HE、PAS及Masson染色法分別觀察大鼠肺組織氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道黏液儲(chǔ)備和氣道膠原沉積情況；Western blot法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9， MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1， TIMP-1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）蛋白表達(dá)水平；qPCR法檢測(cè)miRNA-146a及MMP-9、TIMP-1 mRNA含量，并對(duì)miRNA-146a與MMP-9、TIMP-1 mRNA進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 與空白組比較，造模組氣道阻力顯著升高（P<0.01），提示造模成功。與正常組比較，模型組大鼠肺組織周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞化生，炎性黏液較多，氣道壁增厚，氣道膠原廣泛沉積；肺組織α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，五虎湯高、中、低劑量組及地塞米松組氣道阻力明顯降低（P<0.01），肺組織病理情況明顯緩解，且五虎湯高劑量組及地塞米松組改善更加明顯；α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均顯著下降（P<0.01）。五虎湯中、低劑量組α-SMA、TGF-β1、miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA及五虎湯低劑量組TIMP-1顯著高于地塞米松組（P<0.05、P<0.01）；五虎湯高、中劑量組α-SMA、TIMP-1、miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA及五虎湯高劑量組TGF-β1低于五虎湯低劑量組（P<0.05、P<0.01）；五虎湯高劑量組α-SMA、TGF-β1、miRNA-146a、TIMP-1 mRNA低于五虎湯中劑量組（P<0.05、P<0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，大鼠肺組織miRNA-146a與MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均有極強(qiáng)正相關(guān)性（r分別為0.956、0.973，P<0.01）。結(jié)論 五虎湯能夠有效改善哮喘大鼠氣道重塑，這可能與五虎湯抑制miRNA-146a表達(dá)，降低MMP-9、TIMP-1及其mRNA，以及減少α-SMA、TGF-β1相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 五虎湯；幼齡哮喘大鼠；miRNA-146a；氣道重塑；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；金屬蛋白酶組織抑制因子-1；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.007

Improvement of Wuhu Decoction on airway remodeling in young asthmatic rats by

regulating miRNA-146a

DENG Yijue WANG Mengqing XIE Jing HU Yan ZENG Jie LUO Jing YAO Bing

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Shenzhen Nanshan District Shekou People's Hospital， Shenzhen， Guangdong 154100， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of Wuhu Decoction （WHD） on airway remodeling in young asthmatic rats by regulating miRNA-146a. Methods A total of 80 young female SD rats of SPF grade were randomly divided into blank group （n=20） and modeling group （n=60）. To stimulate asthma， the modeling group was sensitized by ovalbumin （OVA） combined with aluminum hydroxide five-point injection and OVA atomization. Ten rats were randomly selected from each group to detect airway responsiveness and evaluate the success of modeling. After successful modeling， the remaining 10 rats in the blank group were considered as the normal group， and 50 rats in the modeling group were randomly subdivided into 5 groups （model group， low-， medium- and high-dose WHD groups， and dexamethasone group）， with 10 rats in each group. The high-， medium- and low-dose WHD groups were respectively given WHD 4.428， 2.214， 1.107 g/kg by gavage， the dexamethasone group was given dexamethasone 0.075 mg/kg by gavage， and the normal group and model group were given equal volume physiological saline by gavage， once a day， for 2 consecutive weeks. Then the rats were anaesthetized and tracheotomized. The airway resistance in rats was measured by airway responsiveness; the airway inflammatory cell infiltration， airway mucus reserve， and airway collagen deposition in lung tissue of rats were observed respectively by HE， PAS and Masson staining methods; the expression levels of the matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1 （TIMP-1）， α-smooth muscle actin （α-SMA） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） protein were determined by Western blot; the content of miRNA-146a， MMP-9， TIMP-1 mRNA was examined by qPCR and the correlation between miRNA-146a and MMP-9， TIMP-1 mRNA was analyzed. Results Compared with the blank group， the airway resistance in the modeling group was significantly higher （P<0.01）， which indicated the success of modeling. Compared with the normal group， the rats in the model group demonstrated as follows： inflammatory cell infiltration around the lung tissue， epithelial cell metaplasia， more inflammatory mucus， airway wall thickening and extensive deposition of airway collagen; the α-SMA， TGF-β1， MMP-9， TIMP-1， miRNA-146a， MMP-9 mRNA and TIMP-1 mRNA expressions in lung tissue of rats in the model group were significantly higher （P<0.01）. Compared with the model group， the airway resistance in high-， medium- and low-dose WHD groups and the dexamethasone group was significantly lower （P<0.01）， and the pathological condition of lung tissue was significantly alleviated， moreover， the improvement in the high-dose WHD group and the dexamethasone group was more significant; the α-SMA， TGF-β1， MMP-9， TIMP-1， miRNA-146a， MMP-9mRNA， TIMP-1 mRNA expressions in high-， medium- and low-dose WHD groups and the dexamethasone group were significantly lower （P<0.01）. The α-SMA， TGF-β1， miRNA-146a， MMP-9 mRNA， and TIMP-1 mRNA expressions in medium- and low-dose WHD groups and the TIMP-1 of the rats in low-dose WHD group were significantly higher than those in the dexamethasone group （P<0.05， P<0.01）; the α-SMA， TIMP-1， miRNA-146a， MMP-9 mRNA， and TIMP-1 mRNA expressions in high- and medium-dose WHD groups and the TGF-β1 expression in high-dose WHD group were lower than those in low-dose WHD group （P<0.05， P<0.01）. The α-SMA， TIMP-1， miRNA-146a， and TIMP-1 mRNA expressions in the high-dose WHD group were lower than those in medium-dose WHD group （P<0.05， P<0.01）. Pearson correlation analysis showed that there was a strong positive correlation between miRNA-146a and MMP-9 mRNA， TIMP-1 mRNA in the lung tissue of rats （r=0.956， 0.973， P<0.01）. Conclusion WHD can effectively improve airway remodeling in asthmatic rats， which may be related to its inhibition of miRNA-146a expression and reduction of MMP-9， TIMP-1， mRNA， α-SMA and TGF-β1 expressions.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Wuhu Decoction; young asthmatic rats; miRNA-146a; airway remodeling; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1; α-smooth muscle actin; transforming growth factor-β1

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的支氣管慢性炎癥性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀[1]。此病兒童發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響患兒的身心健康，目前暫無(wú)根治性治療方案[2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、氣道重塑及機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)，跟遺傳也有一定關(guān)系[3]。氣道重塑由氣道壁的多種結(jié)構(gòu)變化組成，包括上皮損傷、上皮下纖維化、肌成纖維細(xì)胞增生、平滑肌纖維增加和血管增生等，造成管腔狹窄，是目前治療哮喘最棘手的問(wèn)題之一[4]。中醫(yī)治療哮喘有毒副作用小、療效佳的優(yōu)勢(shì)，逐漸被人們所接受，本課題組前期研究證實(shí)，古方五虎湯作為治喘名方，可有效緩解哮喘的氣道重塑[5]，但具體機(jī)制未完全闡明。隨著現(xiàn)代研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)生、發(fā)展與小分子RNA（microRNA， miRNA）表達(dá)異常相關(guān)[6]，且miRNA-146a是哮喘患者肺組織中表達(dá)最明顯的一類miRNA[7]。既往研究表明miRNA-146a能促進(jìn)增生細(xì)胞凋亡，在一定程度上能達(dá)到控制甚至逆轉(zhuǎn)支氣管哮喘氣道重塑的作用[8]，但具體機(jī)制尚未完全闡明。中醫(yī)藥通過(guò)調(diào)控miRNA-146a防治哮喘的研究仍處于初步階段。本研究旨在探討五虎湯通過(guò)調(diào)控miRNA-146a，對(duì)幼齡哮喘大鼠肺組織氣道重塑的影響，以進(jìn)一步明確五虎湯治療哮喘的可能效應(yīng)機(jī)制，為臨床提供新的診療思路。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠80只，3周齡，體質(zhì)量（86.3±4.3） g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物資格證書(shū)編號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；室溫18～20 ℃，濕度65%～70%，光照時(shí)間12 h/d，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)：ZYFY20220612。

1.2? 藥物制備

麻黃2.4 g、苦杏仁6.0 g、生石膏9.0 g、生甘草2.4 g、細(xì)茶葉4.8 g（生產(chǎn)批號(hào)分別為2202080302、2022030505、2201101、TH22050908、SC11443082100076），購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。將所有藥物混合，加入5倍量蒸餾水，先浸泡30 min，然后回流提取40 min，將藥液濾凈后再加入5倍量蒸餾水，再次回流提取40 min，將前后2次煎液混勻，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成2.46 kg/L。

1.3? 藥物與試劑

地塞米松（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：D1758）；雞卵清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：9006-59-1）；氯化乙酰膽堿（美國(guó)Selleck公司，批號(hào)：2260-50-7）；HE染色液（湖南艾佳生物科技股份有限公司，批號(hào)：P032IH）；Masson和PAS染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為：G1285、G1243）；β-actin抗體、山羊抗兔二抗（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：66009-1-Ig、SA00001-4）；MMP-9、TIMP-1、α-SMA、TGF-β1抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：573145、GR3281503-1、GR3231643-1、GR3219232-1）；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：15596026、K1622）；qPCR試劑盒（上海近岸生物科技有限公司，批號(hào)：PA0025）。

1.4? 主要儀器

超聲霧化器（南京道芬電子有限公司，型號(hào)：S888E）；小動(dòng)物呼吸機(jī)與氣道阻力和肺順應(yīng)性分析軟件（美國(guó)BUXCO公司，型號(hào)：DHX-50）；顯微鏡[麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司，型號(hào)：BA210T]；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（中國(guó)湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：H1650R）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-40D）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：PIKOREAL96）；透明霧化吸入箱（34 cm×45 cm×50 cm，課題組自制）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)SD大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法取20只作為空白組，60只作為造模組，參考文獻(xiàn)[9]復(fù)制哮喘大鼠模型。將造模組大鼠于試驗(yàn)第1天及第7天予卵清白蛋白與氫氧化鋁佐劑的混合液共1 mL（含1 mg卵清白蛋白和200 mg氫氧化鋁佐劑）五點(diǎn)（雙側(cè)足心、雙側(cè)腹股溝皮下、腹腔）注射致敏。于實(shí)驗(yàn)第15天開(kāi)始，將大鼠置于密封性良好的霧化箱中，予以1%卵清白蛋白溶液霧化以激發(fā)哮喘?？瞻捉M用生理鹽水霧化，每次持續(xù)30 min，隔天1次，連續(xù)2周。第30天，于兩組中各隨機(jī)取10只測(cè)氣道反應(yīng)性，氣道阻力升高提示造模成功。造模成功后，將造模組剩余的50只大鼠隨機(jī)分為5組（模型組、五虎湯低劑量組、五虎湯中劑量組、五虎湯高劑量組及地塞米松組），每組10只，剩余10只空白組大鼠作為正常組。于第31天開(kāi)始，根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)研究及人與大鼠體表面積比值折算，五虎湯各劑量組分別灌胃相應(yīng)劑量五虎湯（高、中、低劑量分別為4.428、2.214、1.107 g/kg），地塞米松組灌胃0.075 mg/kg地塞米松，正常組及模型組采用等容積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)2周。

2.2? 氣道反應(yīng)性測(cè)定

于末次霧化激發(fā)24 h后，從空白組和造模組中分別隨機(jī)抽取10只大鼠進(jìn)行氣道反應(yīng)性測(cè)定，驗(yàn)證造模是否成功。末次給藥24 h后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行氣道反應(yīng)性檢測(cè)。大鼠麻醉后切開(kāi)氣管，進(jìn)行氣管插管后，把大鼠放入體描箱中，連接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，頻率為75次/min，潮氣量為8 mL/kg，記錄初始的氣道壓力、流速以及潮氣量變化，待大鼠氣道壓力平穩(wěn)后，霧化吸入0.1 mL不同濃度的乙酰膽堿（0、6.25、12.5、25、50 μg/mL），每次吸入乙酰膽堿后，收集吸入后5 s至1 min的數(shù)據(jù)，并用動(dòng)物肺功能分析軟件計(jì)算出最大肺阻力。

2.3? 肺組織病理檢測(cè)

取左側(cè)肺組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，分別用HE、PAS、Masson 3種染色方法對(duì)標(biāo)本染色，鏡下觀察并拍照，觀察肺組織的病理變化。

2.4? Western blot法檢測(cè)肺組織α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)水平

取右肺組織提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入α-SMA（0.5 μg/mL）、TGF-β1（1∶1000）、MMP-9（1∶1000）、TIMP-1（1∶5000）、β-actin（1∶5000）抗體孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10 min。加入PBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌3次，每次10 min。采用凝膠成像系統(tǒng)成像掃描，用Quantity One 4.6.6軟件進(jìn)行灰度分析。

2.5? qPCR法檢測(cè)肺組織miRNA-146a及MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)情況

取右肺組織約0.02 g，加入1 mL Trizol于勻漿器中充分研磨勻漿，混勻后室溫裂解5 min；加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離心半徑9 cm。取上層液，轉(zhuǎn)移到新的RNase-Free離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，離心半徑9 cm，去上清液，加入1 mL75%乙醇（無(wú)菌DEPC處理水配制）洗滌沉淀；12 000 r/min，4 ℃離心3 min，離心半徑9 cm，去上清液；空氣干燥5～10 min。加入20～30 μL無(wú)菌無(wú)酶水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，在260 nm與280 nm處測(cè)其吸光度值，并計(jì)算其濃度。各指標(biāo)引物由北京擎科生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)表1。

2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果用“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD法；相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 空白組與造模組氣道阻力比較

在乙酰膽堿濃度為0時(shí)，兩組氣道阻力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模組大鼠在不同濃度乙酰膽堿（6.25、12.5、25、50 μg/mL）激發(fā)下，均比空白組大鼠的氣道阻力明顯增高（P<0.01），說(shuō)明造模成功。詳見(jiàn)表2。

3.2? 各組大鼠氣道阻力比較

在乙酰膽堿濃度為0時(shí)，各組氣道阻力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在其他濃度乙酰膽堿（6.25、12.5、25、50 μg/mL）激發(fā)下，模型組大鼠的氣道阻力均比正常組大鼠明顯增高（P<0.01）；與模型組相比，五虎湯各組及地塞米松組大鼠氣道阻力均顯著降低（P<0.01）；與地塞米松組相比，五虎湯中、低劑量組氣道阻力明顯升高（P<0.01）；與五虎湯低劑量組相比，五虎湯高、中劑量組大鼠氣道阻力明顯降低（P<0.01）；與五虎湯中劑量組相比，五虎湯高劑量組大鼠氣道阻力顯著下降（P<0.01）。詳見(jiàn)表3。

3.3? 各組大鼠染色情況比較

3.3.1? HE染色觀察氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況? 正常組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)正常，支氣管黏膜平整，氣管四周無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型組可見(jiàn)氣管四周有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；五虎湯低、中、高劑量組和地塞米松組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。詳見(jiàn)圖1。

3.3.2? PAS染色觀察氣道黏液儲(chǔ)備情況? 正常組大鼠支氣管管腔完整，無(wú)明顯氣道杯狀上皮細(xì)胞增生，無(wú)明顯黏液；與正常組相比，模型組大鼠支氣管氣道杯狀上皮細(xì)胞增生，黏液較多；與模型組相比，五虎湯低、中、高劑量組以及地塞米松組上述肺組織損傷情況均有所緩解。詳見(jiàn)圖2。

3.3.3? Masson染色觀察氣道膠原沉積情況? 正常組大鼠支氣管形態(tài)規(guī)則，管腔完整，無(wú)明顯氣道膠原沉積；與正常組相比，模型組大鼠氣道壁增厚，氣道膠原廣泛沉積；與模型組相比，五虎湯低、中、高劑量組以及地塞米松組上述肺組織損傷情況均有所緩解。詳見(jiàn)圖3。

3.4? 各組大鼠肺組織α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)比較

模型組α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1均顯著高于正常組（P<0.01）；五虎湯低、中、高劑量組及地塞米松組α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1較模型組均顯著下降（P<0.01）；五虎湯中、低劑量組α-SMA、TGF-β1及五虎湯低劑量組TIMP-1顯著高于地塞米松組（P<0.05，P<0.01）；五虎湯中、高劑量組α-SMA、TIMP-1及五虎湯高劑量組TGF-β1低于五虎湯低劑量組（P<0.05、P<0.01）；五虎湯高劑量組α-SMA、TGF-β1低于五虎湯中劑量組（P<0.05、P<0.01）。詳見(jiàn)表4、圖4。

3.5? 各組大鼠肺組織miRNA-146a及MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)情況比較

模型組miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均顯著高于正常組（P<0.01）；五虎湯低、中、高劑量組及地塞米松組miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均顯著低于模型組（P<0.01）；五虎湯中、低劑量組miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均高于地塞米松組（P<0.01，P<0.05）；五虎湯中、高劑量組miRNA-146a、MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均顯著低于五虎湯低劑量組（P<0.01）；五虎湯高劑量組miRNA-146a、TIMP-1 mRNA低于五虎湯中劑量組（P<0.05）。詳見(jiàn)表5。

3.6? 肺組織miRNA-146a與MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA相關(guān)性分析

大鼠肺組織miRNA-146a水平與MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均有極強(qiáng)、正相關(guān)性（r分別為0.956、0.973，P<0.01），MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA呈極強(qiáng)、正相關(guān)性（r為0.947，P<0.01）。詳見(jiàn)表6。

4 討論

支氣管哮喘是兒科常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病理改變主要表現(xiàn)為慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑等。氣道重塑主要表現(xiàn)為上皮下纖維化伴基底膜增厚、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞聚集、纖維生長(zhǎng)因子分泌增加、近端氣道上皮下細(xì)胞外基質(zhì)沉積、氣道平滑肌增厚、杯狀細(xì)胞增生、血管再生等一系列復(fù)雜改變[10-11]，是哮喘治療最為棘手的問(wèn)題。古方五虎湯由麻黃、苦杏仁、生石膏、生甘草、細(xì)茶葉組成，具有清肺化痰、止咳平喘之效，本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，五虎湯可以有效緩解氣道重塑[5]，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。

本研究通過(guò)卵清白蛋白與氫氧化鋁佐劑的混合液五點(diǎn)注射致敏以及卵清白蛋白霧化以激發(fā)哮喘，成功建立幼齡大鼠哮喘模型，造模組氣道阻力升高，提示造模成功。治療后發(fā)現(xiàn)，五虎湯可有效降低大鼠氣道阻力。而肺組織病理學(xué)結(jié)果提示模型組氣管四周可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管氣道杯狀上皮細(xì)胞增生，黏液較多，氣道壁增厚，氣道膠原廣泛沉積，而五虎湯各組及地塞米松組上述表現(xiàn)均明顯好轉(zhuǎn)，可見(jiàn)五虎湯可明顯改善哮喘小鼠的氣道重塑及氣道炎癥，減少黏液儲(chǔ)備。

既往研究表明，α-SMA是反映哮喘氣道平滑肌細(xì)胞數(shù)量的敏感指標(biāo)，是哮喘早期氣道重塑的重要指標(biāo)之一，能促進(jìn)膠原的沉積及纖維化，還能誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞聚集，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，加速氣道重塑的形成[12-13]。此外，TGF-β1能夠刺激支氣管哮喘患兒氣道平滑肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)氣道細(xì)胞向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成及上皮膠原沉積，進(jìn)一步促進(jìn)哮喘氣道重塑[14-15]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，幼齡哮喘大鼠肺組織α-SMA、TGF-β1顯著上升，進(jìn)一步說(shuō)明了氣道重塑的形成，與上述研究結(jié)果一致，經(jīng)過(guò)五虎湯干預(yù)后，α-SMA、TGF-β1值均明顯下降，進(jìn)一步說(shuō)明了五虎湯對(duì)氣道重塑有明顯的緩解作用。

miRNA是非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度約2125核糖核苷酸[16]。越來(lái)越多證據(jù)顯示，miRNA參與不同生物進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、變異和凋亡[17]。哮喘作為一種多基因遺傳病，其發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明[18]。而現(xiàn)有的研究顯示，miRNA對(duì)靶基因mRNA的調(diào)控作用在哮喘的發(fā)展和發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[19]。miRNA-146a是哮喘患者肺組織中表達(dá)最明顯的一類miRNA，并在哮喘的發(fā)展過(guò)程中存在異常表達(dá)[7]。本研究結(jié)果顯示，模型組miRNA-146a表達(dá)顯著升高，這與汪成偉等[20]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)五虎湯干預(yù)后，miRNA-146a表達(dá)顯著降低，說(shuō)明五虎湯治療哮喘的效應(yīng)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)miRNA-146a相關(guān)。

MMP-9是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的主要限速酶，與TIMP-1共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)的正常生長(zhǎng)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[21]。MMP-9可以通過(guò)降解以Ⅳ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)和血管中的膠原成分，誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖、分化、遷移至氣道壁和血管外，增加平滑肌肌層厚度和促進(jìn)新生血管形成，引發(fā)氣道重塑[22]。TIMP-1通過(guò)與MMP-9發(fā)生特異性結(jié)合而抑制MMP-9的活性，阻礙細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使其在氣道內(nèi)過(guò)度沉積而引起氣道壁增厚，進(jìn)而導(dǎo)致氣道重塑[23]。因此，通過(guò)調(diào)控MMP-9和TIMP-1可以干預(yù)哮喘氣道重塑。高風(fēng)麗等[24]證實(shí)，平喘顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制MMP-9和TIMP-1的表達(dá)來(lái)減輕哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變，改善氣道重塑。本研究結(jié)果顯示，模型組肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白及其mRNA表達(dá)明顯上升，提示MMP-9、TIMP-1上升是氣道重塑的重要機(jī)制，經(jīng)五虎湯干預(yù)后，MMP-9和TIMP-1蛋白及其mRNA表達(dá)顯著降低，提示五虎湯可通過(guò)降低MMP-9和TIMP-1有效改善氣道重塑。此外，相關(guān)性分析顯示，大鼠肺組織miRNA-146a水平與MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA均有極強(qiáng)、正相關(guān)性，而miRNA對(duì)mRNA有靶向調(diào)控作用，因此，五虎湯可能通過(guò)miRNA-146a靶向調(diào)控MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA影響氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，五虎湯能夠有效改善哮喘大鼠氣道重塑，這可能與五虎湯通過(guò)抑制miRNA-146a的表達(dá)，從而降低MMP-9、TIMP-1及其mRNA，以及減少α-SMA、TGF-β1相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處，未使用miRNA-146a抑制劑及激動(dòng)劑進(jìn)行干預(yù)，后續(xù)將繼續(xù)從細(xì)胞層次進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] PAPI A， BRIGHTLING C， PEDERSEN S E， et al. Asthma[J]. Lancet， 2018， 391（10122）： 783-800.

[2] MURRAY C S， JACKSON D J， TEAGUE W G. Prevention and outpatient treatment of asthma exacerbations in children[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2021， 9（7）： 2567-2576.

[3] CASTILLO J R， PETERS S P， BUSSE W W. Asthma exacerbations： Pathogenesis， prevention， and treatment[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2017， 5（4）： 918-927.

[4] 白詩(shī)瑤， 任? 媛， 李孟露， 等. 支氣管哮喘氣道血管再生與重塑的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際呼吸雜志， 2020， 40（18）： 1399-1404.

[5] 張? 鑫， 王孟清， 羅銀河， 等. RSV誘導(dǎo)哮喘小鼠樹(shù)突細(xì)胞自噬機(jī)制及五虎湯的干預(yù)作用[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 41（1）： 39-45.

[6] SHARMA R， TIWARI A， MCGEACHIE M J. Recent miRNA research in asthma[J]. Current Allergy and Asthma Reports， 2022， 22（12）： 231-258.

[7] STORLIE C B， BRANDA M E， GIONFRIDDO M R， et al. Prediction of individual outcomes for asthma sufferers[J]. Biostatistics， 2018， 19（4）： 579-593.

[8] 何桂媛， 李文新， 王? 莉， 等. miR-146在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2018， 34（10）： 1737-1739.

[9] 梁? 磊， 張宇婧， 李淑娣， 等. 搜風(fēng)愈喘方抑制哮喘大鼠氣道重塑的作用機(jī)制研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2022， 33（1）： 50-56.

[10] CAMORETTI-MERCADO B， LOCKEY R F. Airway smooth muscle pathophysiology in asthma[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2021， 147（6）： 1983-1995.

[11] BOULET L P. Airway remodeling in asthma： Update on mechanisms and therapeutic approaches[J]. Current Opinion in Pulmonary Medicine， 2018， 24（1）： 56-62.

[12] 姚歡歡， 陳? 吉， 李? 嵐. 桔梗多糖對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技， 2020， 27（5）： 701-707.

[13] JEROME J A， WENZEL S E， TREJO BITTAR H E. Digital imaging analysis reveals reduced alveolar α-smooth muscle actin expression in severe asthma[J]. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology， 2021， 29（7）： 506-512.

[14] 沈王豐， 肖? 磊， 梁小紅， 等. “平喘湯”通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制哮喘大鼠氣道重塑機(jī)制研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥， 2023， 55（1）： 67-72.

[15] YUAN J， ZHANG W. Expression and significance of TGF-β1 in infant asthma model[J]. Cellular and Molecular Biology， 2022， 68（7）： 51-55.

[16] BUSHATI N， COHEN S M. microRNA functions[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology， 2007， 23： 175-205.

[17] 郭慧葛， 孫四玉， 林? 飛， 等. circRNA/miRNA/mRNA的生物學(xué)功能及其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志， 2023， 31（1）： 80-87.

[18] GOMEZ J L. Epigenetics in Asthma[J]. Current Allergy and Asthma Reports， 2019， 19（12）： 56.

[19] LI J， PANGANIBAN R， KHO A T， et al. Circulating microRNAs and treatment response in childhood asthma[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine， 2020， 202（1）： 65-72.

[20] 汪成偉， 王? 飛， 李東濤， 等. miR-146a在哮喘患兒痰液的表達(dá)及對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展， 2017， 23（6）： 583-586.

[21] 范改煥， 禹香菊， 趙憲文. 支氣管哮喘患兒血清IgE和痰液MMP-9、TNF-α表達(dá)關(guān)系及意義[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2019， 37（1）： 82-84.

[22] BARBARO M P， SPANEVELLO A， PALLADINO G P， et al. Exhaled matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） in different biological phenotypes of asthma[J]. European Journal of Internal Medicine， 2014， 25（1）： 92-96.

[23] HE Q， LIU C， SHEN L， et al. Theory of the exterior-interior relationship between the lungs and the large intestine to explore the mechanism of Eriobotrya japonica leaf water extract in the treatment of cough variant asthma[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2021， 281： 114482.

[24] 高風(fēng)麗， 李竹英. 平喘顆粒對(duì)哮喘小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1水平的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)急癥， 2021， 30（2）： 230-232， 237.