劉晶榮 代思奇 劉才磊 向元芬 李意峰 潘遠(yuǎn)智 賈茵

摘要 為我國(guó)特有易危種麗江百合（Lilium lijiangense）的種質(zhì)資源保護(hù)、快速繁殖及園林應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，以野生麗江百合鱗片為外植體，探究其最佳滅菌方法，鱗莖不同部位誘導(dǎo)不定芽的能力，以及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)麗江百合愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)、不定芽增殖、生根結(jié)鱗莖的影響。結(jié)果表明，麗江百合鱗片最佳滅菌方案為5% NaClO 8 min+75%乙醇30 s；鱗片分化能力為基部>中部>上部；愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最佳生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.01 mg/L IBA。該研究成功建立了一套適宜麗江百合的組織培養(yǎng)和再生體系。

關(guān)鍵詞 麗江百合；組織培養(yǎng)；再生體系；鱗片；快速繁殖

中圖分類(lèi)號(hào) S682.2+65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2023）09-0038-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.010

Abstract In order to lay a foundation for the germplasm protection，rapid propagation and garden application of Lilium lijiangense，an endemic vulnerable species in China，this paper took the scales of wild L.lijiangense as explants，the best sterilization method，the ability of inducing adventitious buds in different scale parts，and the effects of different plant growth regulators on callus and adventitious bud induction，bud proliferation，rooting and buld proliferation of L.lijiangense were studied.The results were as follows：The best sterilization scheme was 5% NaClO 8 min+75% alcohol 30 s;The differentiation ability of scales was base>middle>upper; The best medium for callus and adventitious bud induction was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA; The best medium for adventitious bud proliferation was MS +1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;The best rooting and bulb proliferation medium was 1/2MS+0.1mg/L NAA+0.01 mg/L IBA.Overall，a set of tissue culture and regeneration system suitable for L.lijiangense is successfully established.

Key words Lilium lijiangense;Tissue culture;Regeneration system;Scale;Rapid propagation

基金項(xiàng)目 大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2121998000）；國(guó)家自然科學(xué)基金（32001356）。

作者簡(jiǎn)介 劉晶榮（1999—），女，四川自貢人，從事園林植物資源與應(yīng)用研究。*通信作者，副教授，博士，從事園林植物資源與應(yīng)用研究。

百合（Lilium spp.）即百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物的統(tǒng)稱(chēng)。百合花大姿麗，有色有香，具有很高的觀賞價(jià)值，適宜作切花、盆花、花壇、花境等，還具有食用和藥用價(jià)值［1］。百合屬原產(chǎn)于中國(guó)，主要分布在北半球的溫帶地區(qū)，如東亞、歐洲和北美。該屬植物約109種，中國(guó)有55種。麗江百合（L.lijiangense）為多年生球根花卉，分布于我國(guó)四川西部及云南西北部海拔3 300～3 400 m林下。其花序總狀，花漏斗形，花被片反卷，黃色，有紫色斑點(diǎn)，先端紅色，有極高的觀賞價(jià)值［2］。由于自然災(zāi)害和人為破壞的影響，麗江百合自然條件下更新困難，野生資源十分稀少，已被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）中［3］，屬易危種。因此對(duì)麗江百合資源開(kāi)展保護(hù)和繁育研究迫在眉睫。

百合傳統(tǒng)的繁殖方法有分球繁殖、鱗片扦插和珠芽繁殖等［4］，存在繁殖系數(shù)較低、時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)勞動(dòng)力、受限于當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件和地理位置等缺點(diǎn)［5］，這在一定程度上限制了麗江百合資源的保護(hù)和利用。植物組織培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有繁殖系數(shù)高、周期短、不受季節(jié)和自然條件限制、便于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于百合的離體快速繁殖中［6］。目前，尚未見(jiàn)麗江百合離體再生和快繁體系構(gòu)建的報(bào)道。

筆者以野生麗江百合鱗片不同部位為外植體，選用不同的培養(yǎng)基，采用不同滅菌時(shí)間，通過(guò)培養(yǎng)基中加入不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，探究麗江百合鱗片最佳的滅菌時(shí)間組合；外植體最佳部位；培養(yǎng)基中6-BA、2，4-D、NAA等激素不同配比方式以及不同濃度對(duì)麗江百合不定芽和愈傷組織的影響；無(wú)菌苗繼代擴(kuò)繁的最佳激素配比；麗江百合最佳生根培養(yǎng)基。最終利用組培快繁技術(shù)獲得麗江百合組培苗，建立完善的麗江百合再生體系，為該種質(zhì)的資源保護(hù)、育種及開(kāi)發(fā)提供了有利的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)環(huán)境

以原產(chǎn)于四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣的野生麗江百合種球?yàn)椴牧?，存放在濕?rùn)的木屑中，放置于（4±1）℃冰箱中低溫保存。選取種球鱗片為外植體。

試驗(yàn)于2020年10月至2021年10月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)（103°51′E，30°42′N(xiāo)）組織培養(yǎng)室進(jìn)行。光照條件為2 000 lx，光照10 h/d，溫度控制在（25±1）℃，空氣相對(duì)濕度70%～80%。

1.2 培養(yǎng)基配方

啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS及1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均添加30 g/L 蔗糖和6.5 g/L 瓊脂，pH 5.8～6.0。預(yù)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA。愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1～2 mg/L 6-BA、0.1～0.5 mg/L NAA和1～2 mg/L 2，4-D。不定芽繼代增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1～3 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA。生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1 mg/L 6-BA和0～0.05 mg/L IBA。在121 ℃下高壓滅菌20 min。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 外植體消毒及接種

選取生長(zhǎng)情況良好、健康、無(wú)病的鱗片，用洗潔精洗去表面污漬后置于燒杯中，用紗布封口，流水下沖洗3 h。在超凈工作臺(tái)上將鱗片用75%乙醇浸泡30 s，再用5% NaClO溶液處理6～10 min（表1），無(wú)菌水沖洗3～5次。消毒完畢后，將鱗片分割為0.5 cm×0.5cm小塊，接種于預(yù)培養(yǎng)基上。20 d后統(tǒng)計(jì)污染率。

1.4 鱗片不同部位外植體再生能力比較

取種球接近中心部位的鱗片按照約0.5 cm×0.5 cm的規(guī)格分割為上部、中部、基部3部分，分別接種在預(yù)培養(yǎng)基上（表2），進(jìn)行鱗片不同部位不定芽誘導(dǎo)率的對(duì)比。25 d后統(tǒng)計(jì)鱗片再生情況。

1.5 愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)

將上述試驗(yàn)所得最佳外植體部位接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。共設(shè)置9個(gè)處理（表3），30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.6 不定芽的繼代增殖

將誘導(dǎo)得到的不定芽切割成單芽，接種于增殖培養(yǎng)基中（表4）。觀察30 d記錄生長(zhǎng)情況。

1.7 生根結(jié)鱗莖培養(yǎng) 將株高3～4 cm生長(zhǎng)健壯的麗江百合不定芽幼芽單個(gè)切下，接種于生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基中（表5）。30 d后對(duì)組培苗的生根結(jié)鱗莖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.8 煉苗與移栽

當(dāng)苗高5～6 cm、根長(zhǎng)2～3 cm、根為乳白色至黃綠色時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于室溫下，逐漸將封口膜打開(kāi)，煉苗4～5 d。然后將苗小心取出，用自來(lái)水將根上培養(yǎng)基沖洗干凈，擦干。移栽到經(jīng)過(guò)50%赴美雙可濕性粉劑1∶500噴霧消毒的基質(zhì)中，基質(zhì)成分配比為珍珠巖∶營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1∶1 （V/V/V）。移栽60盆，每盆1株。移栽后澆透水，置于有散射光的陰涼處。7 d后進(jìn)行正常光照和常規(guī)水肥管理，觀察40 d其生長(zhǎng)情況。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)與繪圖；SPSS 22.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan方法進(jìn)行多重比較及差異顯著性檢驗(yàn)。

污染率=染菌數(shù)/接種總數(shù)×100%

成活率=成活數(shù)/接種總數(shù)×100%

繁殖系數(shù)=叢生芽數(shù)/接種總數(shù)

誘導(dǎo)率=出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

增殖倍數(shù)=增殖芽數(shù)/接種總芽數(shù)

生根率=生根組培苗數(shù)/接種組培苗數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體成活率及污染率的影響

由表1可知，使用5% NaClO不同滅菌時(shí)間處理下的外植體污染率和成活率有顯著差異。隨著滅菌時(shí)間的增加，外植體污染率逐漸下降，成活率則呈先增加后下降的趨勢(shì)。滅菌時(shí)間最短為6 min時(shí)，污染率最高，達(dá)76.67%；滅菌時(shí)間最長(zhǎng)為10 min時(shí)，污染率最低，但成活率僅為10.00%；滅菌時(shí)間為8 min時(shí)，成活率最高，達(dá)63.33%，此時(shí)污染率為20.00%。因此，綜合外植體污染率與成活率，滅菌時(shí)間8 min最宜，在相對(duì)較少的染菌情況下，保證外植體最大的成活率和分化可能性。

2.2 鱗片不同部位外植體再生能力比較 由表2可知，麗江百合的同一種球鱗片上、中、基部分化能力不同，差異顯著。分化能力從上到下依次增強(qiáng)，基部的分化能力最強(qiáng)，其繁殖系數(shù)為3.67；上部的分化能力最弱，繁殖系數(shù)為1.20。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，鱗片基部和中部所分化不定芽較上部更為粗壯、硬挺，鱗片上部分化不定芽植株矮小纖細(xì)、脆而易碎。

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)麗江百合誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的影響

麗江百合種球鱗片接種后4 d，鱗片漸漸由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙▓D1A）。19 d后，鱗片邊緣出現(xiàn)嫩綠色小凸起或黃白色愈傷組織。24 d后，原有凸起和愈傷組織的小凸起逐漸形成不定芽。由表3可知，處理④（2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）不定芽誘導(dǎo)率最高，為64.43%（圖1B），顯著高于其他處理；處理⑦（0.2 mg/L 6-BA+1 mg/L 2，4-D）不定芽誘導(dǎo)率最低，僅為2.23%（圖1C）。當(dāng)NAA濃度不變時(shí)，改變6-BA（1～2 mg/L）濃度，誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加而上升。但當(dāng)6-BA濃度為2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率反而隨著NAA濃度的增加而下降。在進(jìn)行麗江百合的組培時(shí)，可以適當(dāng)增加6-BA濃度，相對(duì)減少2，4-D濃度，這樣更有利于愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)。

2.4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)麗江百合不定芽增殖的影響

單芽移栽到增殖培養(yǎng)基一段時(shí)間后，叢生芽增殖逐漸趨于平穩(wěn)（圖1D）。由表4可知，不同處理之間差異顯著，處理②（2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）增殖倍數(shù)最大（圖1E），為4.62；處理③（3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）增殖倍數(shù)最小（圖1F），為1.84。由此可見(jiàn)，6-BA濃度變化對(duì)不定芽增殖影響很大，當(dāng)6BA濃度為2.0 mg/L時(shí)不定芽增殖效果最佳。另外，過(guò)高的6-BA濃度（3.0 mg/L）會(huì)造成不定芽的干枯，長(zhǎng)勢(shì)減弱。

2.5 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)麗江百合組培苗生根結(jié)鱗莖的影響

不定芽接種10 d左右逐漸形成小鱗莖，15 d后開(kāi)始生根并伴有鱗莖增殖。由表5可知，處理②（0.10 mg/L 6-BA+0.01 mg/L IBA）生根率（88.67%）和鱗莖增殖倍數(shù)（2.78）顯著高于其他處理，且鱗莖根部長(zhǎng)勢(shì)也最佳，根莖粗壯，呈黃綠色（圖1G）；處理③（0.10 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA）鱗莖增殖倍數(shù)和生根情況最差，鱗莖增值倍數(shù)僅為處理②的0.44倍，生根率僅為處理②的0.35倍。表明麗江百合小鱗莖生根結(jié)鱗莖對(duì)IBA敏感，在一定范圍增加IBA濃度能夠促進(jìn)生根數(shù)量和長(zhǎng)勢(shì)，過(guò)量則會(huì)起到抑制作用。

2.6 試管苗移栽

將生根苗進(jìn)行移栽，7 d后植株抽發(fā)新葉（圖1I），成活率可達(dá)95%。

3 結(jié)論與討論

研究表明，外植體生理狀態(tài)對(duì)組織培養(yǎng)起著關(guān)鍵作用，即便是同一百合種球的鱗片分化能力也存在差異，其鱗片產(chǎn)生愈傷組織或不定芽的能力從高到低依次為內(nèi)層、中層、外層［7］。該研究采用麗江百合內(nèi)層鱗片為外植體，避免了外層鱗片因衰老或損傷帶來(lái)的影響，有效地增加麗江百合分化可能性。該研究發(fā)現(xiàn)，麗江百合的鱗片上部、中部、基部分化能力也有差異，其中基部分化能力最強(qiáng)。外植體的部位與小鱗莖的發(fā)生之間有某種聯(lián)系，即肥厚的基部鱗片容易分化出小鱗莖，且繁殖系數(shù)顯著高于其他部位，這與王愛(ài)勤等［8］關(guān)于百合鱗片的研究結(jié)果一致。

在消毒過(guò)程中，NaClO的使用時(shí)間是關(guān)鍵。該研究采用5個(gè)不同消毒時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，當(dāng)消毒時(shí)間為6 min時(shí)，污染率達(dá)76.67%，而當(dāng)消毒時(shí)間為10 min時(shí)，污染率僅為3.33%。在污染率高的處理中，麗江百合鱗片幾乎不能存活。這說(shuō)明微生物在培養(yǎng)基中繁殖生長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重影響離體培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)甚至存活，這與柯義強(qiáng)等［5］在蘭州百合（L.davidii var.willmottiae）中的研究結(jié)果一致。當(dāng)消毒時(shí)間超過(guò)8 min時(shí)（8～10 min），雖然污染率大大下降，但同時(shí)鱗片成活率以及產(chǎn)生不定芽的能力也隨之而降低。這證明NaClO在一定時(shí)間范圍對(duì)麗江百合的消毒有效，當(dāng)超過(guò)時(shí)間限度時(shí)，便會(huì)對(duì)鱗片和不定芽產(chǎn)生毒害作用，這與Luis等［9］在洋蔥（Allium cepa）組培中的研究結(jié)果一致。

在進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時(shí)，通常將生長(zhǎng)素類(lèi)（NAA和2，4-D）與細(xì)胞分裂素類(lèi)（6-BA）搭配使用［10］。但進(jìn)行不同的百合組培時(shí)，濃度比例有較大差別［11-14］。當(dāng)6-BA濃度為2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的增加而下降，從64.43%（0.1 mg/L NAA）下降到37.77%（0.5 mg/L NAA）。即在6-BA處于較高濃度時(shí)，低濃度NAA有利于不定芽誘導(dǎo)。這可能是過(guò)量生長(zhǎng)素會(huì)引起乙烯生成，從而抑制了不定芽的誘導(dǎo)［15］。該研究中6-BA與2，4-D搭配也具有誘導(dǎo)效果，但沒(méi)有前者顯著，所以不予考慮。麗江百合的鱗片誘導(dǎo)過(guò)程中，鱗片易直接生長(zhǎng)不定芽，較少部分先產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織進(jìn)一步分化得到不定芽和小鱗莖，這與張文婷等［16］在金黃花滇百合（L.bakerianum var.aureum）組培中結(jié)果相反。這可能是鱗片周?chē)挠鷤M織導(dǎo)致輸導(dǎo)組織運(yùn)輸不暢，影響組培苗生長(zhǎng)［17］。由此可知，麗江百合的再生可直接采用鱗片進(jìn)行不定芽分化，此途徑較使用愈傷組織進(jìn)行分化更為方便快捷。

在生根和鱗莖增殖階段，一定濃度范圍內(nèi)的IBA對(duì)鱗莖生根具有促進(jìn)作用，但當(dāng)濃度超過(guò)一定限度時(shí)，IBA會(huì)加快百合根部老化，根的生長(zhǎng)便受到了抑制，這與張彥妮等［18］研究結(jié)果一致。此外，與韋海忠等［19］關(guān)于不同生根培養(yǎng)基對(duì)野生百合生根影響的研究有所不同的是，在麗江百合生根培養(yǎng)基中未添加活性炭。該研究的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加活性炭的試管苗皆出現(xiàn)葉片發(fā)白及植株枯萎的現(xiàn)象?；钚蕴坎粌H不能促進(jìn)生根，反而明顯地抑制生根，分析原因可能是活性炭吸附了培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素［20］。

該研究以麗江百合鱗片為外植體，120 d可完成不定芽及愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗、移栽等過(guò)程，最終成功實(shí)現(xiàn)麗江百合組織培養(yǎng)以及再生體系的建立，獲得大量健康的組培苗。與自然繁殖相比，該研究大大提高了其繁殖系數(shù)，為麗江百合種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳育種及園林應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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