木仁 王鑫 格根圖雅 馬媛 冉田田 陳志 徐文斌 李靜

關(guān)鍵詞：喀斯特山地：生態(tài)養(yǎng)雞：土壤理化性質(zhì)；土壤細菌：土壤真菌

蛋雞山地生態(tài)養(yǎng)殖條件下，因食物來源廣泛，補飼量減少，可達到一定節(jié)約飼料的效果，并可有效提高肉蛋品質(zhì)。借助山地生態(tài)環(huán)境的立體復(fù)合生產(chǎn)經(jīng)營，可提高土地利用效率，對企業(yè)／合作社和農(nóng)戶的增收具有重要意義。因此，山地生態(tài)養(yǎng)殖已成為家禽行業(yè)的重要發(fā)展方向。有研究發(fā)現(xiàn)，香榧林下養(yǎng)鵝可改變土壤細菌、真菌群落結(jié)構(gòu)，提高微生物多樣性；柑橘林下養(yǎng)雞可有效提高土壤養(yǎng)分含量，改善果品品質(zhì)：但桑園種草養(yǎng)雞可導(dǎo)致土壤出現(xiàn)酸化趨勢．棗園林下長期養(yǎng)雞會破壞土壤物理性質(zhì)。前人研究結(jié)果存在較大差異，主要與不同種養(yǎng)結(jié)合模式、地理環(huán)境及養(yǎng)殖條件等綜合因素有關(guān)。因此，有必要對不同區(qū)域、不同養(yǎng)殖條件下的土壤進行綜合評價，探索其變化規(guī)律，為生態(tài)養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)情報?；诖?，本研究以喀斯特山地生態(tài)養(yǎng)雞場為研究對象，分別對養(yǎng)殖區(qū)、輪休區(qū)和未養(yǎng)殖區(qū)的土壤理化性質(zhì)及菌群組成進行綜合評價，以期為喀斯特山地生態(tài)養(yǎng)雞提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗地位于貴州省長順縣鼓揚鎮(zhèn)某長順綠殼蛋雞山地生態(tài)養(yǎng)殖基地。該區(qū)域?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，氣候溫和、雨量充沛、陰雨天氣較多，年平均氣溫16℃，年平均降水量1260mm。

1.2試驗設(shè)計

在同一地域，以山地放養(yǎng)為影響因素，分別設(shè)置養(yǎng)殖區(qū)（CA組：連續(xù)放養(yǎng)3個月的區(qū)域，養(yǎng)殖密度為每666.7m260只）、輪休區(qū)（RA組：連續(xù)3個月未放養(yǎng)區(qū)域）和未養(yǎng)殖區(qū)（NCA組：從未放養(yǎng)的區(qū)域）。每個區(qū)域面積約666.7m2，于2020年7月11日按五點取樣法采集0～20cm土層鮮土樣，每區(qū)域5份，共15份。

1.3土壤理化性質(zhì)測定

參考陶彩蝶、盛茂銀等的試驗方法，采用環(huán)刀法測定容重；含水率測定采用烘干法（GB/7172-1987）；酸堿度用pH計（PHS-3C）測定；全氮含量測定采用凱氏定氮法（LY/T 1228-2015）；全磷和全鉀含量的測定采用堿熔法（LY/T1232-2015和LY/T 1234-2015）。

1.4土壤菌群結(jié)構(gòu)測定

利用Magen Hipure Soil DNA Kit提取土壤總DNA，使用Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度。參考木仁等的方法對細菌16SrRNA V3-V4區(qū)進行擴增，引物為F：5'-CCTACG-GRRBGCASCAGKVRVGAAT-3和R：5'-GGACT-ACNVGGGTWTCTAATCC-3。參考王燦等的方法對真菌ITS2區(qū)進行擴增，引物為F：5 7-GT-GAATCATCGARTC-3禾口R：5 7-TCCTCCGCTTAT-TGAT-3'。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過酶標儀（ Tecan，Mannedorf，Switzerland）檢測文庫濃度后，按Illumina MiSeq（ Illumina，SanDiego，CA，USA）儀器使用說明書進行雙端測序。測序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

參照相關(guān)文獻對數(shù)據(jù)進行整理，在97%相似水平下對所有序列進行OTU（operationaltaxonomic units）劃分，并進行生物信息統(tǒng)計分析，得到OTU代表序列。代表序列與Silva 132和U—NITE ITS數(shù)據(jù)庫進行比對，得到OTU對應(yīng)的物種分類信息?；赒iime 1.g.1計算Alpha多樣性指數(shù)。將土壤理化性質(zhì)、Alpha多樣性及菌群豐度數(shù)據(jù)導(dǎo)人SPSS 23.0軟件，滿足正態(tài)分布和方差齊性檢驗條件的數(shù)據(jù)運用單因素方差分析中的LSD法進行多重比較，不滿足正態(tài)分布條件的采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis法，結(jié)果均以平均值±標準差表示。基于Canoco5對土壤理化性質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)進行冗余分析（RDA）。采用Pearson相關(guān)分析探究土壤理化性質(zhì)與菌群豐度間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理土壤理化性質(zhì)比較

由圖1可知，土壤pH值從高到低的順序為NCA>RA >CA，處理間差異極顯著。含水率從高到低的順序為NCA>CA>RA，NCA與CA間差異顯著，與RA間差異極顯著。容重從高到低的順序為RA>CA>NCA．RA與CA和NCA間差異極顯著。全氮含量不同處理間差異不顯著。全磷含量從高到低的順序為CA >RA >NCA，CA與NCA間差異顯著。全鉀含量從高到低的順序為CA>RA>NCA，CA與RA間差異顯著，與NCA間差異極顯著。

2.2不同區(qū)域土壤菌群測序結(jié)果

由表1可知，CA、RA和NCA組細菌的原始序列在53303條以上，有效序列50167條以上，平均序列長度分別為451、455、454 bp，OTU數(shù)在5952個以上。CA、RA和NCA組真菌的原始序列43709條以上，有效序列數(shù)34706條以上，平均序列長度分別為338、349、350bp，OTU數(shù)在270個以上。

由圖2A可見，三組共有細菌OTU 4141個，CA組特有3113個，RA組特有5 497個，NCA組特有7637個。三組共有真菌OTU224個，CA組特有55個，RA組特有112個，NCA組特有99個（圖2B）。

2.3不同區(qū)域土壤菌群Alpha多樣性分析

如表2所示，土壤細菌Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，RA組的Ace指數(shù)和Chaol指數(shù)最高，顯著高于CA組。RA和NCA的Shannon和Simpson指數(shù)極顯著高于CA組。真菌Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，RA組的Ace指數(shù)顯著高于CA組，極顯著高于NCA組，CA組顯著高于NCA組。RA組的Chaol指數(shù)極顯著高于NCA組．CA組的Chaol指數(shù)顯著高于NCA組。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)各處理差異不顯著。

2.4不同區(qū)域土壤門水平上細菌和真菌相對豐度

共注釋到46個門的細菌，相對豐度高于1%的有12個。如表3所示，變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為各組優(yōu)勢菌門。與CA組相比，RA和NCA組的變形菌門、擬桿菌門、Latescibacteria和Rokubacteria的相對豐度增加，其中NCA組的變形菌門、擬桿菌門和Latescibacteria顯著或極顯著增加。與CA組相比，RA和NCA組的酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門和Patescibacteria的相對豐度降低，其中NCA組的酸桿菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門顯著或極顯著降低。NCA組的綠彎菌門極顯著高于CA和RA組．NCA組的疣微菌門極顯著低于RA組。

本研究共注釋到12個門的真菌，相對豐度高于1%的有6個。如表4所示，子囊菌門、擔(dān)子菌門和毛霉門為各組優(yōu)勢菌門，并存在大量未知真核生物（k_Eukaryota_ Unclassified）。與CA組相比，RA組的毛霉門極顯著增加，NCA組的毛霉門顯著降低。

2.5不同區(qū)域土壤理化性質(zhì)與茵群群落結(jié)構(gòu)間的關(guān)系

土壤理化性質(zhì)與主要細菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析（圖3）表明，第一、第二軸的解釋率分別為47.32%和25.12%，土壤pH值、全氮含量分別極顯著、顯著影響細菌群落結(jié)構(gòu)。pH值與擬桿菌門呈極顯著正相關(guān)，與變形菌門和Latescibacteria呈顯著正相關(guān)，與酸桿菌門和厚壁菌門呈極顯著負相關(guān)，與放線菌門呈顯著負相關(guān)。全氮含量與疣微菌門呈極顯著正相關(guān)，與硝化螺旋菌門呈顯著正相關(guān)，與綠彎菌門呈極顯著負相關(guān)。

土壤理化性質(zhì)與主要真菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析（圖4）表明，第一、第二軸的解釋率分別為38.32%和24.10%．全鉀含量和容重顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)。全鉀含量與子囊菌門呈極顯著正相關(guān)，與k—Eukaryota—Unclassified呈顯著負相關(guān)。容重與毛霉門和壺菌門呈顯著正相關(guān)。

3討論與結(jié)論

土壤pH值、氮、磷和鉀等土壤物理及養(yǎng)分特性是評價土壤系統(tǒng)質(zhì)量的重要指標。王介平等研究發(fā)現(xiàn)，桑園種草養(yǎng)雞后土壤出現(xiàn)酸化趨勢，并認為這一趨勢與雞糞中有機質(zhì)被土壤中微生物分解成有機酸等因素有關(guān)。陶彩蝶研究發(fā)現(xiàn)，在香榧林下養(yǎng)鵝導(dǎo)致土壤容重增高、含水率降低，并認為該現(xiàn)象與鵝長時間踩踏及植被減少而導(dǎo)致的土壤板結(jié)、滲透性弱有關(guān)。周乃富等研究發(fā)現(xiàn)，油茶林下養(yǎng)雞使土壤中鉀和磷的含量增加。以上結(jié)果與本研究的養(yǎng)殖區(qū)（CA）pH降低、容重增加、含水率降低及鉀、磷含量增高的結(jié)果相近。表明喀斯特山地長期連續(xù)養(yǎng)雞可造成土壤酸化、持水力減弱，鉀、磷含量增加。

細菌是土壤微生物中的最大類群，也是評價土壤健康與否的重要微生物指標之一。Chaol指數(shù)和Ace指數(shù)用來度量菌群豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映物種多樣性。王永宏等研究發(fā)現(xiàn)，短期牦牛重度放牧可導(dǎo)致土壤細菌Alpha多樣性呈減少趨勢。臧曉琳等研究發(fā)現(xiàn)，重度放牧條件下，冷蒿根際土壤微生物群落Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)極顯著降低（P<0.01）。本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖區(qū)細菌Alpha多樣性指數(shù)最低，并且相對于未養(yǎng)殖區(qū)（NCA），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)極顯著降低，與前人研究結(jié)果相近。輪休區(qū)（RA） Alpha多樣性指數(shù)最高。表明喀斯特山地長期連續(xù)養(yǎng)雞可造成細菌豐富度和多樣性降低，但輪休后可得到良好恢復(fù)。

真菌是土壤中非?；钴S的一類微生物群體，具有多種功能，包含有機質(zhì)的降解等，與土壤健康密切相關(guān)。黃維等研究發(fā)現(xiàn)，隨著放牧強度的增加，荒漠草原非植物根際土壤中可培養(yǎng)真菌的總量呈下降趨勢，尤其是表層（0～10cm）土壤中的真菌數(shù)量。楊晶晶等研究發(fā)現(xiàn)，重度放牧導(dǎo)致伊犁絹蒿荒漠草地土壤真菌Chaol指數(shù)顯著降低（P<0.05），Shannon指數(shù)無顯著變化。但陶彩蝶研究發(fā)現(xiàn)，香榧林下養(yǎng)鵝導(dǎo)致鵝活動區(qū)土壤真菌Chaol、Ace及Shannon指數(shù)增加，但不顯著（P>0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖區(qū)和輪休區(qū)（RA） Chaol指數(shù)和Ace指數(shù)顯著或極顯著高于未養(yǎng)殖區(qū)，與前人研究結(jié)果具有一定差異。指數(shù)變化表明，喀斯特山地養(yǎng)雞可導(dǎo)致土壤真菌豐富度明顯增加，但物種多樣性有所降低（Shannon指數(shù)最低）。輪休后真菌豐富度增加，物種多樣性也得到一定恢復(fù)（Shannon指數(shù)最高）。

本研究發(fā)現(xiàn)，土壤細菌的優(yōu)勢菌門為變形菌門（36.452%～42.378%）、酸桿菌門（23.362%～31.836%）和擬桿菌門（4.710%～11.488%）。相對于未養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖區(qū)的變形菌門和擬桿菌門顯著或極顯著降低，酸桿菌門極顯著增加。相關(guān)研究表明，荒漠草原放牧后土壤變形菌門豐度降低；高寒草地放牧區(qū)變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門均表現(xiàn)出降低趨勢，但無顯著差異（P>0.05）：香榧林下養(yǎng)鵝導(dǎo)致鵝活動區(qū)酸桿菌門豐度顯著下降（P<0.05）。以上研究的變形菌門和擬桿菌門變化趨勢與本研究相近，但酸桿菌門相對豐度變化與本研究有較大差異，具體原因需進一步探索。

本研究土壤優(yōu)勢真菌為子囊菌門（17.453%～31.368%）、擔(dān)子菌門（13.295%～19.737%）和毛霉門（7.253%～21.492%），并存在大量未知真核生物（k_Eukaryota—Unclassified，36.706%～52.867%）.大量研究表明，土壤優(yōu)勢真菌為子囊菌門和擔(dān)子菌門，與本研究結(jié)果相近，但不同區(qū)域優(yōu)勢菌門豐度具有較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于未養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖區(qū)和輪休區(qū)的子囊菌門和毛霉門表現(xiàn)出增加趨勢，擔(dān)子菌門和k_Eukaryota_Unclassified表現(xiàn)出下降趨勢。前人研究發(fā)現(xiàn)，荒漠草原放牧后土壤子囊菌門的相對豐度降低，擔(dān)子菌門的相對豐度升高。香榧林下養(yǎng)鵝、稻田養(yǎng)鴨后土壤子囊菌門豐度顯著下降（P<0.05），與本研究結(jié)果相比具有較大差異。土壤真菌群落組成除受地表植被、地理環(huán)境和土壤類型等因素影響外，還可能受到放養(yǎng)動物類別的影響，因此，土壤真菌豐度的差異性需從多種因素綜合考慮。

土壤為微生物的生存提供了環(huán)境條件，并認為土壤pH值和容重及水分、氮、磷和鉀含量是影響土壤菌群結(jié)構(gòu)的重要因子。本研究RDA分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH值、全氮含量分別極顯著、顯著影響細菌群落結(jié)構(gòu)。土壤pH值與6種細菌菌門豐度、全氮與3種細菌菌門豐度呈顯著或極顯著相關(guān)性。表明土壤pH值和全氮含量為細菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素。土壤全鉀和容重顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)，與細菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素具有一定差異．這可能與以上菌群的功能特性及環(huán)境互作機制有關(guān)。

綜上所述，喀斯特山地長期連續(xù)養(yǎng)雞可導(dǎo)致土壤酸化、持水力減弱及鉀、磷含量的增加；并造成細菌豐富度和多樣性及真菌多樣性的減少，而且對菌群結(jié)構(gòu)具有較大影響。輪休后以上情況得到較好改善。因此，在山地生態(tài)養(yǎng)殖中，應(yīng)避免同一地點連續(xù)養(yǎng)殖，并制定科學(xué)合理的輪休機制。