李光宗，韋偉，單守明*，馬軍，許文娣，邵潔玲

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2. 商洛學(xué)院，陜西商洛 726000）

‘雙優(yōu)’為我國(guó)育出的山葡萄新品種，在東北表現(xiàn)良好且具有較高的產(chǎn)量[1-2]。目前，對(duì)于葡萄的繁育方式主要以扦插和嫁接為主，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)捷方便，但易受母株、砧木及繁育周期長(zhǎng)等因素的限制，無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模繁育[3-4]。此外，長(zhǎng)期采取這些繁育方式，會(huì)造成嚴(yán)重的品種退化現(xiàn)象。組織培養(yǎng)具有成本低、速度快和操作程序簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，能夠有效避免時(shí)間、空間、氣候等條件限制[5]，加快優(yōu)良品種的推廣。目前已有許多關(guān)于葡萄組培方面的研究，涉及外植體選擇、愈傷組織誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)基篩選、煉苗及移栽[4-9]等方面，并取得相應(yīng)的成效。然而葡萄組培中仍存在著生根不穩(wěn)定、生根率不高等問(wèn)題，在一定程度上限制了組培技術(shù)的應(yīng)用。目前，關(guān)于‘雙優(yōu)’葡萄組培生根方面的研究鮮有報(bào)道，因此研究該品種枝條組培生根具有重要意義。

植物激素是植物體內(nèi)合成的微量有機(jī)化合物，參與調(diào)控植物生根、發(fā)芽、開花等各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，在植物組培生根中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。生長(zhǎng)素即吲哚乙酸（Indoleacetic acid, IAA）是調(diào)控生根最重要的激素[10]，以色氨酸作為底物，通過(guò)多條途徑合成，其中主要的合成途徑為吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvate, IPA）途徑[11]，而YUCCA家族黃素單加氧酶（Flavin monooxygenase-like）和色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1，TAA1）協(xié)同參與該途徑，從而合成生長(zhǎng)素[12]。近年來(lái)，葡萄組培快繁相關(guān)研究取得了重大進(jìn)展，其中培養(yǎng)基的類型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和配比均會(huì)影響葡萄組培苗的生根[6,9]，目前葡萄組培的相關(guān)研究著重于組培快繁體系建立等方面，而對(duì)于調(diào)控組培苗生根機(jī)理的研究較少。

基于此，以‘雙優(yōu)’葡萄枝條為試材，進(jìn)行組織培養(yǎng)至生根階段，篩選出較為合適的培養(yǎng)基后，通過(guò)正交設(shè)計(jì)以不同濃度的IBA、NAA和蔗糖進(jìn)行處理，以探究其對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄生根的作用，從而為該品種組培苗的繁育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘雙優(yōu)’葡萄組培所用外植體為帶芽莖段，于2021年7月在寧夏大學(xué)農(nóng)科實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)獲取。供試材料為兩年生‘雙優(yōu)’葡萄，廠式架式，南北行向，株行距為1.0 m×3.0 m。

1.2 組培試驗(yàn)方法[13]

1.2.1 外植體消毒

選取生長(zhǎng)健壯的‘雙優(yōu)’葡萄帶芽莖段，帶回實(shí)驗(yàn)室后用流水沖洗10 min。在超凈工作臺(tái)里用70%的乙醇溶液消毒45 s，之后用無(wú)菌水清洗3次并采用15%的H2O2溶液充分浸泡消毒6 min。取出后，再次用無(wú)菌水清洗4次。

1.2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)

將消毒的外植體切去兩端約5 mm后，接種至培養(yǎng)基中。啟動(dòng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS＋1.0 mg·L-16-BA＋0.2 mg·L-1NAA＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂。培養(yǎng)條件為：日光照時(shí)間16 h，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lx。

1.2.3 生根培養(yǎng)基篩選

當(dāng)初代培養(yǎng)的帶芽莖段芽長(zhǎng)5 cm左右時(shí)，于超凈工作臺(tái)上將長(zhǎng)勢(shì)較為均一的萌發(fā)枝條切取并轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，每瓶接1個(gè)莖段。生根培養(yǎng)基的篩選：采用0.3 mg·L-1IBA＋0.3 mg·L-1NAA＋25 g·L-1蔗糖＋7.5 g·L-1瓊脂，對(duì)1/2 B5、1/2 MS、1/2 WPM、B5、WPM及N6培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。培養(yǎng)條件為：日光照時(shí)間12 h，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lx。各培養(yǎng)基類型設(shè)置10個(gè)樣本，待15 d后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基中組培苗的生根情況，并計(jì)算平均生根數(shù)和生根率（不統(tǒng)計(jì)未生根的組培苗）。

1.2.4 生根培養(yǎng)

篩選出生根培養(yǎng)基后，采用不同濃度的IBA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1）、蔗糖（15、25、35 g·L-1）和NAA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1）進(jìn)行處理。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表1），各組設(shè)置10個(gè)樣本，各培養(yǎng)基瓊脂濃度7.5 g·L-1。培養(yǎng)條件同1.2.3。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 樣品獲得及主根數(shù)目和根長(zhǎng)測(cè)定

分別于生根處理后20、30、40 d觀察統(tǒng)計(jì)各處理10個(gè)樣本的主根數(shù)目，采用E-ruler軟件測(cè)定主根長(zhǎng)度（未生根的組培苗不做統(tǒng)計(jì)），并采集根系樣品。

1.3 根系內(nèi)源植物激素含量測(cè)定

委托上海酶聯(lián)生物科技有限公司，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）法測(cè)定根系中內(nèi)源植物激素生長(zhǎng)素（IAA）含量。

1.4 基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析

1.4.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Tiangen RNA試劑盒提取根系總RNA，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，使用NanoDrop 2000測(cè)定RNA的提取質(zhì)量，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。以總RNA為模板采用TaKara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.2 qRT-PCR試驗(yàn)條件

采用CWBIO熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，優(yōu)化后的條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸32 s。以VvEF基因（登錄號(hào)：AF176496）作為內(nèi)參，用2-△△CT算法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。各反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，運(yùn)用 Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2。

表2 qRT-PCR基因引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Excel 2021統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析和LSD法顯著性檢驗(yàn)，采用Origin 2022軟件繪圖，圖表中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 生根培養(yǎng)基的篩選

由表3可知，1/2B5與1/2WPM培養(yǎng)基組生根率最高，達(dá)到了60%，且1/2B5培養(yǎng)基組平均生根條數(shù)最多，為3.4條；其次為B5與1/2MS培養(yǎng)基組，其生根率為40%，平均生根條數(shù)依次為3.0條和1.6條；而WPM培養(yǎng)基組生根率為30%，平均生根條數(shù)為1.67條。綜合各培養(yǎng)基生根率和平均生根數(shù)情況，選擇1/2B5培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基生根指標(biāo)Table 3 Rooting index of different media

2.2 不同處理對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄根系發(fā)生的影響

圖1為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)下‘雙優(yōu)’葡萄生根處理20、30、40 d的主根數(shù)和主根長(zhǎng)度情況。如圖1所示，生根處理20 d時(shí)，S6的主根數(shù)目最多，為12.67條，顯著高于其他培養(yǎng)基；而S5培養(yǎng)基主根長(zhǎng)度最長(zhǎng)，其次為S2，顯著高于其他處理組。在生根處理30 d時(shí)，S6的主根數(shù)目顯著高于其他各處理組，為18.5條，S5的主根長(zhǎng)度顯著高于其他組。當(dāng)生根處理40 d時(shí)，S6處理組的主根數(shù)目為20條，顯著高于其他各組，而此時(shí)S6主根長(zhǎng)度顯著高于其他組，其次為S9。在各處理中S1與S2的主根數(shù)和主根長(zhǎng)度變化較為穩(wěn)定。綜上所述， ‘雙優(yōu)’葡萄組培苗主根數(shù)目和主根長(zhǎng)度在各處理中均不同，表明不同的激素配比和碳源處理對(duì)其生根和根系伸長(zhǎng)具有重要的作用。

圖1 不同處理對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄組培苗主根數(shù)和主根長(zhǎng)度的影響Figure 1 Effects of different treatments on the number of taproots and taproot length of tissue culture seedlings of 'Shuangyou' grape

根據(jù)組培苗生根差異情況，分別選擇S1、S2、S5、S6和S8進(jìn)行后續(xù)內(nèi)源生長(zhǎng)素含量測(cè)定及其相關(guān)基因表達(dá)的研究。

2.3 不同處理對(duì)葡萄根系內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的影響

表4表明，隨著生根處理天數(shù)的增加，‘雙優(yōu)’葡萄根系中IAA含量總體呈上升趨勢(shì)，在生根處理20 d時(shí)，S2與S8中IAA含量顯著高于S1、S5和S6；生根處理30和40 d中，S1與S8顯著高于其他處理組，且于生根處理40 d時(shí)達(dá)到最高值，分別為1.00、0.97 μg·g-1；其中，S6在生根處理30 d、40 d時(shí)生長(zhǎng)素含量均低于其他處理。

表4 不同處理下‘雙優(yōu)’葡萄根系內(nèi)源生長(zhǎng)素（IAA）含量變化Table 4 Content changes of endogenous growth hormones in roots of 'Shuangyou' under different treatmentsμg·g-1

2.4 不同處理對(duì)葡萄根系中IAA合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 葡萄根系中IAA合成相關(guān)基因的表達(dá)

如圖2所示，隨著生根處理天數(shù)增加，IAA合成基因在不同處理中表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。其中，VvTAA1基因相對(duì)表達(dá)量?jī)HS1處理與生長(zhǎng)素變化趨勢(shì)一致，且于生根處理40 d時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最高；VvYUCCA2表達(dá)量總體呈上升的趨勢(shì)，與內(nèi)源激素IAA含量變化趨勢(shì)相近。值得注意的是，在生根處理20 d時(shí)，VvYUCCA2只在S2處理中表達(dá)，在生根處理30 d與40 d時(shí)，各處理間表達(dá)量存在顯著差異，S6處理顯著低于其他處理組。相較于VvTAA1與VvYUCCA2，各處理中VvYUCCA6與VvYUCCA8的相對(duì)表達(dá)量更高，且變化趨勢(shì)不一。在生根處理20 d中，S2與S5處理中VvYUCCA6與VvYUCCA8的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組，而在生根30 d 時(shí)，S5與S6處理的表達(dá)量顯著低于其他各組，在生根處理40 d時(shí)，S8中只有VvYUCCA6的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組。

圖2 不同處理下‘雙優(yōu)’葡萄根系中IAA合成途徑相關(guān)基因的差異表達(dá)Figure 2 Differential expression of genes related to IAA synthesis pathway in roots of 'Shuangyou' grape under different treatments

2.4.2 葡萄根系中IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)

如圖3所示，IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量差異較大，表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。VvTIR1基因相對(duì)表達(dá)量除S6處理外，總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中S5處理組在生根處理30和40 d時(shí)表達(dá)量較高；而在生根處理40 d時(shí)，S5處理組相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他各組。各處理中VvABP1表達(dá)量變化與VvTIR1較為相似，生根處理3個(gè)時(shí)期中，S5處理組中VvABP1基因相對(duì)表達(dá)量均較高，在生根處理20 d與340 d時(shí)顯著高于其他處理組。VvABCB1各處理變化趨勢(shì)差異較大，而VvAUX1除S6處理組外，均呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中在生根處理20 d時(shí)，VvABCB1和VvAUX1均在S5中表達(dá)量最高，顯著高于其他處理組；在生根處理40 d時(shí)，VvABCB1在S6中表達(dá)量顯著低于其他各組；而VvAUX1于生根處理30 d時(shí)在S1中達(dá)到最大值，顯著高于其他各處理組，S6中其表達(dá)量顯著低于其他各處理組。

圖3 不同處理下‘雙優(yōu)’葡萄根系中IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的差異表達(dá)Figure 3 Differential expression of genes related to IAA signal transduction in roots of 'Shuangyou' grape under different treatments

2.5 根系中IAA含量與其合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因相關(guān)性分析

如表5所示，在不同處理中，IAA含量與IAA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)量具有一定的相關(guān)性。IAA合成基因VvYUCCA2在各處理中均與IAA含量存在顯著或極顯著相關(guān)性，表明其對(duì)IAA合成具有重要作用。在S1處理中VvTAA1和VvYUCCA2均與IAA含量呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性，表明低濃度生長(zhǎng)素和碳源處理能促進(jìn)其表達(dá)。IAA內(nèi)運(yùn)載體基因VvAUX1在S2和S5處理中均與IAA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而在S8處理中達(dá)到極顯著正相關(guān)，表明不同配比的生長(zhǎng)素和碳源處理對(duì)其表達(dá)起到不同作用。

表5 ‘雙優(yōu)’葡萄根系中IAA含量與其合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between the content of IAA and the relative expression of genes related to IAA synthesis and signal transduction in the roots of 'Shuangyou' grapevine

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)生根誘導(dǎo)過(guò)程中，低鹽培養(yǎng)基有利于組培苗生根，可能原因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的氮源達(dá)到了有利于試管苗生根的水平[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，低鹽培養(yǎng)基1/2MS、1/2B5和1/2WPM相較于全培養(yǎng)基較為適合‘雙優(yōu)’葡萄生根，且生根率較佳，最終篩選出較為適合‘雙優(yōu)’葡萄生根的培養(yǎng)基類型為1/2B5，這與徐美隆等[8]在‘赤霞珠’葡萄組織培養(yǎng)中的研究結(jié)果基本一致，可能是1/2B5培養(yǎng)基的成分更為適合葡萄組培苗根系的生長(zhǎng)發(fā)育。

植物激素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所必需的物質(zhì)，而植物生根與植物激素更是存在密切的聯(lián)系，尤其生長(zhǎng)素（IAA）尤為重要[15]，其在植物主根、側(cè)根及不定根的發(fā)育過(guò)程中起主導(dǎo)和中心作用[16]，而其他植物激素多與生長(zhǎng)素協(xié)同或拮抗來(lái)共同調(diào)控根系的發(fā)育[17]。本研究表明，隨著生根處理天數(shù)增加，IAA含量呈上升趨勢(shì)，與前人研究一致[18]。其中，S1與S8處理下IAA含量相對(duì)較高，而S6中始終較低且變化較穩(wěn)定。同時(shí)，隨著處理天數(shù)的增加，主根數(shù)的變化趨勢(shì)與IAA相同，尤以S6處理的主根數(shù)最多，而主根長(zhǎng)度表現(xiàn)出不同于IAA的趨勢(shì)，在生根處理20 d和30 d時(shí)，S6的主根長(zhǎng)度始終較短，但在生根處理40 d時(shí)表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。推測(cè)可能是S6高濃度外源生長(zhǎng)素處理，抑制了內(nèi)源IAA的合成，從而影響生根，其有利于‘雙優(yōu)’葡萄主根數(shù)量的增加，同時(shí)，過(guò)高濃度的內(nèi)源IAA不利于生根。

生長(zhǎng)素是植物根系發(fā)育過(guò)程中的主要調(diào)控因子，以IPA途徑為主要合成途徑。該途徑主要由色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAA1）和黃素單加氧酶（YUCCA）來(lái)完成[12,19]，YUCCA是生長(zhǎng)素合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，它的表達(dá)決定著生長(zhǎng)素的含量，其過(guò)表達(dá)會(huì)引起植株死亡且不結(jié)實(shí)[20]。本研究表明，在生根處理過(guò)程中，VvYUCCA2的表達(dá)量總體呈上升趨勢(shì)，與IAA的變化相近，這與張蒙[21]等的研究結(jié)果相似，表明VvYUCCA2的表達(dá)對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄生根有利，而VvYUCCA6和VvYUCCA8表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)，可能在調(diào)控IAA合成中具有其他重要作用，值得注意的是VvYUCCA2在生根處理20 d時(shí)只在S2中表達(dá)，推測(cè)可能為不同處理影響其在生根前期的表達(dá)。通過(guò)相關(guān)性分析可知，VvYUCCA2在各處理中均與IAA合成存在顯著或極顯著相關(guān)性，VvYUCCA2的表達(dá)與IAA的合成存在著密切關(guān)系。與此同時(shí)，VvYUCCA6和VvYUCCA8在S5和S6中的表達(dá)與IAA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這可能與生根處理20 d時(shí)VvYUCCA2基因不表達(dá)存在關(guān)系，二者在IAA合成中可能存在其它聯(lián)系。生長(zhǎng)素合成后在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間流動(dòng)，會(huì)引起生長(zhǎng)素濃度的變化，影響生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)各不相同，與前人研究結(jié)果相似。相關(guān)性分析結(jié)果表明，VvABP1和VvAUX1與IAA含量存在一定的相關(guān)性，由此推測(cè)VvABP1與VvAUX1在‘雙優(yōu)’葡萄根系內(nèi)源IAA合成及生根中具有重要的作用。同時(shí)，本研究表明在S6高濃度生長(zhǎng)素處理下，會(huì)抑制IAA合成和信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，生根是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，生長(zhǎng)素及其合成和代謝相關(guān)調(diào)控基因在其中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)基類型進(jìn)行篩選，1/2B5培養(yǎng)基較為適合‘雙優(yōu)’葡萄生根。內(nèi)源生長(zhǎng)素含量測(cè)定表明，IAA作為調(diào)控生根的主效因素，在‘雙優(yōu)’葡萄主根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。而其合成和信號(hào)相關(guān)基因的差異表達(dá)調(diào)控根系中IAA含量變化，進(jìn)而影響生根。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度的外源生長(zhǎng)素處理會(huì)抑制內(nèi)源生長(zhǎng)素的合成和信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低內(nèi)源IAA的含量。