邱奕飛，張瀟雪，肖國生，杜慧慧，楊東林

1.重慶三峽學(xué)院（萬州 404120）；2.重慶文理學(xué)院創(chuàng)新靶向藥物國際研究院（永川 402160）

枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙（Citrus aurantiumL.）及其栽培變種的干燥未成熟果實[1]，含有豐富的活性成分，如生物堿、類黃酮、類檸檬苦素等，具有抗氧化、抗抑郁、抗炎和抗腫瘤等作用[2-3]。枳殼黃酮類成分含量是評價藥材成熟度及質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)[4]，黃烷酮和多甲氧基黃酮是其主要的黃酮類化合物。枳殼和枳實中主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，且不同品種的黃酮種類及含量存在顯著差異[5-6]。據(jù)報道，枳殼提取物能夠有效地清除DPPH自由基（最高可達(dá)59.89%），也可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS強(qiáng)度，起到良好的抗氧化效果[7-8]，還可降低小鼠體內(nèi)的炎癥因子IL-6，IL-1β和TNF-ɑ水平，起到抗炎作用[9-10]。但是目前并未有關(guān)于枳殼黃酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面的研究。

常見的消化道癌癥結(jié)直腸癌是全球高發(fā)癌癥，2020年中國結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)為55.5萬，死亡人數(shù)為28.6萬，分別占全球結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)、死亡人數(shù)的28.8%和30.6%[11]。因此，結(jié)直腸癌嚴(yán)重威脅人類健康，是亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一。天然產(chǎn)物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到廣泛關(guān)注。此研究以枳殼為研究對象，通過高效液相色譜法分析枳殼質(zhì)量，并提取枳殼總黃酮，結(jié)合MTT試驗和細(xì)胞凋亡試驗分析枳殼總黃酮的抗腫瘤活性，以期為結(jié)直腸癌疾病的預(yù)防及治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枳殼（重慶市銅梁區(qū)子奇藥業(yè)有限公司）；HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞（重慶文理學(xué)院創(chuàng)新靶向藥物國際研究院）。

HPLC≥98%的柚皮苷對照品、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、青霉素、鏈霉素混合液（×100）、0.4%臺盼藍(lán)（美國Sigma公司）；HCT116細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.05%胰酶-EDTA消化液（trypsin-ethylene diaminetetraacetie acid，EDTA）：美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板（美國Corning公司）。Eppendorf AG高速冷凍離心機(jī)（德國）；奧林巴斯CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Countess 3細(xì)胞計數(shù)器（賽默飛世爾科技）；Cycation 5多功能酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK）；Accuri C6 流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；GYXH-35臺式實驗室制冰機(jī)（廈門國儀科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 枳殼樣本的采集

重慶枳殼（重慶市銅梁區(qū)子奇藥業(yè)有限公司），選取未成熟青皮枳殼果實且表皮無明顯傷痕，采收后切片去核，在60 ℃烘干12 h后備用。渝枳殼、川枳殼（網(wǎng)購），選取枳殼具體信息見表1。

表1 枳殼樣品采集信息表

1.2.2 超高效液相色譜測定類黃酮含量分析

1.2.2.1 樣品預(yù)處理

樣品以5 000 r/min離心后，吸取2 mL上清液提取液置于10 mL容量瓶中，加甲醇，定容至刻度線，過0.22 μm親水性PTFE膜到2 mL進(jìn)樣小瓶，待測。

1.2.2.2 色譜條件

參照Zhao等[12]使用UPLC-PDA系統(tǒng)（Waters USA）對PMFs和黃烷酮進(jìn)行的測定和分析方法。具體方法：采用UPLC HC18色譜（2.10×100 mm，1.70 μm，UK），以0.01%（V/V）甲酸溶液（A相）和甲醇（B相）為流動相，梯度洗脫（0~0.6 min，10%~20% B；0.6~5 min，20%~70% B；5~7 min，70%~90% B；7~9 min，90%~10% B）；流速0.4 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長283 nm（黃烷酮）。

1.2.3 枳殼黃酮提取物的制備

枳殼黃酮提取物參考劉飛[13]方法，并做出一定改進(jìn)。稱取1 g的枳殼粉末，過0.25 mm篩后加入到35 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇中，溫度70 ℃，300 W，密封超聲20 min。抽濾后取濾液，加入5 g預(yù)處理后的AB-8大孔樹脂37 ℃振蕩24 h（100 r/min），抽濾后取出大孔樹脂，加入70 mL 75%乙醇，37 ℃振蕩12 h（100 r/min）抽取留濾液。取出濾液，在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無酒精，呈懸濁液后停止旋蒸，最后濾液在-80 ℃冰箱冷凍6 h后使用真空冷凍干燥機(jī)凍干，置于-80 ℃冰箱待用。

1.2.4 結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存于液氮罐中的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇，即在37 ℃水浴鍋中迅速完全融化，于800 r/min離心5 min，棄去上清液，將HCT116接種于含10%胎牛血清的McCoy’s 5 a培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2、飽和濕度），定期換液，待細(xì)胞生長融合達(dá)80%~90%時，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.2.5 MTT法檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性

取200 μL（1×103個/孔）對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的枳殼黃酮提取物和DMSO（陰性對照），使孔內(nèi)終濃度為0，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200和400 μg/mL，并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出各組細(xì)胞，棄上清液后每孔加入200 μL DMSO，搖床10 min，酶標(biāo)儀設(shè)定波長為570 nm，記錄吸光度并計算枳殼總黃酮對細(xì)胞增殖的抑制率，每組設(shè)6個復(fù)孔[14]。細(xì)胞增殖抑制率按式（1）進(jìn)行計算。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，按3.8×106個細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，使用DMSO配制高濃度黃酮藥物，過0.22 μm濾膜備用。接種細(xì)胞12 h后按照1∶200（高濃度黃酮藥液∶培養(yǎng)基），使黃酮藥物終濃度為0，100，200和400 μg/mL。在5% CO2、37 ℃、飽和濕度下孵育24 h 后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液離心（800 r/min，5 min）收集細(xì)胞于5 mL流式管內(nèi)，然后用4 ℃的PBS洗兩次，再使用100 μL 1×Annexinbinding buffer重懸細(xì)胞，接著加入5 μL FITC-Annexin V和2 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，最后加入400 μL 1×Annexin binding buffer，檢測前放置于冰上。使用流式細(xì)胞儀檢測，每組計數(shù)至少1×105個細(xì)胞，對照組和試驗組均設(shè)置3個復(fù)孔，結(jié)果使用FLOWJO-V10軟件分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用軟件SPSS 20.0，GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，作圖和分析，每組試驗結(jié)果重復(fù)三次。數(shù)據(jù)以x±s表示。采用單因素ANOVA檢驗分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源枳殼黃酮含量分析

由表2可知，所測樣本中渝枳二號柚皮苷含量大于7.5%，新橙皮苷含量大于5%，且總黃酮含量大于15%，有效活性黃酮類物質(zhì)含量都高于其他樣本。

表2 枳殼樣品黃酮含量 單位：%

根據(jù)文獻(xiàn)報道，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷等黃酮類成分均具有較強(qiáng)的藥理作用，均為枳殼的有效活性物質(zhì)[14-16]。柚皮苷含量范圍在0.23%~10.78%，新橙皮苷含量在0.17%~7.17%，橙皮苷含量在0.12%~3.45%，蕓香柚皮苷含量在0.1%~3.62%。因此，可用這4個指標(biāo)含量來評價枳殼的質(zhì)量。根據(jù)公司檢測標(biāo)準(zhǔn)和2020年《中國藥典》篩選出一級枳殼進(jìn)行活性物質(zhì)提取。

2.2 枳殼黃酮提取物中總黃酮含量

此研究采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，繼而用大孔樹脂純化并冷凍干燥得到枳殼黃酮提取物，其黃酮得率為11.82%，略高于用CA(OH)2法提取枳殼總黃酮的得率8.06%[17]，說明提取方法是可行的。

2.3 枳殼總黃酮對結(jié)直腸癌細(xì)胞活性的影響

由圖1（A）可知，枳殼黃酮提取物能夠抑制HCT116的增殖，呈濃度依賴關(guān)系。從表3可以看出：枳殼黃酮提取物質(zhì)量濃度為1.56 μg/mL時，可顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；枳殼黃酮質(zhì)量濃度大于6.25 μg/mL時，對HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用顯著性增強(qiáng)（P＜0.01），質(zhì)量濃度為6.25~400 μg/mL時極顯著地降低了HCT116細(xì)胞的增殖能力（P＜0.001），其中最高濃度抑制率為60.83%。此外，通過MTT實驗測得枳殼黃酮抑制HCT116細(xì)胞的IC50值為317.2 μg/mL（圖1B）。

圖1 黃酮提取物對HCT116細(xì)胞活性的影響

表3 枳殼黃酮提取物對HCT116細(xì)胞的影響

2.4 枳殼總黃酮對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

將枳殼黃酮提取物處理的HCT116細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，分析枳殼黃酮對HCT116細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。通過流式分析發(fā)現(xiàn)，隨著藥物質(zhì)量濃度上升，細(xì)胞凋亡率逐漸升高（圖2）。對照組細(xì)胞在12 h后的早期凋亡率為1.4%，晚期凋亡率為11.2%。在處理組中，晚期凋亡率隨黃酮提取物濃度的增加而有輕微增加，當(dāng)400 μg/mL質(zhì)量濃度處理12 h后晚期凋亡率達(dá)到13.7%，高于對照組，這與徐一鳴等[18]報道的類似。因此，枳殼黃酮提取物能夠輕微誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，這可能是提取物發(fā)揮抗癌作用的原因之一。

圖2 黃酮提取物對HCT116細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

不同枳殼樣品的有效成分存在較大的差異，同一產(chǎn)地不同采樣時間和種植特性也會影響質(zhì)量，民間多使用江西樟樹、新干和重慶江津、綦江等較優(yōu)品質(zhì)的枳殼[19]。隨著枳殼的引種栽培，如何保證枳殼的質(zhì)量是關(guān)鍵問題。因此，需要建立高效快速的檢測技術(shù)分析不同產(chǎn)地枳殼的活性成分的含量。根據(jù)2020年《中國藥典》所規(guī)定，枳殼原藥材、枳殼飲片與麩炒枳殼中柚皮苷含量不小于4%，新橙皮苷含量不小于3%。從所測不同批次、不同規(guī)格的枳殼樣本來看，Y092與川枳殼兩批枳殼柚皮苷含量不合格，Y540與Y660則柚皮苷、新橙皮苷含量均不合格。同時發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)購的不同產(chǎn)地的枳殼樣本中活性物質(zhì)含量均較為低下?？梢婅讱さ馁|(zhì)量與產(chǎn)地、種植方式、果實成熟度、運(yùn)輸保存方式等有著密不可分的關(guān)系。如隨著枳殼果實成熟程度的增加果肉含量增加，果皮含量減少，其中柚皮苷和新橙皮苷的含量下降[20]。因此不同批次檢測出柚皮苷與新橙皮苷的含量低可能與枳殼采收時期與品種有關(guān)。

枳殼中的化學(xué)組分較多，含有黃酮類、香豆素類，揮發(fā)油類等成分，具有抗菌、降血脂、抗腫瘤和抗抑郁等作用[21-23]，其中枳殼中的黃酮類化合物利膽、抗癌、抗病毒，且對多種腫瘤具有較好的抗腫瘤活性[24]。枳殼中的多甲氧基黃酮類物質(zhì)能降低胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、纖維瘤等腫瘤細(xì)胞活性，可作為抗癌物質(zhì)開發(fā)[25-27]。據(jù)報道，川陳皮素以劑量和時間依賴性來降低口腔鱗狀癌細(xì)胞活力，并能顯著抑制肺腫瘤活性，減少腫瘤體積[28-29]。另外，枳殼中的檸檬素可改善直腸癌小鼠的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等[30]。此研究在枳殼總黃酮提取物在400 μg/mL處理48 h可最大限度地降低HCT116細(xì)胞生存率，可能與該濃度提取物處理48 h的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡升高有關(guān)，但細(xì)胞凋亡率上升幅度并不明顯可能是處理時間過短的原因，后續(xù)可以進(jìn)一步延長處理時間。

雖然枳殼的藥理作用較多，但是相應(yīng)的作用機(jī)制研究不深入，需要結(jié)合組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)深入探討。除此之外，枳殼在保健食品的開發(fā)上較少，將活性成分應(yīng)用于保健食品、藥品也是亟待解決的問題，如枳殼多糖的免疫作用。

4 結(jié)論

通過高效液相色譜檢測分析發(fā)現(xiàn)，不同枳殼樣品的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量存在較大的差異，其中柚皮苷含量在0.23%~10.78%，新橙皮苷含量在0.17%~7.17%。22個樣品中符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的有18個樣品，合格率為81.8%。通過超聲波輔助提取優(yōu)質(zhì)品種的枳殼黃酮，發(fā)現(xiàn)其對HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞具有顯著抑制效果（P＜0.05）且呈量效關(guān)系，48 h內(nèi)黃酮提取物（400 μg/mL）對結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的抑制率為60.83%，IC50值為317.2 μg/mL，細(xì)胞晚期凋亡率為13.7%。枳殼黃酮提取物能夠抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖活性，為枳殼黃酮抗腫瘤活性的研究提供理論依據(jù)。