肖君瑤 鐘耕瑞 王漢琴 王正艷 涂明利

結(jié)核性胸膜炎及肺癌為我國常見病,多并發(fā)胸腔積液,早期診斷較困難。原癌基因蛋白質(zhì)c-Pim-1(Pim-1)是一種原癌基因, 已證實(shí)與多種腫瘤表達(dá)相關(guān)[1]。近年有研究顯示Pim-1與多種炎性疾病相關(guān)[2-4]。 Pim-1激酶對結(jié)核免疫中的淋巴及巨噬細(xì)胞等均有調(diào)控作用[5-6]。抑制Pim-1表達(dá)可抑制NF-κB p65的表達(dá)并阻斷炎癥啟動[3,7]。前期研究顯示結(jié)核性胸水中Pim-1的表達(dá)高于癌性,胸水Pim-1有利于良惡性胸水的鑒別[8]。但二者胸水Pim-1的差異性表達(dá)尚不能確定來源,且缺乏組織學(xué)證據(jù)及相關(guān)蛋白水平定量研究。本文通過免疫組化及Western-Blot方法分析了21例結(jié)核性胸膜炎,20例肺癌胸膜組織中Pim-1蛋白的分布及表達(dá)水平,并探討了與Pim-1表達(dá)相關(guān)的臨床因素,為驗(yàn)證Pim-1的鑒別價(jià)值,尋找結(jié)核性胸膜炎及肺癌的病因?qū)W診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2021年1月-2021年11月內(nèi)科胸腔鏡手術(shù)切除的確診結(jié)核性胸膜炎及肺癌的胸膜活檢標(biāo)本共41例,其中男性28例,占68.3%(28/41),女性13例,占31.7%(13/41),年齡19～85歲,平均年齡(56.5±2.4)歲,兩組一般臨床資料無明顯差別(P>0.05)。所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)并有完整的病理學(xué)資料,術(shù)前均未接受任何抗結(jié)核治療及放化療。其中結(jié)核性胸膜炎組21例(51.2%);肺癌組20例(48.8%),包括腺癌16例(39.0%),鱗癌3例(7.3%)和小細(xì)胞肺癌1例(2.5%)。根據(jù)UICC2009版的肺癌TNM分期進(jìn)行病例分期均為Ⅳ期,其中根據(jù)影像學(xué)檢查提示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例(70.0%),無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例(30.0%),腫瘤直徑≤3cm有13例(65.0%),腫瘤直徑>3cm有7例(35.0%)。胸腔鏡下胸膜活檢組織標(biāo)本分為2份,一份在-80℃冰箱凍存用于Western-Blot檢驗(yàn);一份用4%多聚甲醛通用型組織固定液,并常規(guī)石蠟包埋,切片厚4 μm,用于免疫組化染色。本研究獲得院倫理會批準(zhǔn)(醫(yī)科倫審 2021第01號)。

二、方法

1 主要試劑

兔抗Pim-1單克隆抗體購于美國Novus Biologicals公司;兔IgG免疫組化SABC即用型試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司;GAPDH購于美國Proterintech公司。

2 免疫組織化學(xué)染色

將4 μm石蠟切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟、乙醇脫水,3%過氧化氫孵育10min,PBS熱抗原修復(fù),5%BSA封閉后磕掉,一抗兔抗Pim-1單克隆抗體稀釋度為1:100,各步間均以PBS替代一抗為陰性對照,37℃孵育1h,PBS沖洗,加二抗37℃孵育30min,沖洗后加SABC,37℃孵育30min,DAB顯色劑顯色,顯微鏡下判斷染色程度,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封固。

3 免疫組化結(jié)果判定

隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。先按染色強(qiáng)度打分:0分為無色,1分為淺黃色,2分為黃色,3分為棕黃色或棕褐色,染色強(qiáng)度與背景著色進(jìn)行對比。再按表達(dá)陽性細(xì)胞的百分比打分:0分為陰性,1分為陽性細(xì)胞≤10%,2分為11%～50%,3分為51%～75%,4分為>75%。兩者積分相乘≤1分記為陰性;積分相乘>1分為陽性,其中2～4分為弱陽性,5～8分為中等陽性,強(qiáng)陽性為9～12分,陽性率(%)=[1-(陰性例數(shù)/總例數(shù))]×100%。

4 Western-Blot法檢測Pim-1蛋白表達(dá)水平

取凍存的胸膜組織,液氮凍融,每孔加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取蛋白,檢測蛋白濃度后加入緩沖液定量,取10 μg蛋白。根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,使用5% BSA封閉1 h,一抗4℃孵育過夜(一抗稀釋比均為1:1000),TBST洗滌后二抗室溫孵育2 h,再次洗滌后使用化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶并使用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、Pim-1表達(dá)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

顯微鏡下可見陽性染色為淡黃色,棕黃色,棕褐色,染色程度不等。Pim-1表達(dá)在細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,呈彌漫性分布,以微血管周圍分布較為密集。結(jié)核性胸膜炎胸膜組織陽性染色及陰性對照(見圖1),圖1A由上往下箭頭標(biāo)注處分別為陰性染色、棕褐色、棕黃色及淡黃色;肺癌胸膜組織陽性染色及陰性對照(見圖2),(圖2A)由上往下箭頭標(biāo)注處分別為淡黃色及陰性染色。

圖1 結(jié)核組胸膜組織Pim-1蛋白表達(dá)(免疫組化,×200)注:A:陽性表達(dá) B:陰性對照

圖2 肺癌組胸膜組織Pim-1蛋白表達(dá)(免疫組化,×200)注:A:陽性表達(dá) B:陰性對照

二、Pim-1在結(jié)核性胸膜炎及肺癌組中的表達(dá)情況

在21例結(jié)核性胸膜炎組中,Pim-1強(qiáng)陽性表達(dá)的有7例,中等陽性6例,弱陽性7例,陰性1例,陽性率為95.24%,95%CI(0.762～0.999);在20例肺癌組中,Pim-1中等陽性2例,弱陽性12例,陰性6例,陽性率為70.00%,95%CI(0.457～0.881)。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見表1)。

表1 Pim-1在結(jié)核性胸膜炎(結(jié)核組)和肺癌組織的表達(dá)情況[n(%)]

三、Pim-1表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

肺癌組中,Pim-1的表達(dá)與是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性,而與性別、吸煙史、BMI、腫瘤大小及病理分型無明顯相關(guān)性。結(jié)核組中,Pim-1的表達(dá)與性別、吸煙史及BMI水平無明顯相關(guān)性。詳(見表2和表3)。

表2 肺癌組Pim-1的表達(dá)與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的關(guān)系[n(%)]

表3 結(jié)核組Pim-1的表達(dá)與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的關(guān)系[n(%)]

四、Western-Blot法檢測結(jié)核性胸膜炎及肺癌組Pim-1蛋白表達(dá)水平

Western Blot結(jié)果顯示,相較于肺癌患者,Pim-1蛋白在結(jié)核性胸膜炎患者的肺組織中表達(dá)水平較高,t=4.457,P<0.01 ) ,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(詳見圖3和圖4)。

圖3 Western Blot檢測肺癌組及結(jié)核組Pim-1表達(dá)水平

圖4 肺癌組及結(jié)核組Pim-1表達(dá)水平差異注:**與肺癌組相比,P<0.01

討 論

近年來傳染病的防治在我國尤為重視,且我國肺結(jié)核疫情依舊嚴(yán)峻,為全世界結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一,2018年新發(fā)結(jié)核82.3萬例[9]。結(jié)核性胸膜炎是臨床上常見的結(jié)核類型,發(fā)病數(shù)量有明顯上升趨勢,國內(nèi)報(bào)道住院患者中3.5%為結(jié)核性胸膜炎[10]。肺癌又是我國常見的高發(fā)癌癥,據(jù)統(tǒng)計(jì),癌癥死亡的最常見原因是肺癌,全球每年約179萬人死于肺癌[11],當(dāng)肺癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)絕大部分已經(jīng)有轉(zhuǎn)移[12],所以尋找病因?qū)W診斷指標(biāo)及可能存在的治療靶點(diǎn)對早診早治顯得極為重要。

Pim-1最早作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點(diǎn)被發(fā)現(xiàn),分布廣泛,44Ku Pim-1主要存在于細(xì)胞膜,34Ku Pim-1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有發(fā)現(xiàn)[13],其編碼產(chǎn)物是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等惡性腫瘤疾病中均有高表達(dá)[14-15]。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)Pim-1基因的T-C-T-C單元型可以使肺癌的發(fā)病率增高。有研究顯示肺癌組織中Pim-1的表達(dá)要高于正常組織,且染色強(qiáng)度與腫瘤疾病的發(fā)展有關(guān)[17]。同時(shí)Pim-1通過各種通路在炎性疾病中也發(fā)揮著調(diào)控作用,許多慢性炎癥相關(guān)疾病被證實(shí)有Pim-1的參與,Vries等[18]發(fā)現(xiàn),Pim-1激酶有抗過敏性哮喘的作用,Shen等[3]研究發(fā)現(xiàn)Pim-1激酶參與了黏膜損傷炎癥反應(yīng),可能成為治療炎性腸病的一種新靶點(diǎn)。使用SiRNA及抑制劑阻斷NF-κB信號可以抑制Pim-1蛋白的表達(dá)及抑制蛋白活性[19]。Pim-1可以使p65 Ser276位點(diǎn)磷酸化,敲除Pim-1可以抑制NF-κB降低炎性因子合成,阻斷炎癥啟動的惡性循環(huán)[7]。結(jié)核感染過程中通過各種信號通路來調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答,其中Morris等[20]發(fā)現(xiàn)炎性因子刺激小鼠的巨噬細(xì)胞,NF-κB通路被激活釋放NO和誘導(dǎo)型NO合酶促進(jìn)機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌的清除。但目前對Pim-1與結(jié)核病的相關(guān)研究較少,前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸腔積液中Pim-1的表達(dá)高于癌性胸水,對良惡性胸水有鑒別意義,提示Pim-1可能成為一種新的診斷指標(biāo)[8]。因此對胸水中Pim-1的可能來源,Pim-1在結(jié)核性胸膜炎及肺癌胸膜組織中表達(dá)情況及蛋白水平差異的進(jìn)一步探索研究顯得頗為重要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Pim-1在結(jié)核性胸膜炎胸膜組織的蛋白表達(dá)要高于肺癌胸膜組織,結(jié)核性胸膜炎組中Pim-1陽性率為95.24%,肺癌組中Pim-1陽性率為70.00%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且Western-Blot法檢測結(jié)核性胸膜炎組Pim-1蛋白表達(dá)水平也高于肺癌組,因此猜想結(jié)核性胸膜炎胸腔積液中Pim-1的高表達(dá),可能與結(jié)核性胸膜炎中結(jié)核感染過程中的多種炎性因子刺激胸膜組織上Pim-1高表達(dá)相關(guān)。在胸膜組織高表達(dá)Pim-1的基礎(chǔ)上,胸膜炎癥及毛細(xì)血管濾過性增加從而導(dǎo)致胸腔積液中Pim-1的表達(dá)增高,但這些有待于進(jìn)一步完善研究證實(shí)。Pim-1有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要作用,同時(shí)也參與炎性疾病的免疫過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)核性胸膜炎患者胸水和胸膜組織中Pim-1檢測的價(jià)值,并探索了結(jié)核性胸水中高表達(dá)的Pim-1可能來源,Pim-1很有可能成為結(jié)核性胸膜炎與肺癌的一種新的病因?qū)W診斷指標(biāo),甚至是未來治療的靶點(diǎn),且兩者相較胸水Pim-1檢測更方便快捷,對患者創(chuàng)傷更小,臨床應(yīng)用更有優(yōu)勢。而兩組間Pim-1的表達(dá)與臨床因素的探討,后續(xù)可納入更多、更全面的指標(biāo)進(jìn)行補(bǔ)充。Pim-1與炎性疾病相關(guān)探討日漸豐富,Pim-1與結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病機(jī)制的關(guān)系也值得我們進(jìn)一步探索。