武報(bào)佳,郭 華,邢慧敏,趙 睿,孫 波,馬 冬

心肌梗死是高發(fā)的心血管疾病,隨著人科生活壓力增加及生活習(xí)慣改變,心肌梗死發(fā)病率逐漸升高,且呈年輕化趨勢(shì),且致死率較高,嚴(yán)重威脅人們的生命安全[1]。有研究顯示,隨著心肌梗死疾病惡化并發(fā)展為急性腎損傷的發(fā)病率升高,美國(guó)研究中心對(duì)4萬(wàn)多例急性心肌梗死病人進(jìn)行隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn),超過(guò)5.2%病人發(fā)生不同程度的急性腎損傷[2]。有研究證實(shí),心肌梗死病人腎功能指標(biāo)血肌酐(Cr)含量變化證實(shí)病人腎小球過(guò)濾功能存在異常[3]。核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種具有生物調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì),可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生物活性及免疫應(yīng)答等,其在心肌梗死生理病理中發(fā)揮著重要作用[4]。NF-κB受Rel家族及IκB家族影響,受到細(xì)胞外刺激后與IκB激酶α/β(IκKα/β)形成復(fù)合物,游離的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮靶基因調(diào)控作用。

葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)富含多種化學(xué)成分,是從葡萄籽種中提取的具有抗氧化作用的天然物質(zhì),具有無(wú)毒性、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。葡萄籽多酚可發(fā)揮抗氧化及清除自由基等作用,改善心血管疾病。朱建鴻等[6]研究表明,葡萄籽多酚對(duì)心血管合并動(dòng)脈硬化、糖尿病及高血糖具有保護(hù)作用。關(guān)于心肌梗死腎功能的研究處于探討階段,本研究觀(guān)察葡萄籽多酚對(duì)心肌梗死大鼠NF-κB信號(hào)通路及腎功能的影響,為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD雄雌各半大鼠50只,鼠齡6周,體質(zhì)量200～300 g,許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境：濕度為55%,溫度為25 ℃,模擬明暗交替無(wú)菌飲食2周,定時(shí)清洗、消毒鼠籠,實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定管理規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 葡萄籽多酚(陜西錦泰生物工程有限公司,JT-10236);戊巴比妥鈉(上海行知化工廠(chǎng),921019);阿托品(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司,20150528);青霉素鈉(江西大贛農(nóng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司,140591248);NF-κB抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司,PL0403111);NF-κBp65抗體(上海恒斐生物科技有限公司,ab140751);IκKβ(上海雅吉生物科技有限公司,YS-13644R)。蘇木素染液(北京伊塔有限公司,YT8370);3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(上海雅吉有限公司,I026);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒(美國(guó)ABI公司,7000);cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根有限公司,KR104);IP裂解液(北京百奧萊博有限公司,SY0318);二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(南京諾唯贊有限公司,E112-01)。

1.3 心肌梗死大鼠模型構(gòu)建 參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]建立心肌梗死大鼠模型,50只大鼠稱(chēng)量體質(zhì)量,清除氣管分泌物,腹腔注射60 mg/kg的阿托品、5 mg/kg的地西泮及30 mg/kg的氯胺酮麻醉,仰臥位后固定于操作臺(tái)上,暴露胸部并連接小動(dòng)物呼吸機(jī),剔除左側(cè)胸腔毛發(fā)消毒后在第4肋間與第5肋間切開(kāi)皮膚,置入開(kāi)胸器暴露心臟,剪開(kāi)心包,于肺動(dòng)脈及左側(cè)心耳距離主動(dòng)脈根部0.2 cm分別用4-0線(xiàn)及8-0手術(shù)針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,建立心肌梗死模型,撤離開(kāi)胸器,青霉素沖洗胸腔后用2-0線(xiàn)縫合皮膚,大鼠清醒后撤除呼吸機(jī)。假手術(shù)組除不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支外其余同上。造模24 h后,測(cè)定A組(假手術(shù)組)和B組(心肌梗死模型組)的心電圖驗(yàn)證建模是否成功,心電圖ST段抬高,提示模型構(gòu)建成功。詳見(jiàn)圖1。

圖1 A組及B組大鼠心電圖表現(xiàn)

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 將50只大鼠按照平均體質(zhì)量分為A組(假手術(shù)組)、B組(心肌梗死模型組)、C組(心肌梗死模型+低劑量葡萄籽多酚組)、D組(心肌梗死模型+高劑量葡萄籽多酚組)及E組(心肌梗死模型+血府逐瘀膠囊組),每組10只。C組和D組大鼠建模后灌胃由蒸餾水稀釋的100 mg/kg及300 mg/kg葡萄籽多酚,E組大鼠灌胃250 mg/kg的血府逐瘀膠囊。連續(xù)14 d,每日1次。A組及B組大鼠灌胃等體積生理鹽水,時(shí)間、次數(shù)同其他組。

1.5 超聲測(cè)定心臟功能 末次灌胃后采用40 mg/kg的戊巴比妥麻醉,采用多普勒超聲在二維影像指導(dǎo)下測(cè)定大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓力(LVEDP),連續(xù)測(cè)定3次,取平均值。

1.6 腎功能檢測(cè) 末次灌胃后,采集大鼠眼眶靜脈血1.5 mL,采用低速離心機(jī)以3 000 r/min、離心半徑為10 cm運(yùn)轉(zhuǎn)10 min,保留上清液,采用反比色法檢測(cè)血清Cr、尿素氮(BUN)水平。采血前24 h將大鼠分籠飼養(yǎng),收集尿液,采用黃基水楊酸-硫酸鈉比濁法檢測(cè)24 h尿蛋白(UP24),方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 組織病理學(xué)檢查 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用頸部脫臼法處死大鼠,取大鼠心臟、1個(gè)腎臟,剔除周?chē)M織置入甲醛溶液中固定,組織切片后石蠟包埋,5 μm切邊,脫蠟10 min后利用95%乙醇水化,采用堿性蘇木精進(jìn)行染色15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次,蒸餾水清洗,再利用0.5 mL伊紅染色3 min,PBS清洗,在200倍顯微鏡下觀(guān)察心肌及腎臟組織病理改變。

1.8 免疫印跡檢測(cè)腎臟組織NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體蛋白水平 腎臟組織加入0.125%胰蛋白裂解液,4 000 r/min離心后,在血清樣品中加入樣孔。進(jìn)行電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min,反復(fù)PBS沖洗,每次5 min,分別加入NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶500)、過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000),雜交處理4 h后,沖洗,將膜浸入電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液,檢測(cè)獲取圖像。

1.9 qRT-PCR檢測(cè)腎臟組織NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體 mRNA 腎臟組織經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化,沖洗后置于無(wú)菌試管中,提取其RNA,75%乙醇離心,-80 ℃保存。將RNA轉(zhuǎn)化DNA,加入NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體及NF-κB抗體,內(nèi)參采用GAPDH,60 ℃預(yù)變性、10 min,95 ℃變性、72 ℃退火,各30 s、95 ℃延伸,5 min,循環(huán)次數(shù)以40次為準(zhǔn),采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 各組大鼠LVEDP、MAP及LVSP比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較,B組大鼠LVEDP升高,MAP及LVSP降低(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠心臟功能改善明顯(P<0.05);D組與C組大鼠心功能指標(biāo)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s) 單位：mmHg

2.2 各組大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平比較 與A組比較,B組血Cr、BUN和尿UP24升高(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平降低(P<0.05);D組大鼠血Cr、BUN和尿UP24低于C組(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平比較(±s)

2.3 各組大鼠HE染色比較 心肌組織病理：A組大鼠心肌纖維整齊,形態(tài)橢圓形,細(xì)胞紋理清晰;B組細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)血管水腫出血,心肌組織纖維擴(kuò)張,肌絲溶解;C組、D組及E組細(xì)胞質(zhì)水腫減少,間隙改善,結(jié)構(gòu)接近正常。腎臟組織病理：A組腎臟組織結(jié)構(gòu)完整,由腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)良好,B組腎小球間質(zhì)增多,腎間質(zhì)增寬,炎癥浸潤(rùn)嚴(yán)重,腎小管?chē)?yán)重萎縮,C組、D組及E組腎臟組織病理顯著改善,腎小球硬度降低,炎癥浸潤(rùn)改善。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織及腎臟組織病理改變(HE,×200)

2.4 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達(dá)比較 B組大鼠腎臟組織NF-κBp65、NF-κB及IκKβ蛋白表達(dá)水平高于A組(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);D組大鼠NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達(dá)水平低于C組(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達(dá)比較(±s)

圖3 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達(dá)條帶圖

2.5 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達(dá)比較 與A組比較,B組NF-κBp65、NF-κB及IκKβ mRNA表達(dá)升高(P<0.05);C組、D組及E組NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達(dá)低于B組(P<0.05);與C組比較,D組大鼠NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

心肌梗死是常見(jiàn)的心內(nèi)科疾病,心肌梗死導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞壞死降低心臟功能,影響病人生命安全。目前多種動(dòng)物均可建立心肌梗死模型,SD大鼠具有價(jià)格便宜及適用于個(gè)體研究的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。心肌梗死常伴有高脂血癥,高脂血癥可損傷腎臟,加重腎小管損傷,影響腎功能。有研究表明,心肌梗死產(chǎn)生大量氧自由基,增加腎臟毒性,誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞凋亡,增加腎臟綜合征發(fā)生發(fā)展[8]。目前,多采用藥物治療心肌梗死,西醫(yī)長(zhǎng)時(shí)間治療毒副作用較大,因此尋找合適藥物干預(yù)對(duì)改善心肌梗死腎臟損傷具有重要的臨床意義。

超聲檢查是診斷心肌梗死的無(wú)創(chuàng)輔助檢查,可對(duì)心臟功能進(jìn)行準(zhǔn)確檢查并評(píng)估心肌梗死嚴(yán)重程度。心肌梗死普遍存在心排血量減少,舒張末期容積減小,心室充盈壓力增加,進(jìn)一步提高心臟壓力,導(dǎo)致LVSP、MAP及LVSP異常[9]。心肌梗死病人心肌組織存在不同程度的缺血缺氧,心室收縮不同步,限制了心臟每搏輸出量(SV)及心臟指數(shù)(CI)編導(dǎo),從而影響心室收縮功能,導(dǎo)致LVEDP降低[10]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)葡萄籽多酚干預(yù)后心肌梗死大鼠心臟功能改善,高濃度葡萄籽多酚的干預(yù)作用與血府逐瘀膠囊相似。

血府逐瘀膠囊是在血府逐瘀湯基礎(chǔ)上加減而成的中成藥,是治療“胸中血府血瘀”諸癥的常用藥物,主要成分當(dāng)歸、川芎可養(yǎng)血通經(jīng);生地可活血養(yǎng)陰;赤芍、牛膝、紅花活血化瘀;柴胡、桔梗具有疏肝解郁、宣肺理氣作用[11]。血府逐瘀膠囊治療可改善急性心肌梗死急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)術(shù)后心力衰竭病人心功能,其機(jī)制可能與減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮功能有關(guān)[12]。葡萄籽多酚是一種在蔬菜和水果中存在的天然提取物,包括多種化學(xué)元素,其中白藜蘆醇可減少心肌梗死大鼠心臟及腎臟氧化,而多酚在抗腫瘤同時(shí)具有強(qiáng)大的心臟功能保護(hù)作用。吳婷玉等[13]研究顯示,葡萄籽多酚提取物可降低高血壓大鼠血壓,通過(guò)抗氧化發(fā)揮心臟功能保護(hù)作用。

心肌組織中血管緊張素及醛固酮可加重腎組織纖維化,加快腎小球硬化,降低腎功能[14-15]。本研究結(jié)果顯示,葡萄籽多酚可改善大鼠腎功能,并存在濃度依賴(lài)性,高濃度葡萄籽多酚對(duì)心肌梗死大鼠腎功能改善最顯著,與武報(bào)佳[16]研究結(jié)果相似。葡萄籽多酚屬于血管擴(kuò)張劑,發(fā)揮保護(hù)心臟,對(duì)其他器官特異性保護(hù)作用得到證實(shí),對(duì)阿霉素及順鉑導(dǎo)致的急性腎損傷時(shí)采用葡萄籽多酚干預(yù)對(duì)腎損傷有預(yù)防作用,其機(jī)制與葡萄籽多酚增加抗氧化作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,葡萄籽多酚治療后大鼠心肌組織及腎組織病理形態(tài)均有所改善,其機(jī)制與抑制大鼠腎組織NF-κB/IκKβ信號(hào)通路有關(guān)。

NF-κB是多功能核轉(zhuǎn)錄因子,主要由5種不同亞單位組成,其典型的成員為NF-κBp65,靜息狀態(tài)下NF-κB與IκKβ結(jié)合后,與無(wú)活性的三聚體共同存在于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞受到刺激后NF-κB被激活,暴露細(xì)胞核靶點(diǎn),使其順利進(jìn)入細(xì)胞核,從而發(fā)揮調(diào)控靶基因的作用[17]。NF-κB/IκKβ可介導(dǎo)氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等,加重心肌梗死病理生理發(fā)生。IκK是IκB上的蛋白激酶,也是激活NF-κB的經(jīng)典產(chǎn)物,可結(jié)合IκBα相關(guān)Ser36等指標(biāo)磷酸化發(fā)生降解,促使NF-κB分離,啟動(dòng)細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄作用[18]。NF-κB可調(diào)控免疫及炎癥相關(guān)基因,啟動(dòng)腎小管上皮細(xì)胞損傷機(jī)制,通過(guò)上調(diào)p53表達(dá)介導(dǎo)腎組織纖維化。本研究結(jié)果顯示,葡萄籽多酚可抑制心肌梗死大鼠腎組織NF-κB/IκKβ信號(hào)活性,存在濃度依賴(lài)性。葡萄籽多酚通過(guò)阻斷IκKβ信號(hào)表達(dá),減少相關(guān)信號(hào)發(fā)生降解,加快NF-κB失活而減少腎組織氧化及炎癥應(yīng)激損傷。梁冬冬等[19]研究顯示,葡萄籽多酚活性成分兒茶酸通過(guò)減少NF-κB表達(dá),抑制其進(jìn)入細(xì)胞核,降低了p53磷酸化,改善腎小球上皮細(xì)胞存活周期,提高細(xì)胞存活率。李方等[20]研究顯示,葡萄籽多酚中包含的白藜蘆醇可改善高脂血癥大鼠腎臟功能,其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB活性、降低單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,葡萄籽多酚可增加心肌梗死大鼠心臟功能,提高腎功能,改善心肌及腎臟組織病理?yè)p傷,其機(jī)制與抑制NF-κB、NF-κBp65及IκKβ活性有關(guān)。