金太成 閔菲 李一荻 丁曉月 韓晗 石淼 楊麗萍

(吉林師范大學(xué),四平,136000)

DNA甲基化是真核生物基因組中最常見的一種DNA共價修飾形式,對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。近年來研究表明,植物中小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、調(diào)控轉(zhuǎn)座子的活性和防御病毒等外源DNA過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。這類siRNA生物合成需要依賴于DNA的RNA聚合酶Ⅳ(Pol Ⅳ),依賴于RNA的RNA聚合酶2(RDR2)和DCL3蛋白共同完成[3]。合成的24nt siRNA與AGO4蛋白結(jié)合,并招募甲基化轉(zhuǎn)移酶DDM1/2、MET1和CMT3等對靶標(biāo)DNA進(jìn)行從頭甲基化和甲基化的維持[4]。

DNA去甲基化包括主動去甲基化和被動去甲基化[5]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺失導(dǎo)致DNA甲基化降低,是一種被動DNA去甲基化過程[6]。主動DNA去甲基化過程依賴DNA去甲基化酶的催化作用[7]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)有4個雙功能的5-甲基胞嘧啶(5-mC)DNA糖基化酶,包括沉默抑制因子1(ROS1)、DME、DML2和DML3,均屬于DNA去甲基化酶。其中ROS1,DML2和DML3在植物各個組織中均有表達(dá),在主動DNA去甲基化過程中起作用。已有研究表明,ROS1能夠負(fù)調(diào)控RdDM途徑[7-8]。ROS1介導(dǎo)的DNA去甲基化有利于維持基因組DNA甲基化模式[9]。

水楊酸(SA)是植物防御反應(yīng)的一個重要的信號分子,能誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)并獲得系統(tǒng)抗性[10]。SA的上游調(diào)控因子至少有3類,促細(xì)胞死亡因子(ACD6)屬于第2類SA上游調(diào)控因子。ACD6基因的功能獲得突變體(acd6-1)能夠?qū)е禄駻CD6-1、EDS1、PAD4和NPR1表達(dá)的提高,并能誘導(dǎo)SA積累水平的升高[11-17]。植物中SA途徑能夠被DNA病毒和RNA病毒激活[1]。甜菜嚴(yán)重曲頂病毒(Beetseverecurlytopvirus,BSCTV)編碼的C2蛋白通過抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(SAMDC1)的降解,影響植物內(nèi)源基因的DNA甲基化[18]。進(jìn)一步研究揭示C2影響了21/24nt的siRNA的積累,在植物SA途徑上游調(diào)控基因AtACD6啟動子區(qū)域DNA去甲基化過程中起作用,并轉(zhuǎn)錄激活SA途徑防御基因的表達(dá)[19]。

我們之前的研究表明煙草脈帶花葉病毒(tobaccoveinbandingmosaicvirus,TVBMV)編碼的基因沉默抑制子HC-Pro,在擬南芥植物SA途徑上游調(diào)控基因AtACD6啟動子DNA去甲基化過程中起作用,并誘導(dǎo)SA途徑下游防御基因的表達(dá)[20],闡明病毒激活SA途徑基因表達(dá)的分子機(jī)制。為了研究調(diào)控基因AtACD6是否能夠應(yīng)答非生物脅迫,我們對干旱、低溫和鹽脅迫處理的擬南芥Col-0植物中AtACD6表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析。研究結(jié)果證實(shí),非生物脅迫能夠誘導(dǎo)AtACD6基因啟動子DNA去甲基化,而轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控基因AtACD6及下游防御基因AtPR5的表達(dá)。進(jìn)一步研究揭示,ROS1在AtACD6基因啟動子DNA去甲基化過程中起重要作用,闡明植物SA途徑防御基因應(yīng)答非生物脅迫的表觀調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

非生物脅迫處理擬南芥:本試驗(yàn)以擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型Col-0為材料,用84消毒液和無水乙醇消毒后,無菌水清洗2～3次,種子播種于MS培養(yǎng)基。幼苗生長約15 d后,轉(zhuǎn)移到溫度為24 ℃,16 h光照、8 h黑暗循環(huán)的環(huán)境中,繼續(xù)培養(yǎng)15 d。將擬南芥植物移栽到無菌的土壤中,置于溫室中進(jìn)行培養(yǎng),分別選取20株擬南芥生態(tài)型Col-0進(jìn)行低溫脅迫(4 ℃,24 h)、鹽脅迫(150 mmol/L NaCl,72 h)和干旱脅迫(缺水處理7 d),同時選取未處理的植物為對照組。

此外,以擬南芥生態(tài)型Col-0、DNA去甲基化酶ROS1突變體ros1、DNA去甲基化酶三突ros1dml2dml3(rdd)為材料,進(jìn)行低溫脅迫(4 ℃,24 h)處理。

相關(guān)基因表達(dá)的檢測分析:分別取等量的低溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫和對照組的野生型擬南芥Col-0,使用Trizol試劑分離擬南芥的總RNA,然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,再利用cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測,具體方法參照Yang et al.[21]的方法,分別檢測了防御基因AtACD6和AtPR5的表達(dá)水平。

此外,以RdDM途徑DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶突變體met1和cmt3為材料,進(jìn)行RT-qPCR檢測防御基因AtACD6和AtPR5的表達(dá)水平。

亞硫酸鹽測序技術(shù):利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取非生物脅迫處理的擬南芥植物和未處理植物的總DNA,使用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對純化后的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理。處理后的DNA作為模板,進(jìn)行AtACD6基因啟動子重復(fù)序列PCR擴(kuò)增?；厥债a(chǎn)物連接PMD18-T載體后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,利用菌落PCR篩選陽性克隆進(jìn)行測序分析。此外,以擬南芥生態(tài)型Col-0、DNA去甲基化酶ROS1突變體ros1、DNA去甲基化酶三突ros1dml2dml3(rdd)為材料,低溫脅迫(4 ℃,24 h)處理后提取基因組DNA,并進(jìn)行亞硫酸鹽測序。

簡并引物設(shè)計:F(AtACD6),5′-AAGTTTATTGATGAAAGGAG-3′;R(AtACD6),5′-CTTACTT(G/A)TCTT CATCAA-3′。AtACD6啟動子區(qū)域1 000 bp之內(nèi)高甲基化序列(325 bp):TCTCTCTGAGAAGCGGTATCTTGGTAGCTTTAACTGATAGCTCAACTCACT-CAATCCGTAGTCATCGAACACCGACTTCACAAGCT-TGTCGTGCGTTATTTCCGTATCTATTTGCACAACTC-TACACCATTTATCGACGGTGTTAAATACAAATTCTT-TACCCAATCGTATCGAGAGAAGGATGAAAGAAGA-ATGAGGAAGACGGTGATGAATTGGAAATTCCGAT-GATGTGAAAAACTCATGTGAAGAAGACGAGTTGA-AAAAAAAAACGTTTCGTATTTCCTTTGATGATGAT-GACATGGACTGTTGCATCCGACATCATTTTT。

數(shù)據(jù)處理:利用國外網(wǎng)站(www.cymate.ogr.cymate.html)分析基因啟動子區(qū)域DNA序列甲基化水平,利用OriginPro8(http://www.originlab.com)完成測序結(jié)果的數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱處理后的擬南芥生態(tài)型Col-0植物表型變化

分別選取20株擬南芥生態(tài)型Col-0進(jìn)行干旱、低溫和鹽脅迫處理。其中,低溫處理24 h和鹽脅迫處理1～3 d的植物沒有明顯的表型變化。擬南芥小苗進(jìn)行干旱(缺水)處理7 d,連續(xù)觀察植物的表型變化。與對照組擬南芥Col-0(圖1A)相比,干旱處理3 d,植物葉片出現(xiàn)輕微黃化和皺縮現(xiàn)象(圖1B、C);干旱處理5 d,葉片有少量花青素積累,少量葉片呈現(xiàn)黃化現(xiàn)象(圖1D、E);干旱處理7 d時,葉片中花青素積累顯著增加,大量葉片表現(xiàn)黃化枯萎(圖1F)。

2.2 非生物脅迫激活防御基因的表達(dá)

為了揭示非生物脅迫是否能夠影響SA途徑防御基因AtACD6和AtPR5的表達(dá),我們分別提取低溫脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫處理的擬南芥生態(tài)型Col-0和對照處理Col-0的總RNA,并進(jìn)行基因表達(dá)的比較分析。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明,與對照組擬南芥Col-0中相關(guān)基因表達(dá)量相比,在這3種非生物脅迫處理的擬南芥Col-0中,SA途徑防御基因AtACD6和AtPR5表達(dá)量顯著增加(表1)。結(jié)果證實(shí),3種非生物脅迫能夠誘導(dǎo)SA途徑防御基因的表達(dá)。

A為對照組的擬南芥Col-0植物;B、C為干旱處理3 d的擬南芥Col-0;D、E為干旱處理5 d的擬南芥Col-0;F為干旱處理7 d的擬南芥Col-0。

圖1 干旱脅迫處理的擬南芥Col-0植物表型

表1 非生物脅迫激活擬南芥Col-0中防御基因的表達(dá)量

植物對逆境脅迫的適應(yīng)過程中,并不是單一激素發(fā)揮作用,而是多種激素互相作用的結(jié)果。已有大量研究表明,脫落酸(ABA)途徑在植物應(yīng)答干旱、寒冷等逆境脅迫過程中起重要作用[22-23]。近年來,人們越來越關(guān)注植物水楊酸信號途徑在抗病防御過程中的重要作用[10]。2013年,我們通過研究揭示了SA信號途徑防御基因被BSCTV病毒激活的分子機(jī)制,研究結(jié)果表明,BSCTV病毒編碼C2蛋白,在植物SA途徑上游調(diào)控基因AtACD6啟動子區(qū)域DNA去甲基化過程中起作用,并轉(zhuǎn)錄激活SA途徑相關(guān)防御基因的表達(dá)[19]。而我們對SA信號途徑防御基因在植物應(yīng)答非生物脅迫過程中的作用還知之甚少。本研究結(jié)果證實(shí),非生物脅迫包括干旱(缺水處理)、低溫和鹽脅迫,能夠誘導(dǎo)擬南芥生態(tài)型Col-0植物中SA途徑AtACD6啟動子區(qū)域DNA去甲基化,而轉(zhuǎn)錄激活SA途徑上游調(diào)控基因AtACD6的表達(dá)。AtACD6是SA途徑上游調(diào)控基因[15-17],因此,AtACD6表達(dá)的激活能夠進(jìn)一步促進(jìn)下游防御基因AtPR5的表達(dá)。

2.3 非生物脅迫誘導(dǎo)AtACD6基因啟動子DNA去甲基化

非生物脅迫(干旱、低溫、鹽脅迫)處理后,對擬南芥Col-0中AtACD6基因啟動子區(qū)域的3種位點(diǎn)(包括CG位點(diǎn)、CNG位點(diǎn)和CHH位點(diǎn))的甲基化進(jìn)行測序和分析(圖2)。干旱處理后,甲基化水平有不同程度的下降,其中CG位點(diǎn)由78.30%下降至62.03%,CNG位點(diǎn)由21.67%下降至8.11%,CHH位點(diǎn)則由13.51%下降至5.80%;低溫處理后,擬南芥Col-0中AtACD6基因啟動子區(qū)重復(fù)序列總體甲基化水平下降13.46%,3個甲基化位點(diǎn)的DNA甲基化水平有不同程度的下降,其中CG位點(diǎn)由78.30%下降至57.77%,CNG位點(diǎn)由21.67%下降至7.56%,CHH位點(diǎn)則由13.51%下降至5.36%;與對照(Col-0)相比,鹽脅迫處理后擬南芥Col-0中AtACD6基因啟動子區(qū)重復(fù)序列總體甲基化水平下降11.23%,其中CG位點(diǎn)由78.30%下降至67.46%,CNG位點(diǎn)由21.67%下降至8.26%,CHH位點(diǎn)則由13.51%下降至6.85%(表2)。

A為擬南芥生態(tài)型Col-0植物中AtACD6啟動子區(qū)域甲基化水平作為對照;B為低溫處理后Col-0植物中AtACD6啟動子區(qū)域甲基化水平;C為缺水處理后AtACD6啟動子區(qū)域甲基化水平;D為鹽脅迫處理后AtACD6啟動子區(qū)域甲基化水平。

圖2 AtACD6啟動子區(qū)域(320 bp)3種位點(diǎn)DNA甲基化分析結(jié)果

表2 不同處理的擬南芥Col-0中AtACD6啟動子區(qū)域DNA甲基化情況

利用RT-qPCR進(jìn)一步檢測DNA甲基化途徑(RdDM)突變體中相關(guān)基因的表達(dá)水平,檢測結(jié)果證實(shí),RdDM途徑中,關(guān)鍵作用元件突變體ago4、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶突變體met1和cmt3中,AtACD6基因表達(dá)顯著增加。以擬南芥Col-0中相關(guān)基因表達(dá)量作為對照(表3),結(jié)果表明,AtACD6是RdDM途徑的靶基因,而且RdDM途徑中主要功能蛋白AGO4、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶MET1和CMT3在維持?jǐn)M南芥Col-0AtACD6基因低轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用。

植物中siRNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)等過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。本研究表明,RdDM途徑DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶突變體met1和cmt3中,AtACD6基因表達(dá)顯著增加(p<0.05),證實(shí)這些基因是RdDM途徑的靶基因,而且RdDM途徑在維持AtACD6基因的低轉(zhuǎn)錄過程中起作用。植物中DNA去甲基化酶ROS1參與調(diào)控主動DNA去甲基化,并能夠負(fù)調(diào)控RdDM途徑[24]。

表3 RdDM途徑突變體ago4、met1和cmt3中AtACD6的表達(dá)水平

2.4 非生物脅迫條件下ROS1介導(dǎo)AtACD6基因啟動子區(qū)域的DNA去甲基化

已有研究表明,ROS1在RdDM靶向區(qū)域的DNA去甲基化作用在調(diào)控基因表達(dá)過程中具有重要意義[25]。為了調(diào)查研究ROS1是否參與調(diào)控AtACD6基因的表達(dá),我們比較分析了低溫處理的擬南芥Col-0、DNA去甲基化酶缺失突變體ros1和DNA去甲基化酶ROS1、DML2和DML3的三突植物ros1dml2dml3(rdd)中AtACD6基因表達(dá)水平。與對照組的Col-0植物中基因表達(dá)量相比,低溫處理后,AtACD6表達(dá)水平顯著提高(p<0.05),然而,低溫處理的DNA去甲基化酶缺失突變體ros1和rdd植物中,AtACD6表達(dá)量的增加被嚴(yán)重抑制(表4)。這些結(jié)果表明,非生物脅迫條件下,DNA去甲基化酶ROS1、DML2和DML3在調(diào)控AtACD6基因轉(zhuǎn)錄激活過程中起重要作用。

表4 低溫處理的不同植物中AtACD6基因表達(dá)情況

為了進(jìn)一步研究DNA去甲基化酶ROS1是否在AtACD6基因啟動子區(qū)域的DNA去甲基化過程中起作用,我們比較分析了低溫處理的DNA去甲基化酶缺失突變體ros1和未處理的Col-0植物中AtACD6基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平。測序結(jié)果及數(shù)據(jù)(表5)分析證實(shí)了,低溫處理擬南芥Col-0植物中AtACD6基因啟動子DNA甲基化水平顯著降低(p<0.05),包括CG、CNG和CHH位點(diǎn);而低溫處理的突變體ros1植物中,AtACD6基因啟動子DNA甲基化水平的降低被部分抑制,表明ROS1介導(dǎo)了的AtACD6基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化的降低,并參與調(diào)控防御基因AtACD6的表達(dá),進(jìn)而適應(yīng)低溫脅迫。通過比較分析低溫處理的野生型Col-0植物和突變體ros1植物中AtACD6基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)突變體ros1中該基因表達(dá)的增加被顯著抑制,表明ROS1參與調(diào)控非生物脅迫條件下防御基因AtACD6的轉(zhuǎn)錄激活。

表5 低溫處理的不同植物中AtACD6啟動子區(qū)域DNA甲基化情況

生物脅迫和非生物脅迫影響著植物DNA甲基化的變化,DNA甲基化的水平和模式的改變調(diào)控著逆境應(yīng)答基因的表達(dá),進(jìn)而提高植物對脅迫的抗性[26]。已有研究表明,ROS1介導(dǎo)的DNA去甲基化能夠作用于3種甲基化位點(diǎn),包括CG、CNG和CHH位點(diǎn)[27]。我們進(jìn)一步通過測序結(jié)果證實(shí),低溫脅迫條件下,突變體ros1植物中AtACD6基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化的降低(包括CG、CNG和CHH位點(diǎn))被明顯抑制。這些結(jié)果證實(shí),ROS1介導(dǎo)的DNA去甲基化參與調(diào)控低溫脅迫條件下AtACD6基因的轉(zhuǎn)錄激活。非生物脅迫條件下SA途徑防御基因表達(dá)水平的顯著增加,暗示了這些防御基因在增強(qiáng)植物適應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

本研究揭示,非生物脅迫誘導(dǎo)植物SA途徑調(diào)控基因AtACD6及下游防御基因AtPR5表達(dá)的分子機(jī)制,證實(shí)ROS1介導(dǎo)的主動DNA去甲基化在低溫誘導(dǎo)AtACD6基因表達(dá)的過程中起作用,進(jìn)而適應(yīng)低溫脅迫。由于表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性,植物通過表觀遺傳調(diào)控應(yīng)答非生物脅迫的分子機(jī)制尚需要深入研究。

3 結(jié)論

各種非生物脅迫包括干旱(缺水處理7 d)、低溫(4 ℃,24 h)和鹽脅迫(150 mmol/L NaCl,72 h),能夠誘導(dǎo)AtACD6基因啟動子DNA去甲基化,進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物中水楊酸防御途徑上游調(diào)控基因AtACD6表達(dá),調(diào)控基因AtACD6表達(dá)的增加進(jìn)一步上調(diào)了下游防御基因AtPR5的表達(dá)。進(jìn)一步研究揭示,擬南芥植物中ROS1介導(dǎo)的主動DNA去甲基化在低溫誘導(dǎo)AtACD6基因表達(dá)的過程中起重要作用,進(jìn)而適應(yīng)低溫脅迫,闡明了擬南芥中水楊酸防御途徑調(diào)控基因AtACD6和防御基因AtPR5應(yīng)答非生物脅迫的分子機(jī)制。