舒福興, 黃 瑤, 賈 啟, 王馨瑤, 唐 瀅,袁碧霞, 保正娟, 羅清清, 陳集雙

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)生物資源健康利用研究中心, 貴州 遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院臨床學(xué)院, 貴州 遵義 563000)

半夏(Pinelliaternata(Thunb.)Breit)屬于天南星科半夏屬草本植物,具有止咳、降逆止嘔、抗腫瘤等作用[1]。半夏主要分布于南亞地區(qū),在中國主要分布于貴州、甘肅、河北等地[2]。由于半夏原生環(huán)境持續(xù)惡化以及被無節(jié)制挖掘,致使野生半夏資源減少,品種、數(shù)量均急劇下降。盡管多地進行了半夏人工種植,但面積依然不夠大,并且面臨半夏軟腐病引起的絕收。研究表明,多種致病菌可引起半夏軟腐病,其中胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)最常見、致病性強,接種20 h即可引起軟腐病癥狀[3]。因此,篩選半夏軟腐病抗病品種顯得尤為重要。而獲得軟腐病抗病半夏品種首先得找到可以鑒定抗病品種的輔助育種方法。

簡單重復(fù)序列SSR(Simple Sequence Repeat),又稱微衛(wèi)星標記,是一種廣泛分布于真核和原核生物基因組中,由1～6個核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列,其兩側(cè)是相同的基因組序列,但在非基因區(qū)域更頻繁地出現(xiàn)。其具有多態(tài)性高、重復(fù)性高、覆蓋面廣等優(yōu)點,廣泛運用于遺傳多樣性、分子標記輔助育種[4],尤其是在許多作物中,選擇數(shù)量性狀位點QTL作圖的標記方法長期以來一直是SSR[5]。SSR的來源常用的有兩種:基因組SSR、轉(zhuǎn)錄組SSR(EST-SSR)[6-7]。最初的SSR標記引物開發(fā)需要構(gòu)建DNA文庫,該過程步驟繁瑣、失敗率高、耗資大、工作量大[8]。EST-SSR則擯棄繁瑣的DNA建庫過程,通過轉(zhuǎn)錄組開發(fā)標記引物,能夠直接反應(yīng)參與某一進程轉(zhuǎn)錄基因信息。目前,NCBI中收錄的半夏EST序列較少,基于軟腐病菌侵染的半夏轉(zhuǎn)錄組信息更少,難以滿足SSR引物開發(fā)的需要。因此,本研究通過挖掘軟腐病菌胡蘿卜果膠桿菌侵染本團隊特有的T 2+半夏品種,以獲得此條件下的半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點信息,為鑒別半夏軟腐病抗病品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為組培條件下胡蘿卜果膠桿菌侵染的半夏嫩芽。胡蘿卜果膠桿菌為本團隊保存,菌樣甘油保存于-80 ℃;T 2+半夏品種保留于遵義醫(yī)科大學(xué)生物資源健康利用研究中心組培室,培養(yǎng)條件為光照強度2 000 lx,光照時間12 h/d,培養(yǎng)溫度(25±1)℃。

1.2 實驗方法

在恒溫搖床中,利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)胡蘿卜果膠桿菌;培養(yǎng)溫度為28 ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min;在波長為600 nm下測量菌液OD值,到0.6時停止培養(yǎng),取出搖床待用。采用同一批接種、長勢均一的半夏組培苗作為接種對象。實驗設(shè)置0 h和20 h實驗組,并在相應(yīng)時間點設(shè)對照組。試驗組用半夏組培苗與5 mL胡蘿卜果膠桿菌培養(yǎng)液共培養(yǎng),每組重復(fù)3次;對照組采用半夏組培苗與5 mL LB培養(yǎng)基共培養(yǎng),每組重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為光照強度2 000 lx,光照時間12 h/d,培養(yǎng)溫度(25±1)℃。分別采集各組半夏嫩芽立即投入液氮中速凍,利用提前液氮冷凍的凍存管裝好,埋在干冰中送往山東開源基因公司進行cDNA文庫構(gòu)建及l(fā)lumina HiSeq X Ten平臺測序獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)生物信息學(xué)SSR位點分析軟件對轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)(Unigenes)進行檢索和分析。參數(shù)設(shè)置參考蔣維昕等[9]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的數(shù)量

通過對半夏轉(zhuǎn)錄組中75 517條Unigene(總長度90 921 938 bp)進行SSR分析獲得40 621個SSR,出現(xiàn)頻率為36.09%,分布于27 252條Unigene,這些Unigene的數(shù)量為總Unigenes數(shù)量的36.09%。其中,含有2個及以上SSR位點的Unigene有8 916條。含有復(fù)合型SSR位點的Unigene有4 969條。半夏轉(zhuǎn)錄組中,平均每2.24 kb序列就會出現(xiàn)1個SSR位點,詳見表1。

表1 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR基本信息Table 1 Basic information of SSR in the transcriptome of Pinellia ternata

2.2 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的重復(fù)基元類型及占比

半夏轉(zhuǎn)錄組具有單核苷酸至六核苷酸等多種SSR重復(fù)基元種類。不同SSR重復(fù)基元類型在數(shù)量上差異懸殊,基元類型較多的是單、二、三核苷酸重復(fù)。其中,二核苷酸重復(fù)類型有16 936個,數(shù)量最多,占總SSR數(shù)量的41.69%;單核苷酸重復(fù)類型有13 293個,排第二位,占總SSR數(shù)量的32.72%;三核苷酸重復(fù)類型有9 829個,排第三位,占總SSR數(shù)量的24.20%;其余基元重復(fù)類型所占比例較低,三者占總SSR數(shù)量之和的1.39%。總體上,含SSR位點的序列數(shù)量隨著核苷酸基元堿基數(shù)的增加逐漸變少。二核苷酸重復(fù)類型SSR的平均分布距離最小,為5.37 kb,五核苷酸重復(fù)類型SSR的平均分布距離最大,為1 466.48 kb,是二核苷酸重復(fù)類型平均分布距離的273.09倍,詳見表2。

表2 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量及重復(fù)基元類型Table 2 Type and repeat motifs of SSR loci in the transcriptome of Pinellia ternata

2.3 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元的堿基組成

分析發(fā)現(xiàn),有40 621個SSR位點存在于半夏轉(zhuǎn)錄組中。這些SSR中一共發(fā)現(xiàn)106種重復(fù)基元類型。其中,單核苷酸至六核苷酸重復(fù)基元分別有2、4、10、25、28、37種。在所有SSR基元重復(fù)類型中,以AG/CT為堿基的基元重復(fù)類型為優(yōu)勢類群,占總SSR的30.93%;其次為單核苷酸重復(fù)基元,該重復(fù)類型中A/T基元占總SSR的29.72%。三核苷酸基元類型中,優(yōu)勢重復(fù)基元及占總SSR的比例分別為:CCG/CGG占比6.65%、AAG/CCT占比4.60%、AGG/CCT占比4.01%、AAG/CTT占比4.60%、其余四、五、六及其他核苷酸重復(fù)基元種類也比較豐富,但全部加起來僅占19.49%(詳見圖1)。

圖1 半夏轉(zhuǎn)錄組中不同重復(fù)基元SSR的占比情況Fig.1 Percentage of SSRs with different repeats motifs in the transcriptome of Pinellia ternata

2.4 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR的多態(tài)性分析

2.4.1半夏轉(zhuǎn)錄組序列中SSR基元重復(fù)次數(shù)的分布

分析半夏轉(zhuǎn)錄組SSR位點的重復(fù)次數(shù)發(fā)現(xiàn),基元重復(fù)次數(shù)的增加使不同類型核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量和比例逐漸下降(圖2和表3)。有37 008個SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)集中在5～20次,占總SSR數(shù)量的91.11%(表3)。其中,有25 478個低重復(fù)率(5～10次)SSR位點,數(shù)量為總SSR數(shù)量的62.72%;中重復(fù)次數(shù)中,11～15次的SSR位點數(shù)為9 350個,占總SSR數(shù)量的23.02%,16～20次的SSR位點數(shù)為2 180個,占總SSR數(shù)量的5.37%。在SSR所有重復(fù)類型中,占比排列前三的依次為10次、6次、5次重復(fù)類型,分別有6 550、5 949、5 522個,各占SSR總數(shù)的16.14%、14.65%、13.59%。

注:不同顏色代表不同重復(fù)單元次數(shù),帶有顏色的方框面積越大對應(yīng)的SSR數(shù)量越多。圖2 半夏轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型統(tǒng)計Fig.2 Statistics of the SSR repeat types of the transcriptome of Pinellia ternata

2.4.2半夏轉(zhuǎn)錄組高多態(tài)性SSR分析

研究認為,具有較高多態(tài)性的SSR序列的長度往往大于等于20 bp,具有這一特點的SSR可以成為首選標記位點;多態(tài)性適中的序列長度在12～20 bp之間;而SSR序列長度一旦小于12 bp,則多態(tài)性表現(xiàn)極低[10]。因此,本研究以此為依據(jù)分析高多態(tài)性的SSR數(shù)量及占比(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有12 521個SSR序列長度集中于12～20 bp,占SSR總數(shù)的30.82%;有4 006個SSR序列長度處于20～30 bp,占SSR總數(shù)的9.86%。 有3 754個SSR序列長度超過30 bp,占10.53%;共計有20.39%的SSR序列長度符合高多態(tài)性SSR的特征。此外,半夏轉(zhuǎn)錄組SSR序列的平均長度為2.24 kb,其中G/C單核苷酸類型具有最長重復(fù)片段為66 bp,其出現(xiàn)3次。

表3 半夏轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)次數(shù)的SSR數(shù)量分布Table 3 SSR quantity distribution with different repetitions in transcriptome of Pinellia ternata

圖3 半夏轉(zhuǎn)錄組不同長度SSR重復(fù)框的占比Fig.3 Proportion of SSR repeat fragments of different lengths in the transcriptome of Pinellia ternata

3 討 論

不同品種半夏呈現(xiàn)出的軟腐病抗病性有極大差異,有的表現(xiàn)為延遲發(fā)病,有的表現(xiàn)為易感病狀態(tài),還有的表現(xiàn)為抗病狀態(tài)。目前,唐曉晶[11]用ISSR-PCR方法鑒定半夏近緣混淆品種及多來源品種;張君毅[12]、楊旻[13]利用ISSR分子標記技術(shù)分析半夏遺傳多樣性;上述尋找SSR的方法比較傳統(tǒng),過程繁瑣信息不夠全面。之后,馬芃銳等[14]采用磁珠富集法獲得芍藥葉型半夏基因組序列841條,分析出SSR 406條,篩選出可以鑒定4種葉型半夏品種的引物7對。然而,在SSR挖掘數(shù)量以及可用性方面,磁珠法遠不如轉(zhuǎn)錄組法。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟,多種植物已經(jīng)成功將其用于SSR開發(fā)[15-17]。因此,基于轉(zhuǎn)錄組信息分析半夏SSR分子標記具有可行性。

在以往的研究中,已有基于正常半夏轉(zhuǎn)錄組獲得SSR分子標記的研究,例如王森等[15]在正常轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)14 468個SSR,分布于12 000條Unigene 中;劉丹等[16]在正常轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)半夏中含有SSR位點的Unigene有14 640條,有19 270個SSR位點;這為半夏品種的鑒定打下基礎(chǔ)。然而,這些基于非軟腐病菌脅迫下的半夏轉(zhuǎn)錄組分析而來的SSR用于半夏軟腐病抗病品種篩選具有很大缺點,例如: 1) 非軟腐病抗病相關(guān)的SSR在篩選軟腐病抗病品種過程中加大了分析工作量,甚至導(dǎo)致軟腐病抗病品種篩選的失敗; 2) 半夏未被軟腐病菌侵染時,某些抗病基因可能未發(fā)生轉(zhuǎn)錄,那么使用這種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行SSR分析,可能會造成部分抗病相關(guān)的SSR遺失。為克服這些缺點,本研究利用軟腐病致病菌(胡蘿卜果膠桿菌)侵染半夏T 2+,并獲得半夏T 2+的轉(zhuǎn)錄組信息,在此基礎(chǔ)上進一步分析SSR信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在27 252條Unigene中找到40 621個SSR位點,同時比較T 2+正常轉(zhuǎn)錄組中Unigene的數(shù)量(107 777個)發(fā)現(xiàn)[2],T 2+半夏在胡蘿卜果膠桿菌侵染下,轉(zhuǎn)錄組中的Unigene數(shù)量顯著降至75 517個,因此,利用本轉(zhuǎn)錄組篩選SSR用于抗軟腐病半夏品種育種將更具針對性及必要性;盡管本次T 2+半夏轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)量顯著下降,但其SSR數(shù)量遠高于王森等[15]和劉丹等[16]報道的SSR數(shù)量,這說明半夏品系之間轉(zhuǎn)錄組水平有極大的差異性,對其他半夏品種的EST-SSR研究也有必要。

本研究中,T 2+半夏轉(zhuǎn)錄組SSR基元重復(fù)類型種類多,出現(xiàn)的密度大,頻率高。在27 252條Unigene中找到符合條件的SSR位點40 621個,Unigene出現(xiàn)頻率為36.09%,這個頻率遠高于王森等[15]報道的13.47%和劉丹等[16]報道的17.06%;也高于同屬天南星科的魔芋17.91%[18],造成這一差異的原因一方面可能是來自種屬之間的差異;另一方面可能是轉(zhuǎn)錄組收集到了正常轉(zhuǎn)錄組未收集到的含有SSR的Unigene。本研究中,SSR的平均距離為2.24 kb,高于王森等[15]報道的4.33 kb及劉丹等[16]報道的3.39 kb,說明本研究發(fā)現(xiàn)的SSR作為分子標記具有很大潛力。

半夏轉(zhuǎn)錄組中以單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)類型為SSR主要基元類型,這與劉丹等[16]報道的趨勢一致。SSR基元重復(fù)次數(shù)、序列片段長度決定了SSR的多態(tài)性。隨著SSR基元重復(fù)次數(shù)的增加,尤其是重復(fù)次數(shù)大于等于12次或者序列長度大于等于20 bp時將其開發(fā)為多態(tài)性標記的潛力將大大提升[19]。本研究中的SSR重復(fù)單元次數(shù)主要集中在5～20次之間,占比約為91.11%,其中重復(fù)次數(shù)大于等于12次的SSR占總SSR的比例為26.33%,表明這些SSR位點具有較大開發(fā)潛力。

總之,本研究利用胡蘿卜果膠桿菌侵染下的T 2+半夏轉(zhuǎn)錄組篩選出的SSR重復(fù)基元類型多,出現(xiàn)頻率高、密度大、其作為多態(tài)性標記開發(fā)的潛能大。這些SSR標記將縮短半夏抗軟腐病品種選育的時間、增加半夏多樣性研究以及遺傳圖譜繪制的手段。