郭勝微， 邊思文， 丁建文， 張曉辰， 楊興， 杜錦*， 向春陽*

（1.天津農學院農學與資源環(huán)境學院，天津 300392； 2.天津中天潤農科技有限公司，天津 300000）

糯玉米是玉米第9 號染色體wx基因發(fā)生隱性突變后，直鏈淀粉含量顯著降低的特殊類型玉米[1]。與普通玉米相比，糯玉米胚乳中均為支鏈淀粉，具有獨特的口感和豐富的營養(yǎng)價值，可用于鮮食、輕工業(yè)等[2]。據中國種子協會統(tǒng)計，我國糯玉米種植面積已由21 世紀初的不足7 萬hm2發(fā)展至80萬hm2左右[3]。

低溫脅迫是一種常見的非生物脅迫。受環(huán)境影響，全球氣溫波動較大，對世界各國作物生產均造成嚴重的損失和危害[4-5]。玉米是典型的喜溫C4作物，各生長階段對低溫都很敏感，最適宜的萌發(fā)溫度為25 ℃，若溫度過低則會降低種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數等，干擾種子正常萌發(fā)[6]。此外，低溫會造成活性氧大量積累[7]，引發(fā)代謝紊亂[8]，造成出苗率差、生長緩慢、生育期延遲等現象，影響作物的品質和產量[9]。我國東北及華北地區(qū)糯玉米種植面積大，品種繁多，為了獲得更高的經濟效益，種植者更傾向于早春提前播種，這樣會造成糯玉米的萌發(fā)期正值氣溫較低的時節(jié)，容易遭受倒春寒影響，因此耐低溫糯玉米品種的篩選尤為重要。

當前對糯玉米萌發(fā)期耐低溫評價并沒有統(tǒng)一標準，但單一指標無法全面展示糯玉米種質特性，不能準確反映糯玉米耐低溫能力，因此，利用不同分析方式對多項指標進行綜合評價以得到客觀準確的數據信息尤為重要。當前利用率較高的綜合評價方法主要有主成分分析法[10]、隸屬函數法[11]、灰色關聯分析法[12]和聚類分析等[13]。劉杰等[14]利用主成分分析法對81 個玉米品種萌發(fā)期耐冷性進行分析評價，并結合聚類分析將其按耐冷性強弱分為5 類。褚力嘉等[15]結合主成分分析法、隸屬函數法和聚類分析法，將13 個測定指標轉化為3 個相互獨立的綜合指標，將20 份玉米材料按萌發(fā)期耐冷性強弱劃分為3 大類。這種綜合評價方法結合多種分析方式，能夠更好地反映種質的特性。前人對普通玉米萌發(fā)期耐低溫能力的研究較為廣泛，但關于糯玉米耐低溫綜合評價方面的報道還比較少，因此，本研究以48 個糯玉米品種為試驗材料，以萌發(fā)期各指標的相對值作為耐低溫評價指標，通過主成分分析法、隸屬函數法和聚類分析等對各糯玉米品種的耐低溫能力做出準確鑒定和評價，以期為耐低溫糯玉米的篩選和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗在天津農學院種子實驗室進行，選用48個糯玉米品種作為供試材料（表1）。

表1 48個供試糯玉米品種Table 1 48 tested waxy maize varieties

1.2 試驗設計

采用低溫發(fā)芽試驗，糯玉米種子用1.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒20 min，蒸餾水沖洗3 次。隨機取100 粒種子均勻擺放于發(fā)芽盒中進行標準發(fā)芽試驗，每個品種4 次重復，恒溫培養(yǎng)。其中，低溫處理組于12 ℃低溫培養(yǎng)20 d；對照組于25 ℃培養(yǎng)7 d，每天記錄發(fā)芽種子數。發(fā)芽試驗結束后測定相關指標。

1.3 測定項目與方法

測定項目包括發(fā)芽勢（germination energy，GE）、發(fā)芽率（germination rate，GR）、活力指數（vigor index，Ⅵ）、苗長（seedling length，SL）、根長（root length，RL）、根表面積（root surface area，RSA）、根體積（root volume，RV）、根系數（roots number，RN）、苗干重（seedling dry weight，SDW）和根干重（root dry weight，RDW）。

每天測定種子的發(fā)芽數，發(fā)芽標準為胚根≥種子長、胚芽≥1/2 種子長。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數的計算方法參見《種子學》[16]。其中處理組發(fā)芽勢和發(fā)芽率的測定時間分別為第16天和第20天；對照組發(fā)芽勢和發(fā)芽率的測定時間分別為第4天和第7天。

選取有代表性的幼苗10 株，采用刻度尺測量苗長（cm），取平均值；采用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)測定根長(cm)、根表面積(cm2)、根體積(cm3)和根系數(根)；將幼苗和根分別于烘箱105 ℃殺青30 min，80 ℃持續(xù)烘干至恒重，測定苗干重(g)和根干重(g)。

采用測定指標的相對值表示耐低溫系數(low temperature tolerance coefficient，LTTC)，計算公式如下。

1.4 耐低溫綜合評價

為減小不同方法間的差異對整體評價結果的影響，通過主成分分析法、隸屬函數法和聚類分析對糯玉米品種的耐低溫能力進行綜合評價。首先利用主成分分析法確定主成分個數，將各指標轉化為可以代表多個指標表達信息的綜合指標；再利用隸屬函數法計算綜合評價值（D值），對48 個糯玉米品種的耐低溫能力進行綜合評價，并進行聚類分析。

其中，Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示第j個綜合指標最小值；Xmax表示第j個綜合指標最大值；Pj為某主成分j的貢獻率。

1.5 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2021 和SPSS 25. 0 軟件進行數據的整理和統(tǒng)計分析，利用Origin 2021 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 48個糯玉米品種耐低溫指標的相關分析

對10 個指標的相對值進行相關性分析，如圖1 所示。10 個指標間均呈正相關，除相對根系數與相對發(fā)芽勢和相對苗干重間相關不顯著外，其余指標間均呈極顯著正相關（P＜0.01）。

圖1 低溫脅迫下48個糯玉米品種各指標相關性Fig. 1 Correlation of indexes of 48 waxy maize varieties under chilling stress

2.2 48個糯玉米品種耐低溫主成分分析

糯玉米萌發(fā)期的耐低溫能力是復雜的數量性狀[17]，受多種因子調控，單一的指標無法準確反映各品種間的差異性。為了更全面地分析糯玉米品種地耐低溫性，采用主成分分析法進一步評價。對測定的10 項指標進行抽樣適合性檢驗（Kaiser-Meyer-Olkin，KMO）和巴利特球體檢驗（Bartlett test），結果（表2）表明，KMO 為0.726（＞0.6），顯著性為0.000（＜0.05），因此拒絕巴利特球體檢驗的零假設。

表2 KMO和Bartlett適合性檢驗Table 2 KMO and Bartlett compatibility test

各項指標間關聯程度較高，適合采用主成分分析法，以特征值大于1 為原則，提取出2 個主成分，累計貢獻率達到79.183%（表3）。第1 主成分的特征值為6.477，貢獻率為64.766%，代表的主要指標包括相對根干重、相對根表面積、相對根體積、相對根長和相對苗長，可反映低溫脅迫下糯玉米的根系生長狀態(tài)；第2 主成分的特征值為1.442，貢獻率為14.417%，代表的主要指標包括相對苗干重、相對發(fā)芽率、相對活力指數、相對根系數和相對發(fā)芽勢，可反映低溫脅迫下糯玉米的萌發(fā)情況，其中相對根系數對第2 主成分的影響為負向。

設相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對活力指數、相對苗長、相對根長、相對根表面積、相對根體積、相對根系數、相對苗干重和相對根干重依次為X1～X10，根據表3 主成分特征向量，可得出2 個主成分的得分表達式。

根據Y1和Y2，可得出糯玉米耐低溫綜合得分模型。

綜合得分Y代表了糯玉米的耐低溫能力，Y值越大說明該品種糯玉米的耐低溫能力越強。

2.3 48個糯玉米品種耐低溫隸屬函數綜合分析

結合隸屬函數法進一步對糯玉米耐低溫進行綜合分析。將2 個主成分的綜合評價值，根據公式（2）（3）和（4）計算2 個主成分下的隸屬函數值U1、U2及權重和綜合評價值（D值）。如表4 所示，2 個主成分下的權重分別為0.818 和0.182。對于第1 主成分來說，‘潤彩糯686'的隸屬函數值最大，‘潤糯597'的隸屬函數值最小，說明在第1 主成分下，‘潤彩糯686'表現出較強的耐低溫能力，而‘潤糯597'的耐低溫能力較弱。對于第2 主成來說，‘景坡82'的隸屬函數值最大，‘潤糯622'的隸屬函數值最小，說明在第2主成分下，‘景坡82'表現出較強的耐低溫能力，‘潤糯622'的耐低溫能力較弱。計算48 個糯玉米品種的D值，結果（表4）表明，耐低溫能力較強的5個糯玉米品種依次為‘潤彩糯686'‘景坡82'‘潤糯175'‘潤糯605'‘天貴糯932'；對低溫較為敏感的5個糯玉米品種依次為‘潤糯597'‘津糯72'‘津糯69'‘華耐甜糯358'‘津糯711'。

表4 48個糯玉米品種耐低溫主成分得分、權重、隸屬函數值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties 續(xù)表Continued

表4 48個糯玉米品種耐低溫主成分得分、權重、隸屬函數值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties 續(xù)表Continued

表4 48個糯玉米品種耐低溫主成分得分、權重、隸屬函數值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties

2.4 48個糯玉米品種耐低溫聚類分析

根據48 個糯玉米品種的D值采用系統(tǒng)分類法進行聚類分析，結果（圖2）表明，在歐氏距離為5 時，48 個糯玉米品種被劃分成耐低溫型、較耐低溫型、低溫較敏感型和低溫敏感型4 個類群。其中耐低溫型有5 個糯玉米品種，占測定品種的10.42%，包括‘潤彩糯686'‘景坡82'‘潤糯175'‘潤糯605'和‘天貴糯932'，D值變化范圍為0.938～0.757；較耐低溫型有22 個糯玉米品種，占測定品種的45.83%，包括‘景糯307'‘潤黑糯729'‘潤黑糯829'‘潤甜糯70'和‘潤甜糯828'等，D值變化范圍為0.709～0.505；低溫較敏感型有12個糯玉米品種，占測定品種的25%，包括‘潤潤糯73'‘潤糯197'‘景頗556'‘津糯215'和‘景甜糯1248'等，D值變化范圍在0.491～0.356；低溫敏感糯玉米品種有9 個，占測定品種的18.75%，包括‘潤糯1704'‘潤甜糯907'‘津糯69'‘津糯72'和‘潤糯597'等，D值變化范圍在0.323～0.128。

圖2 48個糯玉米品種耐低溫聚類分析圖Fig. 2 Cluster analysis of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties

2.5 評價耐低溫糯玉米品種的回歸模型

為更快捷地評價糯玉米品種的耐低溫能力，利用回歸分析對各指標進行篩選，建立糯玉米耐低溫評價的數學模型。將10 個性狀的耐低溫系數作為自變量， 耐低溫綜合評價值D值作為因變量，進行逐步回歸分析，最終建立回歸方程。

方程決定系數R2=0.995，代表回歸方程可以很好地反映糯玉米的耐低溫能力。在同一條件下，只需測定不同基因型糯玉米的相對根干重（RRDW）、相對苗長（RSL）、相對發(fā)芽勢（RGE）、相對發(fā)芽率（RGR）、相對苗干重（RSDW）和相對根表面積（RRSA） 6個指標，利用方程便可估算出D值大小，對糯玉米品種耐低溫能力進行準確評價。

3 討論

萌發(fā)期是糯玉米對低溫脅迫十分敏感的階段[18]，低溫脅迫會降低種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢，出現種子萌發(fā)和出苗緩慢、幼苗活力減弱等不良影響[19]。前人對普通玉米低溫脅迫的一些研究將處理組溫度設置為10 ℃[14,20]，Mohamed 等[21]采用日間溫度為10 ℃、夜間溫度為4 ℃對玉米進行處理，結果表明ZmPgb1.1的過表達會減弱玉米低溫脅迫期間活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導的損傷，調節(jié)玉米對低溫脅迫的抗性。但本研究室通過前期試驗發(fā)現，10 ℃低溫脅迫下很多糯玉米品種出現不萌發(fā)或萌發(fā)后死亡的現象，說明糯玉米品種在萌發(fā)期對低溫脅迫較普通玉米更加敏感。因此本試驗設置12 ℃為低溫脅迫溫度。不同糯玉米品種本身的遺傳特性不同，各品種的耐低溫能力存在差異[22]，隨著糯玉米育種的快速發(fā)展，我國已積累大量的糯玉米種質資源，為簡便且準確地分析篩選出在萌發(fā)期耐低溫較強的糯玉米種質，客觀系統(tǒng)的耐低溫評價體系尤為重要。

前人對不同作物萌發(fā)期耐低溫評價指標的選擇雖有不同，但主要集中在發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、活力指數等種子萌發(fā)指標[23-24]，對根系指標鮮有關注。實際上根系性狀與作物耐低溫能力密切相關，Zhao 等[25]通過綜合脂質組學和轉錄組學分析，探討了低溫脅迫下玉米幼苗根系膜脂代謝的變化，結果表明磷脂酰膽堿作為根系膜脂的主要成分，低溫脅迫下其含量降低了10%左右；Hund 等[26]研究表明，低溫脅迫下根的長度和直徑呈負相關，與發(fā)芽指數也呈負相關。以上研究表明根系性狀與低溫脅迫密切相關，因此，本研究在萌發(fā)指標的基礎上增加了根系性狀，且主成分分析也表明第1 主成分即為根系生長因子，是糯玉米耐低溫鑒定指標的重要組分。為了更客觀地評價作物抗逆性，前人一般采用多個指標作為綜合指標后對材料作出評價，避免單一指標的局限性。張隴艷等[27]研究認為，棉花耐低溫評價應以芽鮮重、芽干重、活力指數、平均發(fā)芽速度和平均發(fā)芽時間作為測定指標；王麗艷等[28]認為對水稻萌發(fā)期的耐低溫評價應以發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數、株高、根干重、根表面積和根體積作為測定指標；而黃賀等[23]認為單項指標的評價結果同隸屬函數法得到的耐低溫綜合評價結果相統(tǒng)一。綜上所述，前人對不同作物萌發(fā)期的耐低溫評價最優(yōu)指標存在差異，說明不同作物間對低溫脅迫的響應存在一定差異。本研究通過對糯玉米萌發(fā)期的10 個耐低溫相關指標進行主成分分析，提取出2 個主成分，將其命名為根系生長因子和種子萌發(fā)因子；再通過回歸分析對各指標進行篩選，得糯玉米耐低溫評價模型（公式8）：即相同條件下測定糯玉米的相對根干重（RRDW）、相對苗長（RSL）、相對發(fā)芽勢（RGE）、相對發(fā)芽率（RGR）、相對苗干重（RSDW）和相對根表面積（RRSA）6個指標，然后將其代入方程，即可對糯玉米的耐低溫能力做出預測和評價。

主成分分析法有降維和簡化數據結構的作用，同時可避免人為主觀因素的影響[29]。隸屬函數法利用模糊數學的原理，以運算后的綜合評價值對測定材料進行分析與評價，極大限度地減小誤差[30-31]。合理聯合多種方法對指標分析，從而盡可能地消除差異，提高數據表達的準確性和客觀性[32]。近年來，越來越多的學者對不同作物在各類非生物脅迫下的抗性進行了鑒定與評價，吳奇等[33]利用主成分分析和聚類分析，將54 份高粱品種按抗旱性強弱分為4 類；李紅宇等[34]結合主成分分析、隸屬函數分析、回歸分析和聚類分析等多種方法，對50 份北方粳稻品種的耐鹽堿性進行評價。目前對作物抗性的鑒定評價體系并未統(tǒng)一，總體來看分析方式已從單一的分析逐步發(fā)展為利用多種分析方法的綜合評價，降低了單一評價的片面性和差異性，其鑒定評價結果也更為客觀準確。