梁婷， 左靜紅， 陸青， 楊東， 唐益苗， 郭春曼*，汪德州*， 王偉偉*

（1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所，北京 100097）

鈣離子（Ca2+）是細胞內(nèi)重要的第二信使之一，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[1]。植物主要通過鈣離子傳感器監(jiān)測細胞質(zhì)中Ca2+水平變化，進而調(diào)控一系列下游反應(yīng)[2-3]。鈣離子傳感器分為4類：鈣調(diào)素 (calmodulin，CaM)、鈣調(diào)素類似蛋白 (calmodulin like protein，CML)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B 樣蛋白 (calmodulin B-like，CBL)和鈣依賴型蛋白激酶 (calcium dependent protein kinase，CDPK)[4-5]。其中，鈣調(diào)素是一種高度保守的小型酸性蛋白，自身沒有酶活性，在結(jié)合Ca2+后產(chǎn)生構(gòu)象變化，激活其下游靶蛋白-鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin binding protein，CaMBP）行使其功能。CaM 與CaMBP 結(jié)合類型分為2 類，需要Ca2+參與的為Ca2+依賴型，不需要Ca2+參與的為Ca2+不依賴型[6]。Ca2+不依賴型中存在含有IQ 基序（IQxxxRGxxxR）的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)域和所含IQ 基序數(shù)量的不同，將此種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白分為5類，分別是IQM (IQ motif containing protein)、CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)、IQD (IQ67-domain containing protein)、CNGC(cyclic nucleotide-gated channel)和myosin。其中，IQM 只含有1 個能與鈣調(diào)素結(jié)合的IQ 基序，且該基序位于氨基酸序列N端[7]。IQM 廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實等器官中，是鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族基因中非常重要的一類，與其他鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族相比，植物特異性IQM基因僅在擬南芥、水稻中進行了全面分析，其他物種中甚少報道。報道顯示，IQM基因在各種不同組織及不同脅迫條件下的表達量有顯著變化，其可能參與植物生長發(fā)育、逆境脅迫等多種生理調(diào)控過程[8]。

擬南芥中已鑒定出6 個IQM基因家族成員(IQM1～IQM6)，其 蛋 白 質(zhì)N 端均含有1 個IQ 基序[2]。AtIQM1與AtCaM5能在酵母和植物細胞中結(jié)合，并以Ca2+依賴型方式通過影響活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量來調(diào)節(jié)氣孔運動[9]，AtIQM1的突變體氣孔開度顯著減小，且不受外因（光照、黑暗等）誘導(dǎo)，過表達AtIQM1植株在光誘導(dǎo)氣孔開放處理后氣孔開放度明顯增大[10]。此外，AtIQM1在調(diào)控根系生長、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）生物合成及防御灰霉病過程中也發(fā)揮重要作用[2,11]；AtIQM2參與擬南芥根的生長發(fā)育及開花調(diào)控，AtIQM2突變體成花時間推遲[12]；AtIQM3通過調(diào)控擬南芥光周期途徑進而影響開花時間[13]；AtIQM4對植物生長發(fā)育起正調(diào)控作用，在種子休眠和萌發(fā)期發(fā)揮重要作用[14]；AtIQM5通過參與調(diào)控年齡途徑影響擬南芥開花時間[15]；AtIQM6基因突變致使遠軸面表皮毛的發(fā)生晚于野生型[16]。水稻中已報道7 個IQM基因家族成員，研究顯示OsIQMs通過與OsCaMs相互作用參與多種通路調(diào)控，并且OsIQMs中的IQ 基序是OsIQMs與OsCaMs結(jié)合所必需的，幾乎所有的OsIQMs基因都是ABA 和MeJA 響應(yīng)基因，OsIQM1通過與OsWRKY24共同作用參與植物病害反應(yīng)[7]。

小麥是最重要的糧食作物之一，提高小麥抗逆性、增加小麥產(chǎn)量，是解決糧食安全問題的關(guān)鍵因素。植物特異性IQM基因參與逆境脅迫調(diào)控，但小麥中IQM基因家族成員及功能尚未進行系統(tǒng)報道。本研究在小麥全基因組水平下共鑒定出23 個TaIQM基因家族成員，對其染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、非生物脅迫下的基因表達模式等進行了系統(tǒng)分析，篩選得到了一些可能參與小麥逆境脅迫相關(guān)的候選基因，為深入研究小麥IQM基因的重要生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取小麥標(biāo)準栽培品種中國春(Chinese spring, CS)為試驗材料，將種子置于25 ℃的光照培養(yǎng)間水培，待長到2 葉1 心期，對小麥幼苗分別進行PEG-6000 溶液、低溫（4 ℃）、高溫（42 ℃）、NaCl (0.2 mol·L-1)和ABA（0.15 mol·L-1）脅迫處理，設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，以0 h 未處理的地上部和地下部組織作為對照（CK），在處理1、3、6、12、24 h 后取地上部和地下部組織，液氮冷凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥IQM基因家族鑒定 從Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥、水稻IQM 家族蛋白序列及小麥全基因組CDS 和蛋白序列，利用HMMER 軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，使用SMART(http://smart.emblheidelberg)、Pfma(https://pfam.xfam.org/)確 認是否含有完整的IQ 結(jié)構(gòu)域[17]。使用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站獲取小麥IQM 家族成員蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)、分子量等理化性質(zhì)數(shù)據(jù)。使用Euk-mPLoc 2.0 server (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)網(wǎng)站在線進行亞細胞定位預(yù)測分析。

1.2.2 小麥IQM基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 運用MEGA X 中的Align by Clustal W 對小麥、水稻、擬南芥IQM 基因家族蛋白序列進行多序列比對，參數(shù)設(shè)置為默認值，Bootstrap 值設(shè)置為1 000，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，構(gòu)建所得進化樹使用 Evolview(https://evolgenius. info//evolview-v2/#login)在線工具進行處理。

1.2.3 小麥IQM基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析使用GSDS 軟件(http://gsds.gao-lab.org/)分析小麥IQM 基因家族成員基因結(jié)構(gòu)，使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進行保守基序測定，最大Motif 數(shù)量設(shè)置為10，其他參數(shù)為默認值，利用TBtools 軟件中的Gene Structure View 程序進行可視化。

1.2.4 小麥IQM基因啟動子順式作用元件預(yù)測從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中提取小麥IQM基因起始密碼子上游2 000 bp 序列，使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測啟動子順式作用元件[18]，利用TBtools 軟件中Gene Structure View程序進行可視化。

1.2.5 小麥IQM基因組織表達模式分析 利用WheatOmics 1.0(http://202.194.139.32/)查找并下載中國春不同組織不同時期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，分析小麥IQM基因的組織表達特異性，使用TBtools軟件中的HeatMap程序繪制表達模式熱圖。

1.2.6 小麥IQM基因成員非生物脅迫表達模式分析 依據(jù)數(shù)據(jù)庫中下載的小麥IQM基因CDS序列，避開保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計qRT-PCR 引物（表1）。采用Trizol 法提取脅迫處理小麥材料總RNA 后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時測定OD260/280值。使用HiScript?Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit (諾唯贊生物科技股份有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板進行qRT-PCR 分析。反應(yīng)體系為20 μL，包括Taq Pro Universal SYBR Qpcr Master Mix(諾唯贊生物科技股份有限公司) 10 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、cDNA 模板2 μL(100 ng)，ddH2O 6 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)后增加熔解曲線環(huán)節(jié)，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃變性15 s，擴增曲線和熔解曲線鑒定引物特異性。3 次生物學(xué)重復(fù)，采用2-△△CT法[19]計算相對表達量。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers 續(xù)表Continued

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 TaIQM基因家族鑒定及序列分析

利用生物信息學(xué)方法獲得23 個TaIQM基因家族成員。Pfam 分析表明，TaIQM 蛋白均含有IQ結(jié)構(gòu)域。按照其在小麥染色體上的位置依次命名為TaIQM1～TaIQM23（表2）。染色體定位顯示TaIQM基因不均勻的分布在18條染色體上，其中，5A、5B、5D、6B 和6D 染色體上均含有2 個IQM基因，其他染色體上均只含有1個IQM基因。對23個TaIQM 蛋白的氨基酸數(shù)目、相對分子量、等電點等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析結(jié)果顯示，TaIQM基因家族成員編碼的氨基酸數(shù)目在424～669 個之間，相對分子量在47 667.67～74 779.20 Da之間，等電點在6.14～9.67 之間，TaIQM 蛋白間氨基酸數(shù)目存在較大差異，相應(yīng)的蛋白相對分子量、等電點也存在較大差異。亞細胞定位預(yù)測顯示TaIQM家族基因主要存在于細胞核中。

表2 小麥IQM基因家族蛋白理化性質(zhì)及亞細胞定位Table 2 Characteristics and subcellular localization prediction of TaIQM genes 續(xù)表Continued

表2 小麥IQM基因家族蛋白理化性質(zhì)及亞細胞定位Table 2 Characteristics and subcellular localization prediction of TaIQM genes

2.2 TaIQM基因家族蛋白系統(tǒng)進化分析

為研究小麥IQM基因與水稻、擬南芥的系統(tǒng)進化關(guān)系，將23 個小麥 (Triticum aestivumL.)、8 個水稻(Oryza sativa)和6 個擬南芥(Arabidopsis thaliana)的IQM蛋白序列進行多序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)。結(jié)果顯示，IQM基因家族成員可分為3個亞家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，Ⅰ中共有15個IQM基因家族成員，其中小麥IQM基因9個，TaIQM4、TaIQM5、TaIQM6與OsIQM5在一個分支上，表明他們之間進 化 關(guān) 系 相 近；TaIQM10、TaIQM11、TaIQM12與OsIQM2、TaIQM6在 一 個 分 支 上；TaIQM14、TaIQM16、TaIQM18與OsIQM3在一個分支上，他們都與AtIQM2和AtIQM6屬于同一亞家族。Ⅱ中含有11個IQM基因家族成員，其中小麥IQM基因6 個，TaIQM1、TaIQM2、TaIQM3與OsIQM4在同一分支上；TaIQM7、TaIQM8、TaIQM9與OsIQM1在同一分支上，他們都與AtIQM1、AtIQM4和AtIQM5屬于同一亞家族。Ⅲ中含有11 個IQM基因家族成員，其中小麥IQM基因8個，TaIQM13、TaIQM15、TaIQM17、TaIQM19、TaIQM20、TaIQM21、TaIQM22、TaIQM23與OsIQM7、OsIQM8、AtIQM3屬于同一亞家族。所有亞家族中小麥與水稻IQM家族成員進化關(guān)系較近，同源性較高，與擬南芥親緣關(guān)系較遠，表明IQM家族基因在單子葉植物和雙子葉植物進化過程中發(fā)生了分離。

圖1 IQM蛋白進化樹分析Fig. 1 Phylogeny analysis of IQM proteins

2.3 TaIQM基因家族成員結(jié)構(gòu)特性

TaIQM基因結(jié)構(gòu)分析顯示，所有TaIQM基因均含有內(nèi)含子、外顯子，家族成員間基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性（圖2A）。TaIQM基因含有外顯子數(shù)量在5～10 個之間，其中，TaIQM3只含有5 個外顯子；TaIQM4、TaIQM5等5 個 基 因 含 有7 個 外 顯 子；TaIQM9、TaIQM11等5 個基因含有8 個外顯子；TaIQM1、TaIQM10等11 個基因含有9 個外顯子；TaIQM2含有11個外顯子。除TaIQM2、TaIQM8和TaIQM20外，其他都含有3'UTR。蛋白基序分析顯示（圖2B），TaIQM基因家族中有16個基因均含有10 個相同基序；TaIQM1、TaIQM2、TaIQM7等5 個基因只含有9 個Motif，不含有Motif10；TaIQM3僅含有6個Motif；所有TaIQM基因都含有Motif6（IQM基因家族保守結(jié)構(gòu)域）（圖2C）。以上說明相似度較高的TaIQM基因間可能有相同進化方向。

圖2 TaIQM家族成員結(jié)構(gòu)特征和保守基序分析Fig. 2 Structure and conservative motif analysis of the TaIQM

2.4 TaIQM基因順式作用元件

TaIQM基因包含多種脅迫響應(yīng)順式作用元件(圖3)，如干旱誘導(dǎo)(MBS)、厭氧(ARE)、低溫(LTR)、防御與應(yīng)激(TC-rich repeats)響應(yīng)元件，還包含多種激素響應(yīng)順式作用元件，如脫落酸(ABRE)、生長 素(TGA-element)、赤 霉 素(GARE-motif、P-box、TATC-box)和水楊酸(TCA-element)響應(yīng)元件，推測TaIQM可能參與脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)過程。此外，TaIQM基因還包含一些保守的順式作用元件(如CAAT-box、TATA-box 等)和一些光響應(yīng)(ACE、G-box)、分生組織表達調(diào)控(CAT-box)、晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian)和胚乳表達調(diào)控(GCN4-motif)等元件，預(yù)示著TaIQM家族可能還參與其他多種生物學(xué)過程。

圖3 TaIQM啟動子順式作用元件預(yù)測Fig. 3 Cis-acting elements analysis of TaIQM genes

2.5 TaIQM基因組織表達特性

根據(jù)網(wǎng)站中已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，繪制23 個TaIQM基因的組織表達量熱圖（圖4）。結(jié)果顯示，不同TaIQM基因間表達量差別明顯，同一TaIQM基因在不同組織的不同時期間表達量也存在差別。其中，TaIQM2在不同組織中都有較高的表達量；TaIQM10、TaIQM11和TaIQM12在不同組織中表達量極低；TaIQM4和TaIQM5在拔節(jié)早期的莖中表達量較高；TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9在分蘗早期和開花后2 d 的葉中表達量較高；TaIQM13在1 葉期的根中表達較高；TaIQM6、TaIQM15和TaIQM17在拔節(jié)早期的穗中表達量較高；TaIQM18在根的不同時期中表達較高；TaIQM19、TaIQM21和TaIQM23在開花后2 d 的籽粒中表達量較高?；虻谋磉_量變化表明在不同的發(fā)育時期各個TaIQM基因功能各不相同。

圖4 TaIQM基因在不同組織中的表達量熱圖Fig. 4 Heat map of relative expression level of TaIQM genes in different tissues

2.6 非生物脅迫下TaIQM基因qRT-PCR分析

TaIQM基因家族成員對非生物脅迫存在不同程度的響應(yīng)，相對表達量存在明顯差異（圖5）。低溫處理下，7 個TaIQM基因在地上部呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，如TaIQM10、TaIQM11和TaIQM12；3個TaIQM基因在地下部呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，如TaIQM1、TaIQM2、TaIQM3。高 溫 處 理 下，2 個TaIQM基因在地上部呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，如TaIQM7和TaIQM9；全部TaIQM基因在地下部均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達趨勢。NaCl 處理下，11個基因在地上部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，如TaIQM4、TaIQM5和TaIQM6；9 個基因在地下部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。ABA 處理下，2 個基因在地上部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，如TaIQM11和TaIQM12；6 個基因在地下部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，如TaIQM10、TaIQM13（圖5A）。干旱處理下，17個TaIQM基因在地上部均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達趨勢，如TaIQM10、TaIQM11和TaIQM12，其余6 個TaIQM基因在地上部呈下調(diào)表達趨勢；所有TaIQM基因在地下部均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達趨勢（圖5B）。推測在小麥苗期地下部，干旱脅迫對所有TaIQM基因的表達存在促進作用。

3 討論

IQM基因廣泛存在于植物中，參與調(diào)控眾多生理生化過程，在擬南芥、水稻中已有系統(tǒng)研究，而在小麥中還未見報道。本研究在小麥全基因組中鑒定出23個IQM 基因家族成員，對獲得的TaIQM基因染色體位置、蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、表達模式等進行全面分析。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，IQM基因家族被劃分為3 個亞族。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系揭示了IQM 蛋白之間的進化關(guān)系，同一亞科中最近緣的成員在保守蛋白序列和基序結(jié)構(gòu)上相似，每個亞家族的IQM 蛋白可能具有相似的功能[20]。保守蛋白序列分析顯示，小麥IQM基因均存在6 個相同的Motif，其中Motif 6是位于蛋白序列N端且包含IQ基序的IQM基因家族保守結(jié)構(gòu)域[7]。IQ 結(jié)構(gòu)域與鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，報道顯示，IQD 蛋白與玉米、毛竹和擬南芥中的CaMs 相互作用[21]，擬南芥中，IQM 蛋白與CaMs 相互作用[2]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，多數(shù)基因的3'端和5'端都含有UTR，且都存在7～10個外顯子。在Motif相同情況下，內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)差異是推動多基因家族演變的關(guān)鍵因素之一。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)TaIQM基因存在大量與生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答、激素調(diào)節(jié)相關(guān)的順式作用元件，推測TaIQM基因可能通過與干旱誘導(dǎo)、脫落酸、赤霉素等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點相互作用調(diào)控干旱應(yīng)答，但還需相關(guān)試驗進一步驗證。鈣調(diào)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控植物生長發(fā)育、逆境脅迫的重要信號組成部分，主要由鈣離子、鈣調(diào)素及鈣調(diào)素結(jié)合蛋白組成[5]。目前，已報道的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白多達90 種以上，如MYB、NAC、WRKY、CBP60、CAMTA/SR 等轉(zhuǎn)錄因子[3]，它們通過協(xié)同作用調(diào)控植物生長發(fā)育及脅迫反應(yīng)，如OsWRKY24通過與OsIQM1協(xié)同作用應(yīng)對植物病害反應(yīng)。23個TaIQM基因在不同發(fā)育階段和不同組織中表達差異顯著，這些基因可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用參與調(diào)控小麥生長發(fā)育過程。

植物中的IQM基因在干旱、低溫等非生物脅迫應(yīng)答中起重要作用[22]，且在不同時空條件下參與調(diào)節(jié)不同的脅迫反應(yīng)[21]。報道顯示，AtIQM1介導(dǎo)CaM、光和部分非生物脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]，AtIQM4在擬南芥中與AtIQM1協(xié)同參與光和ABA對氣孔運動的調(diào)控[23]，鹽和滲透脅迫均可降低擬南芥苗期AtIQM1和AtIQM4的表達水平，脫水、低溫處理均能提高AtIQM4的表達水平，AtIQM4在植物非生物脅迫響應(yīng)中起重要作用[14]。水稻中7 個IQM基因在重金屬鹽CdCl2和Pd(NO3)2處理下的擬南芥幼苗中全部顯示上調(diào)表達。OsIQM3和OsIQM5在PEG 脅迫反應(yīng)中顯示較高的轉(zhuǎn)錄水 平[7]。TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9與AtIQM1、AtIQM4進化關(guān)系相近，干旱脅迫下TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9在地下部顯著上調(diào)表達，與AtIQM4的表達模式相似，基因表達模式為研究基因功能提供重要依據(jù)，這些基因在小麥干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)地下部中均呈現(xiàn)正向調(diào)控，結(jié)合組織表達數(shù)據(jù)中TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9在根和葉組織中偏好表達，表明TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9可能參與調(diào)控小麥苗期地下部抗旱反應(yīng)。這些基因可作為抗旱候選基因進一步深入研究。

本研究在小麥全基因組水平上系統(tǒng)鑒定和分析了23 個小麥IQM基因，對其生物信息學(xué)及非生物脅迫下表達模式進行了系統(tǒng)分析。進化樹分析表明小麥IQM基因分為3 個亞家族(I～III)，基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列分析表明這些基因在每個亞家族中都相對保守。非生物脅迫下的表達模式分析表明絕大多數(shù)IQM基因?qū)EG、NaCl、冷和 ABA 處理有反應(yīng)，說明它們參與植物響應(yīng)非生物脅迫調(diào)控過程。本研究結(jié)果為深入探究小麥IQM家族各成員的生物學(xué)功能及非生物脅迫作用機制和小麥抗逆分子育種提供一定參考。