董亞慧,趙 格,周慶軍

0 引言

單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type Ⅰ, HSV-1)感染所致的單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是一種全球性的嚴(yán)重致盲性眼病。HSV-1在角膜初發(fā)感染后被轉(zhuǎn)運至三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion,TG)進(jìn)入潛伏狀態(tài),在宿主免疫能力下降等因素的影響下,潛伏的HSV-1會再次活化,并轉(zhuǎn)運至原發(fā)感染部位,引起HSK的復(fù)發(fā)[1],臨床主要表現(xiàn)為角膜知覺減退、新生血管和瘢痕化,最終需行角膜移植復(fù)明。根據(jù)統(tǒng)計,雖然92%的正常人淚液中可以檢測到HSV-1的DNA[2],但只有28%～32%的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)的癥狀[3],在我國人群中HSK的患病率為11/10000[4]。同時,HSV-1初發(fā)感染癥狀較輕,甚至無明顯癥狀,臨床上最常見的是復(fù)發(fā)性HSK。因此,闡明HSV-1在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏復(fù)發(fā)的分子機制對于HSK的臨床防治十分重要。

1 HSV-1感染潛伏的基本過程

HSV-1是一種典型的嗜神經(jīng)病毒。目前的研究發(fā)現(xiàn):角膜上皮細(xì)胞表達(dá)一系列介導(dǎo)HSV-1感染的蛋白,如Nectin 1,HVEM(herpes virus entry mediator),PILR-α(paired immunoglobulin-like type 2 receptor-alpha)[5-6],病毒感染后在角膜上皮細(xì)胞內(nèi)完成其復(fù)制組裝過程,而后擴散至角膜上皮層中的三叉神經(jīng)節(jié)末梢,并沿三叉神經(jīng)節(jié)軸突反向轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元胞體,在胞體中病毒基因組整合到宿主細(xì)胞核中,并通過宿主的調(diào)控機制轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致大量復(fù)制或者建立潛伏。研究表明,通過神經(jīng)元軸突逆行轉(zhuǎn)運感染胞體的途徑容易建立潛伏,而直接感染胞體或樹突則更易導(dǎo)致病毒的大量復(fù)制[7-8]。HSK初發(fā)感染后潛伏的建立,是由病毒自身的調(diào)控以及神經(jīng)元胞體的特殊結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的宿主反應(yīng)共同影響的[1]。在三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中,病毒裂解相關(guān)的基因表達(dá)受到明顯抑制,其部分DNA序列整合到宿主細(xì)胞基因組中,只表達(dá)潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體(latency-associated transcripts,LAT),最終完成HSV-1在三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的潛伏。

2 HSV-1在三叉神經(jīng)節(jié)潛伏的調(diào)控機制

雖然早在1973年即已證實HSV-1在角膜感染后轉(zhuǎn)運至三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏[9],但又經(jīng)過10余年的探索,研究者才逐漸發(fā)現(xiàn)HSV-1病毒自身和宿主反應(yīng)都參與并維持著其在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏的調(diào)控。

2.1 病毒的調(diào)控

2.1.1 抑制病毒增殖性基因的表達(dá)人受HSV原發(fā)感染后,HSV常在感覺神經(jīng)節(jié)中終身潛伏,有時也能在迷走神經(jīng)、腎上腺組織和腦中檢出。病毒的DNA以游離環(huán)狀附加體(episome)形式存在。潛伏狀態(tài)下只有很少的病毒基因表達(dá)。研究表明,病毒進(jìn)入神經(jīng)元的位置可影響病毒增殖性基因的表達(dá),從而對感染結(jié)果有相當(dāng)大的影響[7]。一些病毒相關(guān)的調(diào)節(jié)因子,例如病毒的細(xì)胞溶解啟動蛋白VP16,在軸突中的運輸相當(dāng)?shù)托?這樣就能通過抑制增殖性基因的高效表達(dá)來促進(jìn)潛伏。實驗發(fā)現(xiàn),軸突途徑感染所導(dǎo)致的潛伏,可被胞體途徑的二次感染破壞,二次感染的病原體使用的是可釋放VP16的病毒或是具有類似刺激作用的復(fù)合物。VP16蛋白的缺乏可降低幾種早期毒力基因(immediate-early gene)的表達(dá),其中包括ICP0——一種重要的病毒基因表達(dá)調(diào)控因子,可拮抗宿主的抑制因子,且在潛伏模型的復(fù)發(fā)中也起到重要作用[10]。以上結(jié)果強調(diào)了神經(jīng)元在結(jié)構(gòu)上的獨特性質(zhì),并警示我們包括HSV-1在內(nèi)的神經(jīng)元營養(yǎng)性病毒可以利用這種特性作為自己的感染優(yōu)勢。

2.1.2 潛伏相關(guān)的miRNA miRNA是近代生物醫(yī)學(xué)研究中最重要的發(fā)現(xiàn),它可為宿主基因提供一種特殊水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。多數(shù)皰疹病毒在潛伏期間可以產(chǎn)生一定數(shù)量的miRNA,進(jìn)而可以影響病毒和宿主細(xì)胞的基因表達(dá)。宿主中同樣有miRNA,病毒感染可對其表達(dá)產(chǎn)生重要影響[11]。目前主要的研究發(fā)現(xiàn),HSV-1的LAT與其在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏的建立和維持密切相關(guān)。LAT類似于哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定的長鏈非編碼RNA(lncRNA),是一種miRNA前體,可編碼產(chǎn)生幾種不同的miRNA(包括miR-H2-3p、miR-H6、miR-I等),從而可以在宿主細(xì)胞中抑制幾種關(guān)鍵的毒力因子ICP0、ICP4和ICP34.5的表達(dá)[11-13]。LAT在潛伏期的TG內(nèi)大量轉(zhuǎn)錄,主要通過下調(diào)病毒增殖性基因的表達(dá)和抵抗宿主神經(jīng)元凋亡兩種機制維持HSV-1在TG內(nèi)的潛伏[14]。與LAT相關(guān)的miRNA(如miR-LAT和miR-I)可以通過影響TGF-β信號通路介導(dǎo)的抗凋亡功能,控制HSV-1毒力因子ICP34.5表達(dá)的開關(guān)功能來調(diào)控HSV-1在神經(jīng)細(xì)胞中的潛伏和復(fù)發(fā)[12,15]。

2.1.3 抵抗宿主神經(jīng)元壞死盡管維持HSV潛伏感染和控制復(fù)發(fā)頻率的病毒基因編碼機制依然不甚明確,但已有重要證據(jù)顯示HSV-1中的LAT有助于維持病毒的長期潛伏,并能保護(hù)感染的宿主神經(jīng)元免于壞死的命運。在小型動物模型中,缺乏LAT基因的突變病毒依然能夠復(fù)制和建立潛伏,然而卻更易復(fù)發(fā)。小鼠的體內(nèi)實驗表明,在三叉神經(jīng)節(jié)中,LAT可以影響潛伏感染的神經(jīng)元的絕對數(shù)量,但在頸背根神經(jīng)節(jié)中就沒有這種影響,說明這與感染途徑或神經(jīng)元類型也有一定關(guān)系[16]。神經(jīng)元特異的miR-138能夠通過抑制病毒即早期毒力基因ICP0的表達(dá)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活[17]來維持潛伏。

2.1.4 表觀遺傳調(diào)控一些機制與毒力基因沉默相關(guān),其中包括表觀遺傳調(diào)控(甲基化和乙?；?。研究者用小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為感染模型進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗,來探究潛伏期HSV-1的游離環(huán)狀附加體基因組成。結(jié)果顯示與毒力調(diào)節(jié)基因相關(guān)的組蛋白帶有抑制性染色質(zhì)的典型標(biāo)記,即組蛋白3的第9位賴氨酸(H3K9me2/3)和第27位賴氨酸(H3K27me3)的二甲基化或三甲基化,還有降低的組蛋白乙酰化程度[18-19]。

2.2 宿主的調(diào)控

2.2.1 潛伏的維持在潛伏的建立過程中,HSV-1基因組可能通過宿主DNA的修復(fù)機制,被核心組蛋白以規(guī)律排列的核小體形式組裝起來。包括轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)在內(nèi)的所有基因組關(guān)鍵區(qū)域,都被證明與核小體有關(guān),該結(jié)構(gòu)被認(rèn)為在HSV-1潛伏過程的基因表達(dá)中起重要作用[20]。所有潛伏的皰疹病毒采用相似的排列形式,這也許就是它們不整合基因組卻可以長期在細(xì)胞中維持的原因[21]。

早在一個世紀(jì)之前,人們在治療三叉神經(jīng)痛時,發(fā)現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)的創(chuàng)傷可引發(fā)其所支配的皮膚區(qū)域的皰疹[22],這最終使人們意識到,感覺神經(jīng)節(jié)是復(fù)發(fā)病毒的來源之處,且復(fù)發(fā)極有可能是因為神經(jīng)失去了營養(yǎng)支持。許多細(xì)胞能夠分泌神經(jīng)生長因子(NGF)——一種首次被認(rèn)可的神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF可以結(jié)合膜相關(guān)受體,即由NGF依賴性感覺和交感神經(jīng)元所表達(dá)的酪氨酸激酶TrkA。TrkA受體被NGF激活后產(chǎn)生信號,持續(xù)激活的PI3-K/Akt信號通路,對維持HSV-1在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的潛伏起關(guān)鍵作用(圖1),此通路一方面可通過活化下游具有調(diào)節(jié)蛋白翻譯功能的mTOR(mammalian target of rapamycin)因子來抑制HSV-1即早期毒力因子的表達(dá),另一方面可誘導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡的功能促進(jìn)細(xì)胞的存活,從而促進(jìn)并維持HSV-1在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)潛伏[23-24]。Du等[25-26]利用潛伏感染的小鼠TG器官培養(yǎng)模型證明抗NGF的抗體可以促進(jìn)HSV-1的活化,地塞米松誘導(dǎo)的凋亡可以加速潛伏的HSV-1的再活化,這些都進(jìn)一步驗證了NGF激活的通路和抗凋亡功能在HSV-1神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)潛伏的重要性。

圖1 PI3-K/Akt信號通路對HSV-1神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)潛伏的調(diào)控作用示意圖[23]。

2.2.2 免疫的調(diào)控自體免疫系統(tǒng)在病毒性角膜炎中發(fā)揮重要作用,新近發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的表面活性蛋白(SP)A和D在角膜炎中至關(guān)重要,SP通過對病毒配體的高度親和,抑制其黏附宿主細(xì)胞,進(jìn)一步促進(jìn)吞噬病毒,同時SP調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能,保持組織在病毒感染早期的非炎癥狀態(tài),而在病原菌入侵、機體呈應(yīng)激狀態(tài)時,SP-A和SP-D又能促進(jìn)炎癥反應(yīng),幫助殺滅病原菌[27]。

HSV原發(fā)感染后1wk左右,血中出現(xiàn)中和抗體(IgM、IgG、IgA)。嚴(yán)重的原發(fā)感染或經(jīng)常性復(fù)發(fā)感染,抗體水平有所增高。這些抗體不能阻止重復(fù)感染或潛伏病毒的復(fù)發(fā),但可以減輕疾病的嚴(yán)重程度。目前研究發(fā)現(xiàn),宿主免疫相關(guān)因子、miRNA以及細(xì)胞存活相關(guān)信號通路參與調(diào)控了HSV-1在宿主體內(nèi)的潛伏,T細(xì)胞對維持HSV-1潛伏狀態(tài)、抑制復(fù)發(fā)起關(guān)鍵作用。當(dāng)機體受到多種因素如紫外照射(太陽暴曬)、壓力等刺激下的應(yīng)激反應(yīng)、性激素改變、免疫抑制劑的應(yīng)用、糖皮質(zhì)激素、角膜移植創(chuàng)傷等[28-33],潛伏的病毒被激活,病毒沿感覺神經(jīng)纖維軸索下行至神經(jīng)末梢,感染上皮細(xì)胞。上述條件同樣可以導(dǎo)致機體免疫失調(diào),產(chǎn)生復(fù)雜的免疫反應(yīng),多項動物實驗研究表明,應(yīng)激狀態(tài)會減少駐三叉神經(jīng)節(jié)CD8+T細(xì)胞和記憶細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLm)產(chǎn)生,并促進(jìn)生成IL-6等促炎細(xì)胞因子,導(dǎo)致HSV-1從潛伏期重新激活[34]。潛伏感染的神經(jīng)元也可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生病毒特異性的CD8+T細(xì)胞,對三叉神經(jīng)節(jié)中的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行處理,使其功能增強或數(shù)量增加,可抑制復(fù)發(fā)[35]。而最新研究表明,反復(fù)激活HSV-1可誘導(dǎo)局部HSV特異性CD8+T細(xì)胞的衰竭,而阻斷有癥狀患者宿主細(xì)胞的衰竭通路可恢復(fù)CD8+T細(xì)胞的保護(hù)作用從而減少復(fù)發(fā)[36],特定的病毒抗原決定簇的表達(dá)會產(chǎn)生具有免疫優(yōu)勢的CD8+T細(xì)胞群[37],這些成果為HSK的免疫靶向治療提供了新方向。

3 存在的問題

3.1 潛伏的基因組是否都可被重新激活大多數(shù)潛伏感染的神經(jīng)元都包含多種游離環(huán)狀附加體,但不能確定是否這些附加體擁有一致的染色質(zhì)結(jié)構(gòu),也不明確它們是否有相同的復(fù)發(fā)能力。有關(guān)感染的進(jìn)一步研究顯示,只有有限數(shù)量的整合基因組可以在單個細(xì)胞中成功復(fù)制,但引起這種限制的原因尚未可知[38]。

3.2 防治手段缺乏目前,針對HSV的不同治療方式正在逐漸更新,局部和全身治療都有其特定的治療模式,有時聯(lián)合療法也可以提高其治療效果[39]。還寄希望于疫苗,特別是新型疫苗,如亞單位疫苗、重組活疫苗、DNA疫苗的研究。在對動物模型進(jìn)行紫外照射復(fù)發(fā)前,用毒力減弱的HSV-1病毒作為疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng),角膜發(fā)病程度減輕,小鼠體內(nèi)抗HSV抗體增多[40]。在抗HSV的藥物中,臨床常用的有無環(huán)鳥苷(acyclovir)、丙氧鳥苷(ganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)等。這些藥物均能抑制病毒DNA合成,使病毒在細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制,從而減輕臨床癥狀,但不能徹底防止?jié)摲腥镜脑侔l(fā)。隨著研究的不斷深入,人們對病毒的潛伏復(fù)發(fā)機制了解的愈加透徹,Pegg等[41]深入研究了嗜神經(jīng)病毒的神經(jīng)侵襲機制,并證明這些嗜神經(jīng)病毒可以將首輪感染的上皮細(xì)胞中的驅(qū)動蛋白同化為一種必需的前病毒結(jié)構(gòu)組件,繼而繼續(xù)感染神經(jīng)元細(xì)胞,這一原理可能同樣存在于其他病毒系列的感染機制,還有近年來對皰疹病毒從潛伏期重新激活后從感覺神經(jīng)元到上皮組織的順行轉(zhuǎn)運能力的研究也在不斷完善[42],這些成果都為抗擊病毒復(fù)發(fā)提供了新思路。

4 小結(jié)

反復(fù)發(fā)生的角膜炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致角膜敏感度降低、瘢痕形成甚至失明,但類似的癥狀并不能作為診斷復(fù)發(fā)性HSK的確鑿證據(jù)。HSK患者在發(fā)現(xiàn)初發(fā)感染癥狀時,應(yīng)及早請醫(yī)生確診,積極治療。目前,HSK主要依據(jù)裂隙燈檢查中的臨床表現(xiàn)來診斷,但文獻(xiàn)中并沒有確切的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其他檢查如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定、酶聯(lián)免疫吸附測定,免疫熒光抗體和病毒培養(yǎng)可提供更明確的診斷,但也有一定的局限性。目前的治療方式僅能在減少角膜損傷和控制病毒擴散兩方面展開,尚未有治愈措施[43]。