黃 敏，寧 眺,2，魯峻宏，劉凱麗，袁崇峰，于德嘉，靳 松,2，李 晶,2,4

（1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.昆明學(xué)院云南省高校都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程研究中心，云南 昆明 650214；3.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224；4.香格里拉市藏美農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南 香格里拉 674400）

0 引言

草莓是薔薇科草莓屬的多年生草本植物，原產(chǎn)于南美，20 世紀(jì)初傳入中國[1-2]。草莓種植面積和產(chǎn)量在漿果類水果生產(chǎn)中僅次于葡萄，2020 年我國草莓種植面積已達(dá)13.16 萬hm2，產(chǎn)量也增至344.9 萬t，呈逐年增長的趨勢[3]。紅顏草莓是日本品種，于1999 年引入我國[4]。盡管紅顏草莓不耐熱、不耐濕，但該品種繁殖能力和結(jié)果能力強(qiáng)，特別是在云南的氣候條件下，甚至可以結(jié)4 茬果實(shí)，其果實(shí)在成熟后不僅顏色誘人且香味濃，因此在我國各地均有栽培，日漸成為云南省的主栽品種。

草莓傳統(tǒng)的繁殖方法一般是匍匐莖繁殖，但此法會(huì)加大草莓?dāng)y帶病毒的可能，因而造成草莓果實(shí)品質(zhì)下降[5-6]。采取組織培養(yǎng)的方式培育草莓苗，更經(jīng)濟(jì)有效且能快速地繁殖大量高質(zhì)量草莓種苗，同時(shí)有利于品種資源保存[7]。經(jīng)過組織培養(yǎng)培育得到的草莓苗在田間表現(xiàn)上也比匍匐莖繁殖的種苗更好。目前，草莓組織培養(yǎng)可分為莖尖分生組織培養(yǎng)、葉片組織培養(yǎng)、花藥和花粉組織培養(yǎng)及原生質(zhì)體組織培養(yǎng)等[8]。莖尖分生組織培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)都是草莓脫毒微繁途徑，但草莓花藥愈傷分化能力較莖尖分生組織低，培育耗時(shí)更長。因此，在組織培養(yǎng)育苗上，更多采取莖尖分生組織脫毒方式進(jìn)行，組織培養(yǎng)育苗已逐漸成為生產(chǎn)草莓苗主要的來源之一[9]。

迄今為止，我國在草莓組培方面也取得了不少成果，無論是品種繁育方面還是種質(zhì)資源保存上都取得了突出進(jìn)展[8]。在草莓組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基和激素的選擇十分重要，兩者之間的合理搭配是決定組培是否成功的關(guān)鍵。值得注意的是，草莓體內(nèi)的激素含量因不同品種和不同生長階段而有所差異，因此在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)對(duì)人工添加的激素種類和濃度要求也不同。有研究者對(duì)紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)進(jìn)行了探究，但不同的研究得出的結(jié)果均不相同[10-11]。研究者在進(jìn)行草莓組織培養(yǎng)時(shí)采用的外源激素多為6-芐基嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）和萘乙酸（NAA）等[12-17]。本研究外源激素選取赤霉素（GA3）、6-糠氨基嘌呤（KT）等，探究不同外源激素的組合對(duì)紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)的初代萌發(fā)及繼代增殖情況等的影響，以期為紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

（1）試驗(yàn)材料。紅顏草莓匍匐莖莖尖采自昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院玻璃溫室大棚；MS 培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖）采購自青島海博生物科技有限責(zé)任公司；瓊脂、白糖、無水乙醇、75%酒精、0.1%升汞、氫氧化鈉、鹽酸和各種植物生長激素等由昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院組培室提供。

（2）試驗(yàn)地點(diǎn)。昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)樓組培室。

（3）儀器設(shè)備。燒杯、量筒、玻璃棒、超凈工作臺(tái)、無菌盤、鑷子、接種刀、無菌布、高壓滅菌鍋及組培玻璃瓶等。

（4）培養(yǎng)條件。光照度 2 000～2 500 lx，時(shí)間10 h/d，溫度（25±2）°C，濕度 70%～80%。此外，試驗(yàn)中如不作特殊情況說明，所有培養(yǎng)基中添加MS 4.74 g/L，糖為30.00 g/L，瓊脂為6.80 g/L，pH 值為5.8。

1.2 方法

1.2.1 外植體不同消毒處理

選取新鮮采取的紅顏草莓匍匐莖的莖尖于流水沖洗30～120 min，在超凈工作臺(tái)上，分別用75%酒精消毒不同時(shí)間，無菌水沖洗3 次，再用0.1%升汞消毒不同時(shí)間，無菌水沖洗5 次 ，2 次消毒后無菌水沖洗時(shí)間均為30～50 s，將消毒后的莖尖放于接種盤上適當(dāng)晾干水分，隨后迅速接種到培養(yǎng)基中。20 d 后觀察記錄成活、污染及褐化情況。試驗(yàn)方案如表1 所示。

表1 不同消毒時(shí)間組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.1 Experimental design scheme for different disinfection time combinations

1.2.2 初代萌芽培養(yǎng)基篩選

以MS 為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中再添加不同濃度的6-BA、NAA 和GA3植物激素進(jìn)行莖尖萌芽培養(yǎng)。將紅顏草莓匍匐莖的莖尖于流水沖洗至少30 min；在超凈工作臺(tái)上，分別用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3 次，每次30～50 s；再用0.1%升汞消毒10 min，無菌水沖洗5 次，每次沖洗30～50 s；然后將消毒后的莖尖放于接種盤上適當(dāng)晾干水分，隨后迅速接種到培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶2 根，重復(fù)3 次，共9 個(gè)處理。誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d 后，觀察統(tǒng)計(jì)莖尖萌發(fā)、褐化和污染情況。培養(yǎng)期間每天觀察莖尖生長情況，及時(shí)挑出污染苗并做好記錄。試驗(yàn)方案如表2 所示。

表2 初代萌芽培養(yǎng)基配方試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.2 Experimental design plan for formulation of primary sprouting culture medium

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)基篩選

增殖培養(yǎng)時(shí)，同樣以MS 為基本培養(yǎng)基，然后添加不同濃度的激素6-BA、KT、3-吲哚丁酸（I3BA）進(jìn)行增殖培養(yǎng)。在進(jìn)行繼代培養(yǎng)接種時(shí)，將草莓苗于超凈工作臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，盡量選取生長情況較一致的組培苗轉(zhuǎn)接入不同激素濃度的繼代培養(yǎng)基中。每處理接種10 瓶，每瓶2 根，重復(fù)3 次。培育30～45 d 后，觀察統(tǒng)計(jì)草莓苗增殖情況。培養(yǎng)期間每天觀察草莓苗生長情況，及時(shí)挑出污染苗并做好記錄。試驗(yàn)方案如表3所示。

表3 繼代增殖培養(yǎng)基配方試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.3 Experimental design plan for formulation of subculture medium

1.2.4 計(jì)算

試驗(yàn)有關(guān)數(shù)據(jù)按以下公式計(jì)算。

污染率=（污染個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100%

褐化率=（褐化個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100%

萌芽（成活）率=（萌芽個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100%

增殖系數(shù)=增殖分化總數(shù)/接入總數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件和Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、顯著性比較及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間組合對(duì)莖尖消毒效果的影響

由表4 可知，不同消毒時(shí)間組合對(duì)草莓莖尖消毒的效果不同。從成活率來看，9 個(gè)處理的成活率為33.33%～83.33%，其中T5處理與其余各處理間均存在差異且差異極顯著（P＜0.005），成活率最高為83.33%；T2處理與T6處理成活率較低，兩者成活率僅為33.33%。從污染率來看，T5處理污染率最低為6.67%，T8處理污染率最高為33.33%，剩余各處理污染率為10.00%～30.00%。從褐化率來看，T8處理與各個(gè)處理間均存在差異且差異極顯著（P＜0.005），并且T8處理沒有褐化情況出現(xiàn)，而T2褐化率最高為40.00%。

表4 不同消毒時(shí)間組合對(duì)草莓莖尖的影響Tab.4 Effect of different disinfection time on strawberry shoot-tip

綜上所述，T5處理成活率最高、污染率最低且褐化率也僅次于T8處理，所以紅顏草莓莖尖最佳的消毒時(shí)間組合即為75%酒精消毒30 s，而后再用0.1%升汞消毒10 min。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)初代萌芽效果的影響

由表5 可知，在培養(yǎng)基中不同激素濃度配比對(duì)草莓莖尖萌芽有不同的影響。S7、S8和S9處理在萌芽上與其余處理間均存在一定的差異，并且3 組處理萌芽率都高達(dá)100%；此外，S5處理萌芽率較其他處理都更低，萌芽率為63.33%，剩余處理萌芽率為70.00%～86.67%。從初代萌芽培養(yǎng)污染率方面來看，S2、S3、S4和S5處理污染率都為6.67%，其余處理沒有污染情況，總體上9 組處理污染率都較低，進(jìn)而驗(yàn)證了消毒方案的可實(shí)施性。在褐化率上，S5處理褐化率最高為30.00%，S3、S6次之，褐化率均為23.33%。

表5 不同培養(yǎng)基配方對(duì)草莓莖尖萌芽的影響Tab.5 Effects of different culture medium on shoot-tip germination of strawberry

綜上所述，S7、S8和S9處理都達(dá)到了100%的萌芽率，均無污染和褐化的情況。盡管3 組處理的莖尖全部萌芽，但從組培瓶內(nèi)植株的生長狀況、長勢大小，以及葉片顏色和數(shù)量等來看，S8處理較S7、S9處理更好，如圖1 所示。因此，紅顏草莓莖尖萌芽最適激素濃度配比為1.00 mg/L 6-BA、0.20 mg/L NAA，同時(shí)還可發(fā)現(xiàn)GA3有促進(jìn)莖伸長的作用，這與于亞軍等[18]的研究結(jié)果也相一致，另外，在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了GA3有利于草莓莖尖再生成匍匐莖。

圖1 紅顏草莓莖尖萌發(fā)Fig.1 Shoot tip germination of 'Hongyan' strawberry

2.3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)繼代增殖效果的影響

紅顏草莓初代萌芽培養(yǎng)基選定后，將草莓進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代增殖結(jié)果如表6 所示。在增殖培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，9 個(gè)處理中，J2、J3、J4和J8處理增殖系數(shù)偏低未達(dá)到2.00 以上，其余處理增殖系數(shù)均超過2.00。增殖系數(shù)最高的是J1處理，為3.00，在該處理下草莓苗生長較快且生長狀況良好，增殖的叢芽也較多；其次為J6處理，雖叢芽生長數(shù)量不及J1處理，但其芽苗生長質(zhì)量較好且增殖系數(shù)也達(dá)到了2.60；增殖效果最差的是J2處理，增殖系數(shù)僅為1.27。

表6 不同培養(yǎng)基配方對(duì)草莓繼代增殖的影響Tab.6 Effects of different culture medium on subculture of strawberry

綜上所述，紅顏草莓繼代增殖的最佳培養(yǎng)基為J1處理：MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT+30.00 g/L糖+6.80 g/L 瓊脂，且pH 值調(diào)至5.8。

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中，激素起到了非常重要的作用，并且不同植物或不同培養(yǎng)階段所需求的激素種類和濃度也是不同的[19-20]。在草莓組織培養(yǎng)中，因草莓莖尖組織培養(yǎng)可省去愈傷組織誘導(dǎo)這一步驟，因而更為廣泛地作為外植體進(jìn)行快繁。采用紅顏草莓的匍匐莖莖尖作為外植體，得出了以下結(jié)果：紅顏草莓莖尖最佳的消毒方案為75%乙醇消毒30 s，然后再用0.1%升汞消毒10 min，污染率相對(duì)較低為6.67%；較適宜的初代萌芽培養(yǎng)基配方為1.00 mg/L 6-BA、0.20 mg/L NAA，這與李曉青等[20]的研究結(jié)果相似，萌芽率比其高近16.70%；較優(yōu)選的繼代增殖培養(yǎng)基配方為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT，增值系數(shù)為3.0。研究結(jié)果還表明，草莓組織培養(yǎng)中不同的生長階段所需的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和濃度是不一樣的，這與張黎鳳等[15]、于超等[19]、陳英等[21]的研究結(jié)果相一致。

在消毒部分試驗(yàn)時(shí)，T8污染率遠(yuǎn)高于T5，究其原因可能為接種過程中操作不當(dāng)導(dǎo)致，因此在后續(xù)試驗(yàn)過程需注意這一問題。除此之外，在紅顏草莓增殖培養(yǎng)中，增殖情況與一些研究有一定的差異[22-24]。其中，薛其勤等[24]研究指出，紅顏草莓增殖階段采用0.80 mg/L 6-BA、0.50 mg/L NAA 的激素搭配方式增殖系數(shù)高于許多研究，也與本研究差異較大。導(dǎo)致差異較大的原因可能有培養(yǎng)基內(nèi)接種草莓苗數(shù)量不同，激素濃度及種類選擇的差異，草莓生長環(huán)境及季節(jié)不同而導(dǎo)致的差異，操作過程中由于操作不當(dāng)使得培養(yǎng)基污染，同時(shí)還有部分草莓苗因褐化而沒有增殖等。由此可見，不論是對(duì)于草莓組培生長發(fā)育過程來說還是對(duì)于其余各類果樹花卉而言，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)間濃度的選擇與搭配是至關(guān)重要的，同時(shí)植物激素的濃度還會(huì)因樹種、品種、培養(yǎng)部位等的不同而有一定的差異與變化。因此，在植物組織培養(yǎng)中，從組培苗的各個(gè)生長階段角度來看，對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度進(jìn)行篩選依舊是今后組培工作中的重點(diǎn)與難點(diǎn)[18]。除此以外，研究僅針對(duì)紅顏草莓消毒、萌芽及增殖方面進(jìn)行了試驗(yàn)，雖對(duì)于組培工作有一定的參考意義，但對(duì)草莓苗在基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇及褐化等方面的研究還有所缺乏，所以此方面工作也可成為后續(xù)工作的一個(gè)研究方向。