楊三菊,劉運(yùn)廣

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,廣西 百色 533000)

原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是兒童時(shí)期最常見的慢性腎臟疾病,在亞洲地區(qū)年發(fā)病率高達(dá)每10萬人6.4～7.14例之間[1-2]。PNS患兒中約85%～90%對(duì)類固醇治療反應(yīng)敏感,即為激素敏感型腎病綜合征(steroid sentitive nephrotic syndrome,SSNS),在長(zhǎng)期使用激素后常出現(xiàn)生長(zhǎng)不良、肥胖和骨質(zhì)疏松等,嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量[3]。其余10%～15%患兒則對(duì)類固醇治療表現(xiàn)耐藥反應(yīng),即為激素耐藥型腎病綜合征(steroid resistant nephrotic syndrome,SRNS),這部分患兒病情常遷延不愈,在10年內(nèi)有近50%的患者最終進(jìn)展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)[3-4]。因此,PNS一直是臨床工作和研究的熱點(diǎn)問題。隨著遺傳學(xué)和基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,60多個(gè)與PNS疾病相關(guān)的單基因被報(bào)道,磷脂酶CE1(phospholipase CE1,PLCE1)基因是其中之一[4-5]。PLCE1基因編碼信號(hào)系統(tǒng),其編碼的蛋白是各種G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)蛋白,參與腎小球足細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),對(duì)維持腎小球正常發(fā)育起重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[6],PLCE1基因移碼或無義突變使腎小球在S階段發(fā)育停滯,導(dǎo)致早發(fā)型腎病綜合征。另外研究者發(fā)現(xiàn)PLCE1突變也是孤立性彌漫性系膜硬化(isolated diffuse mesenteric sclerosis,IDMS)主要原因,有超過28%～33%的家庭受到影響[7]。而關(guān)于PLCε1蛋白及其單個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與PNS關(guān)系的分析少見報(bào)道。因此,本次研究運(yùn)用FastTarget聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PLCE1基因Arg548Leu位點(diǎn)多態(tài)性,同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中磷脂酶Cε1(PhospholipaseCε1,PLCε1)蛋白的水平,分析Arg548Leu位點(diǎn)及PLCε1蛋白水平與PNS的關(guān)系,從分子水平為PNS的預(yù)后及防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1臨床資料 收集2020年10月至2022年5月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的廣西壯族兒童255例,其中PNS患兒155例,男90例,女65例,平均年齡為(8.05±0.05)歲。均符合PNS診斷標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)對(duì)激素治療反應(yīng)情況,分為SSNS和SRNS[8],SSNS 95例,男72例,女23例,平均年齡為(8.05±0.07)歲,SRNS 60例,男45例,女15例,平均年齡為(8.05±0.09)歲。該院同期健康體檢的壯族兒童100例,男66例,女34例,平均年齡為(8.06±0.07)歲。性別、年齡因素在各比較組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①PNS的診斷標(biāo)準(zhǔn)及類固醇激素治療反應(yīng)分型參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病組學(xué)制定的兒童激素敏感、復(fù)發(fā)/依賴腎病綜合征診治循證指南[8];②各組研究對(duì)象均為家族中無腎臟疾病且相互之間沒有血緣關(guān)系的壯族人群。排除標(biāo)準(zhǔn):①排除合并感染的PNS患兒;②排除Alport綜合征患者;③排除繼發(fā)性腎病:過敏性紫癜腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎、乙肝病毒感染腎炎、先天性巨細(xì)胞感染腎炎、糖尿病腎病等。本研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人已知情,并已簽署知情同意書。本研究已取得研究單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1采集血液標(biāo)本 所有研究者空腹時(shí)取2 mL靜脈血放入EDTA管,去除紅細(xì)胞后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2提取DNA 該實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照德國(guó)Qiagen公司DNeasyBlood&TissueKit試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟提取DNA。并測(cè)量DNA純度(OD260/280比值)

1.2.3引物設(shè)計(jì) 以人類標(biāo)準(zhǔn)基因組為模板,委托上海昊天生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成Arg548Leu位點(diǎn)的引物,序列見表1。

表1 PLCE1基因Arg548Leu位點(diǎn)引物序列

1.2.4QPCR反應(yīng) QPCR反應(yīng)體系(20 μL):包括SYBR premix 10 μL,PrimerF 0.4 μL,PrimerR 0.4 μL,DyeII(50x)0.4 μL,DNA 2 μL,DEPC水6.8 μL。QPCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,95 ℃延伸1 min,循環(huán)40次,最后95 ℃延伸30 s。

1.2.5FastTarget目標(biāo)區(qū)域測(cè)序 通過擴(kuò)增產(chǎn)物建立FastTarget測(cè)序文庫,并經(jīng)Agilent2100Bioanalyzer驗(yàn)證。最后通過IlluminaHiseq/Miseq平臺(tái)對(duì)PLCE1基因27號(hào)外顯子進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.6ELISA測(cè)定PLCε1血清蛋白水平 本實(shí)驗(yàn)使用PLCε1酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行,并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)健康對(duì)照樣本采用Hardy-Weinberg平衡分析,評(píng)估健康對(duì)照組樣本是否具有群體代表性。對(duì)PNS、健康對(duì)照組、SSNS及SRNS組的基因型和等位基因頻率采用計(jì)數(shù)法。計(jì)量資料符合正態(tài)性、方差齊性條件采用t檢驗(yàn),不符合t檢驗(yàn)要求的計(jì)量資料則采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料則用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析 對(duì)健康對(duì)照組中PLCE1基因Arg548Leu位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析,Arg548Leu位點(diǎn)的基因型頻數(shù)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),對(duì)照組樣本具有群體代表性。見表2。

表2 健康對(duì)照組中Arg548Leu位點(diǎn)基因型頻數(shù)Hardy-Weinberg平衡分析

2.2PLCE1基因Arg548Leu位點(diǎn)分析 PLCE1基因Arg548Leu位點(diǎn)基因型(GG、GT、TT)及等位基因(G、T)在PNS組和健康對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。該位點(diǎn)基因型(GG、CT)及等位基因(G、T)在SRNS及SSNS兩組間分布差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。

表3 PNS組與健康對(duì)照組Arg548Leu基因型及等位基因型比較

表4 SSNS與SRNS Arg548Leu基因型及等位基因型比較

2.3PLCε1血清蛋白水平比較 PNS組血清PLCε1蛋白水平低于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);SRNS組血清PLCε1蛋白水平低于SSNS組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037),見表5。

表5 各組間PLCε1血清蛋白濃度水平差異比較

3 討論

PNS是腎小球?yàn)V過屏障被破壞導(dǎo)致大量血漿蛋白從尿液中丟失的一組臨床綜合征,常呈慢性病程,部分耐藥者,預(yù)后不良,易進(jìn)展為ESRD,威脅患者生命健康。隨著基因檢測(cè)技術(shù)在臨床中的廣泛應(yīng)用,基因多態(tài)性位點(diǎn)分析在指導(dǎo)PNS患者個(gè)體化治療、延緩和延遲ESRD進(jìn)展及遺傳咨詢方面日益重要[9]。本團(tuán)隊(duì)通過研究廣西壯族壯族兒童PNS與PLCε1蛋白及Arg548Leu位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系,為PNS疾病精準(zhǔn)治療、早期診斷以及預(yù)后評(píng)估提供一定數(shù)據(jù)。

PLCE1基因是定位于人染色體10q23.33上,長(zhǎng)為334.3 kb的單拷貝基因,含有34個(gè)外顯子。其編碼的PLCε1蛋白在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中的秀麗隱桿蟲中第一次被發(fā)現(xiàn),隨后KELLEY G G等[10]證實(shí)該蛋白屬于磷脂酶家族C(PLC)的新成員,并首次為其命名。PLCε1作為PLC家族的一種同工酶,除包含XY、PH、C2及EF 4個(gè)家族成員所共有的保守結(jié)構(gòu)域,還具有獨(dú)特的RasGEF_CDC25和RA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。RasGEF_CDC25結(jié)構(gòu)域位于PLCε1氨基酸末端,是GTP交換因子區(qū)域,可增加GDP和Rapl的釋放,該結(jié)構(gòu)還具有鳥嘌呤核苷酸交換活性(GEF),從而激活Ras/MAPK信號(hào)通路和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶(ERK)途徑[11];RA結(jié)構(gòu)域是2個(gè)C端Ras綁定區(qū),與Ras結(jié)合,參與PLCε1的激活。依據(jù)PLCE1與腎病綜合征相關(guān)研究報(bào)道[12],認(rèn)為PLCE1是腎病綜合征的重要候選基因。Hildebrandt團(tuán)隊(duì)在1 783個(gè)家庭組成的國(guó)際隊(duì)列中,發(fā)現(xiàn)PLCE1突變是導(dǎo)致家族性SRNS的第4大最常見原因[13-14]。BOYER O等[15]對(duì)來自68個(gè)家族的139位SRNS患者進(jìn)行突變分析,發(fā)現(xiàn)PLCE1突變個(gè)體出現(xiàn)早發(fā)性腎病綜合征,發(fā)病年齡在3個(gè)月到6歲不等,且在7歲前進(jìn)展為ESKD,其主要病理類型是彌漫性腎小球硬化(DMS),但在局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)中的比例也不可忽視。HASHMI J A等[16]也通過一個(gè)沙特近親家庭證實(shí)了PLCE1突變?cè)诩易逍許RNS中呈常染色體隱性遺傳模式,在該家族SRNS病例中發(fā)現(xiàn)了PLCE1新的純合子插入突變(C.6272_6273insT),突變后蛋白質(zhì)從2090Met_2091GlnPheSer位置移碼,導(dǎo)致了PLCE1缺乏完整的RA結(jié)構(gòu)域,這可能是導(dǎo)致腎病綜合征的原因。另外張研等[17]也在廣西壯族PNS患兒檢測(cè)出了5種PLCE1的突變(c.578T>C、c.670C>T、c.923G>T、c.4916C>T、c.5927_5929del),c.578T>C、c.670C>T、c.923G>T三位點(diǎn)引起改變的氨基酸靠近RasGEF_CDC25結(jié)構(gòu)域,c.4916C>T引起改變的氨基酸位于XY結(jié)構(gòu)域中,c.5927_5929del引起改變的氨基酸位于位于C2和RA結(jié)構(gòu)域之間,5個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致PNS可能與PLCE1復(fù)雜結(jié)構(gòu)域相關(guān)。因此,本研究選取了位于RasGEF_CDC25結(jié)構(gòu)域中的Arg548Leu多態(tài)性位點(diǎn),并分析該多態(tài)性位點(diǎn)與廣西壯族兒童PNS發(fā)生及治療的相關(guān)性。

THI KIM LIEN N等[18]分別在2名先天性腎病綜合征(CNS)患兒中檢測(cè)到PLCE1基因p.Arg548Leu(c.1643G>T)位點(diǎn)雜合突變及純合突變,純合突變患兒出現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床表型。另外MACHUCA E等[19]也在CNS患兒中檢測(cè)到了常見的多態(tài)性(p.Arg548Leu)。PLCE1基因Arg548Leu多態(tài)性位點(diǎn)位于RasGEF_CDC25結(jié)構(gòu)域,可能通過以下途徑導(dǎo)致影響PNS的發(fā)生及發(fā)展:①RasGEF_CDC25結(jié)構(gòu)域可增加GDP核Rapl的釋放率,Rapl有GEF活性,有助于GDP和GTP相互轉(zhuǎn)換,從而活化Ras和Rho等一類小G蛋白;②RasGEF_CDC25結(jié)構(gòu)域通過鳥苷酸交換因子改變Ras家族分子結(jié)構(gòu)從而激活Ras/MAPK信號(hào)通路。Arg548Leu多態(tài)性位點(diǎn)中精氨酸(Arg)帶正電荷,亮氨酸(Leu)不帶電荷[20]。特定區(qū)域氨基酸電荷的改變可引起特定區(qū)域PLCε1蛋白三維構(gòu)象的改變,因此Arg548Leu可能通過引起RasGEF_CDC25區(qū)域三維構(gòu)象的改變,從而影響足細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本研究中,PLCE1基因Arg548Leu位點(diǎn)多態(tài)性可能與廣西壯族PNS及其治療無關(guān),與上述文獻(xiàn)報(bào)道不符,這可能與不同的種族、地域及樣本量有關(guān);另外樣本雖均來自廣西壯族,但隨著時(shí)代的變遷,廣西壯族生活習(xí)性及飲食習(xí)慣不斷改變,也可能影響基因位點(diǎn)多態(tài)性與疾病的關(guān)系。

目前關(guān)于PLCε1蛋白與PNS及其治療的關(guān)系少見報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn)PNS組PLCε1蛋白水平顯著低于健康對(duì)照,同時(shí)在SRNS組的蛋白水平也是顯著低于SSNS組。所以,PLCε1蛋白可能是廣西壯族PNS的一種保護(hù)性蛋白,并可能對(duì)PNS的治療有影響,這與張研等[16]的研究結(jié)果相一致。但血清中PLCε1蛋白水平容易受到藥物、感染等多種因素影響,導(dǎo)致最終結(jié)果可能出現(xiàn)誤差。本研究的不足之處是未能進(jìn)一步將感染等因素納入考慮,下分感染組及非感染組等亞層開展研究,因此必要時(shí)將PNS組與健康組和SSNS組和SRNS組中分別將感染等因素納入下分亞層,從而排除感染等因素對(duì)研究的影響。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PLCε1蛋白可能是廣西壯族PNS的一種保護(hù)性蛋白,并可能對(duì)PNS的激素治療有影響,這在臨床上可有利于廣西壯族兒童PNS治療及預(yù)后判斷。本研究未發(fā)現(xiàn)Arg548Leu多態(tài)性位點(diǎn)與廣西壯族PNS及其治療有關(guān),但關(guān)于PLCE1基因位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族兒童PNS相關(guān)性需更深入研究,可以繼續(xù)擴(kuò)大樣本量,多地區(qū)、多民族比較,多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)聯(lián)合分析等研究,為揭示PNS的發(fā)病機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。