唐薇,凌賽泳,向澎,胡玉琳,路雪妍,林世童,劉津

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童保健康復(fù)科,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,廣西 百色 533000)

耳鳴是指患者在無(wú)外界聲學(xué)刺激的前提下,在耳內(nèi)或者顱內(nèi)感受的異常聲音。據(jù)研究表明,全球有7.4億成年人被耳鳴影響,且患病率隨年齡增加正逐年上升[1]。耳鳴患者伴或者不伴聽(tīng)力下降,注意力不集中等不良心理反應(yīng),并存在明顯睡眠障礙,同時(shí)增加對(duì)壓力源的敏感度,從而對(duì)個(gè)人生活和情緒造成嚴(yán)重影響[2]。耳鳴發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,雖有眾多學(xué)說(shuō),可目前尚未被完全定論,因而治療效果往往不盡如人意。

近年來(lái)通過(guò)水楊酸等藥物誘導(dǎo)結(jié)合“飲水抑制”等行為學(xué)檢測(cè)方法構(gòu)建的耳鳴動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用,雖有利于開(kāi)展耳鳴致病機(jī)制研究,但結(jié)合臨床患者就診原因分析,暫未發(fā)現(xiàn)經(jīng)由水楊酸等藥物導(dǎo)致的耳鳴癥狀[3],并且“飲水抑制”這類(lèi)行為學(xué)方法用以判斷耳鳴行為過(guò)于主觀且成本高、效率低、缺乏敏感性[4]。而噪聲已然是世界公認(rèn)七大危害之一,可對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)、大腦邊緣系統(tǒng)等多系統(tǒng)造成損傷,進(jìn)而影響聽(tīng)覺(jué)、記憶等多方面能力[5],因此從實(shí)踐角度出發(fā),噪聲誘導(dǎo)耳鳴動(dòng)物模型更具有臨床探究意義,再結(jié)合聽(tīng)覺(jué)驚跳反射間隔前刺激抑制實(shí)驗(yàn)(gap prepulse inhibition of acoustic startle,GPIAS)這一無(wú)損害的檢測(cè)方法,可更客觀、靈敏反應(yīng)動(dòng)物是否存在耳鳴行為。

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein,GAP-43)作為一種與神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性等高度相關(guān)的特異性蛋白,主要分布于大小腦、脊髓等自主神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi),可認(rèn)為是研究神經(jīng)可塑性變化的重要標(biāo)志物之一[6]。部分結(jié)果表明聽(tīng)覺(jué)中樞功能重塑化與耳鳴的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)[7],而聽(tīng)皮層作為聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵部分,其產(chǎn)生的變化對(duì)于中樞機(jī)制的探究至關(guān)重要。但目前在噪音誘導(dǎo)的耳鳴動(dòng)物模型中,對(duì)聽(tīng)皮層內(nèi)GAP-43表達(dá)變化的報(bào)道仍然較少,因此為進(jìn)一步探究耳鳴時(shí)中樞的病理生理變化,噪音暴露后聽(tīng)皮層是否產(chǎn)生功能重塑化的改變進(jìn)行觀察,并探究相關(guān)臨床意義。

本研究通過(guò)不同強(qiáng)度寬頻帶白噪聲誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生耳鳴,并結(jié)合GPIAS實(shí)驗(yàn)判斷動(dòng)物是否出現(xiàn)耳鳴行為,同時(shí)觀察聽(tīng)皮層內(nèi)GAP-43的表達(dá)變化,一方面可分析比較得出優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的耳鳴動(dòng)物模型,另一方面可進(jìn)一步驗(yàn)證聽(tīng)覺(jué)中樞功能重塑化與耳鳴發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 54只SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠,年齡為6～8周。體重約18～20 g。排除中耳及內(nèi)耳疾病后納為本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象,動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)為:SCXK(粵)2022-0063。本實(shí)驗(yàn)由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)開(kāi)展。

1.1.2試劑與儀器 驚跳反射實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(Med Associates),聲級(jí)計(jì)(北京聲望聲電技術(shù)有限公司),信號(hào)發(fā)生器(北京聲望聲電技術(shù)有限公司),音響(HARMAN International)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將54只C57小鼠從1～54編號(hào),從隨機(jī)數(shù)字表中任一行任一列開(kāi)始,依次讀取3位數(shù)作為隨機(jī)數(shù)錄于編號(hào)下,再將全部隨機(jī)數(shù)從小到大進(jìn)行排序號(hào),規(guī)定序號(hào)1～18號(hào)為對(duì)照組(未噪音暴露,Control),19～36號(hào)為BBN-90dB 組、37～54號(hào)為BBN-100dB 組, 每組各18只小鼠。三組小鼠使用不同強(qiáng)度寬頻帶白噪聲進(jìn)行噪聲暴露后于暴露后3 d(P3組)、7 d(P7組)、14 d(P14組)的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別進(jìn)行GPIAS檢測(cè),每組6只小鼠 ,如圖1所示。

圖1 動(dòng)物分組情況

1.2.2噪音暴露 首先將BBN-90dB組中C57小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)隔音室內(nèi)采用90dB SPL的寬頻帶白噪聲(broad-band white noise,BBN)進(jìn)行噪聲單次暴露2 h,在暴露時(shí)將C57小鼠分別單只放置在一個(gè)由4.5 cm×4.5 cm×8 cm大小制成的鐵絲籠內(nèi),該籠可在不影響聲音傳播的基礎(chǔ)上使小鼠保有一定程度的自由活動(dòng),以避免暴露期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相互影響入耳聲強(qiáng),同時(shí)防止小鼠相互的撕咬。音響置于籠子的前方,噪聲暴露前使用已通過(guò)廣西壯族自治區(qū)計(jì)量檢測(cè)研究院校準(zhǔn)和檢測(cè)合格的聲級(jí)計(jì)對(duì)暴露的聲音強(qiáng)度進(jìn)行校準(zhǔn),校準(zhǔn)時(shí)聲級(jí)計(jì)的探頭須在籠子周邊各處進(jìn)行測(cè)量,以便確認(rèn)達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的聲強(qiáng)。然后將BBN-100dB組的C57小鼠使用同樣的方式以100dB SPL的寬頻帶白噪聲進(jìn)行單次噪聲暴露2 h,最后將對(duì)照組中C57小鼠同樣單只置于自制籠內(nèi)于標(biāo)準(zhǔn)隔音室放置2 h,在此過(guò)程中音響處于關(guān)閉狀態(tài),暴露結(jié)束后將所有小鼠送至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)至各時(shí)間節(jié)點(diǎn)后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3耳鳴行為學(xué)檢測(cè) 通過(guò)以GPIAS實(shí)驗(yàn)對(duì)本次實(shí)驗(yàn)中的小鼠進(jìn)行耳鳴行為學(xué)檢測(cè)。該檢測(cè)在標(biāo)準(zhǔn)隔音室內(nèi)的一個(gè)隔音箱內(nèi)進(jìn)行,首先在檢測(cè)時(shí)將小鼠單只置于一個(gè)有多個(gè)孔洞的樹(shù)脂玻璃動(dòng)物固定裝置內(nèi)限制其活動(dòng)。在檢測(cè)開(kāi)始前小鼠在黑暗無(wú)聲環(huán)境下于動(dòng)物固定裝置里適應(yīng)約5 min,隨后開(kāi)始正式檢測(cè)。該設(shè)備可通過(guò)固定裝置下方靈敏的壓電傳感器,如圖2A所示,將小鼠在檢測(cè)時(shí)受到驚跳反射刺激后的肌肉動(dòng)作幅度轉(zhuǎn)化成為相應(yīng)的波形并自動(dòng)計(jì)算出波幅。GPIAS實(shí)驗(yàn)由30個(gè)有前間隔刺激實(shí)驗(yàn)(gap)和30個(gè)無(wú)前間隔刺激(nogap)實(shí)驗(yàn)組成,兩者被隨機(jī)引入,如圖2B所示。耳鳴的行為學(xué)檢測(cè)以GPIAS抑制率作為檢測(cè)指標(biāo),即GPIAS抑制率(GPIAS%)=(AvgTnogap-AvgTgap)/AvgTnogap×100%。其中AvgTnogap為無(wú)前間隔刺激時(shí)誘發(fā)的驚跳反射波幅,AvgTgap為有前間隔刺激時(shí)誘發(fā)的驚跳反射波幅。

注:A.驚跳反射系統(tǒng)儀器;B.GPIAS實(shí)驗(yàn)具體過(guò)程。

1.2.4Western Blot 在耳鳴行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,按照分組的時(shí)間節(jié)點(diǎn),分離小鼠聽(tīng)皮層組織,放置于凍存管中,用液氮急速冷凍,隨后用研缽磨碎聽(tīng)皮層組織,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,BCA法測(cè)定總蛋白濃度,隨后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離分子量不同的蛋白,再轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用快速封閉液封閉,4 ℃件下一抗孵育過(guò)夜,之后用TBST洗膜3遍,再在室溫條件下孵育二抗1 h,最后用TBST洗膜3遍,采用ECL法發(fā)光顯影,保存圖片后再用ImageJ軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1耳鳴行為學(xué)檢測(cè) 與對(duì)照組相比,在90dB SPL寬頻帶白噪聲的條件下,C57小鼠的GPIAS%值在噪聲暴露后3 d、7 d、14 d均降低(P<0.05)。但100dB SPL寬頻帶白噪聲使C57小鼠的GPIAS%值較前者下降更為顯著(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠噪聲暴露2 h后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)中GPIAS%值

2.2各組GAP-43蛋白表達(dá)比較結(jié)果 在噪音暴露后3 d,與對(duì)照組相比,BBN-90dB組和BBN-100dB組的GAP-43表達(dá)都有升高趨勢(shì),且差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而在噪音暴露后7 d,與對(duì)照組相比, BBN-100dB組GAP-43表達(dá)明顯升高且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但BBN-90dB組GAP-43表達(dá)差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在噪音暴露后14 d,BBN-100dB GAP-43表達(dá)較對(duì)照組升高且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而B(niǎo)BN-90dB組GAP-43表達(dá)與對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和圖3。

表2 各組小鼠聽(tīng)皮層中GAP-43表達(dá)水平對(duì)比

注:1.對(duì)照組;2.BBN-90dB組;3.BBN-100dB組。

3 討論

耳鳴是一種多種因素共同作用的常見(jiàn)疾病,其治療效果常面臨著“高患病率、低治愈率”的局面,這對(duì)于患者的心理健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。如今噪聲已然是青少年和大學(xué)生群體出現(xiàn)耳鳴癥狀的常見(jiàn)誘發(fā)因素[8],在多種噪聲類(lèi)型中,于現(xiàn)實(shí)生活中更常接觸寬頻白噪聲,同時(shí)這類(lèi)噪聲可將所有頻率以相同能量較為均勻的進(jìn)行播放,而非將能量多集中于部分頻率里,所以利用此類(lèi)噪聲誘導(dǎo)的耳鳴動(dòng)物模型更能有效模擬人類(lèi)耳鳴發(fā)生情況,更具有臨床實(shí)踐意義。再結(jié)合GPIAS檢測(cè)方式,通過(guò)動(dòng)物的防御性反射,可有效降低訓(xùn)練動(dòng)物形成條件反射的時(shí)間成本,同時(shí)對(duì)動(dòng)物本身并無(wú)刺激、損害,能相對(duì)可靠地反應(yīng)動(dòng)物是否出現(xiàn)耳鳴行為[9]。

在本次實(shí)驗(yàn)中,90dB SPL白噪聲環(huán)境中單次暴露2 h后,發(fā)現(xiàn)小鼠雖在暴露后多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)中GPIAS%抑制率呈下降趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示造模成功,但是在暴露后14 d其耳鳴行為進(jìn)一步穩(wěn)定出現(xiàn)。而在100dB SPL白噪聲環(huán)境中,小鼠從噪聲暴露后3 d至觀察結(jié)束時(shí),都表現(xiàn)出持久、有效的耳鳴行為。這表明一方面適度噪聲可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生耳鳴行為,另一方面聲音通過(guò)振動(dòng)內(nèi)耳淋巴液使毛細(xì)胞纖毛束來(lái)回?cái)[動(dòng),從而開(kāi)放機(jī)械電通道,將聲音機(jī)械能轉(zhuǎn)化成電信號(hào),最終將信號(hào)上傳至聽(tīng)覺(jué)中樞。但這類(lèi)毛細(xì)胞由于具有機(jī)械敏感性,易被響亮聲音破壞,從而導(dǎo)致外周輸入信號(hào)減弱,聽(tīng)覺(jué)中樞神經(jīng)元發(fā)生可塑性變化,促進(jìn)耳鳴發(fā)生發(fā)展。100dB SPL寬頻噪聲在傳導(dǎo)過(guò)程中,對(duì)毛細(xì)胞和聽(tīng)覺(jué)中樞改變更為明顯,誘發(fā)的耳鳴行為也更為顯著,因此GPIAS%抑制率下降明顯,從造模角度而言這有效證明這類(lèi)噪聲更利于構(gòu)建穩(wěn)定、便捷的耳鳴動(dòng)物模型,并且更能有效平衡時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本之間的關(guān)系。同時(shí)如竇玉玉等[10]研究類(lèi)似, 采用以小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察的方法,可以全面反映動(dòng)物耳鳴行為的變化過(guò)程,探索出動(dòng)物表現(xiàn)穩(wěn)定耳鳴行為的最佳條件。

目前耳鳴的機(jī)制尚未定論,聽(tīng)皮層作為聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中最高級(jí)中樞,其在噪聲暴露后的改變對(duì)耳鳴發(fā)生發(fā)展極為重要。在部分耳鳴患者的靜息態(tài)功能磁共振檢查結(jié)果中發(fā)現(xiàn),位于顳中回的聽(tīng)皮層,其局部一致性和分?jǐn)?shù)低頻波動(dòng)振幅值同時(shí)增加,且局部一致性值與耳鳴致殘量表評(píng)分正相關(guān)[11],提示患者的聽(tīng)覺(jué)相關(guān)皮層可能發(fā)生局部神經(jīng)功能改變。

GAP-43是一種與神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、軸突再生、突觸可塑性密切相關(guān)的胞膜磷酸化蛋白,當(dāng)神經(jīng)損傷或軸突再生時(shí),該蛋白表達(dá)隨著神經(jīng)元突起生長(zhǎng)而增加,并會(huì)通過(guò)軸突運(yùn)輸移動(dòng)到軸突再生處的邊緣,并最終集中在軸突生長(zhǎng)錐[12]。所以,GAP-43常被用來(lái)作為軸突再生、突觸可塑性情況的標(biāo)記。本次研究結(jié)果顯示,在噪聲暴露后小鼠聽(tīng)皮層中,GAP-43表達(dá)整體呈升高趨勢(shì),且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與GPIAS%抑制率變化相同。說(shuō)明噪聲誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)耳鳴行為時(shí),其聽(tīng)皮層內(nèi)的神經(jīng)元受到損傷,使GAP-43合成增加,促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)。同時(shí)不同強(qiáng)度噪聲導(dǎo)致聽(tīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元損傷程度不一致,在噪聲誘導(dǎo)7 d后,BBN-90dB組中GAP-43表達(dá)較同期對(duì)照組增加僅為23.00%,BBN-100dB組則增加至45.10%,在其他時(shí)間點(diǎn)中也觀察到這類(lèi)趨勢(shì),提示相對(duì)較強(qiáng)的噪聲對(duì)聽(tīng)皮層造成的損傷更為嚴(yán)重,使GAP-43合成更多,神經(jīng)元修復(fù)和軸突再生更為顯著。但隨著時(shí)間的推移,GAP-43表達(dá)逐漸下降。在BBN-90dB組中,噪聲誘導(dǎo)3 d后,GAP-43表達(dá)升高,為同期對(duì)照組的1.24倍,但14 d后,GAP-43表達(dá)僅為3 d時(shí)的85.80%,BBN-100dB組中同樣觀察到此類(lèi)變化,提示GAP-43作為參與聽(tīng)覺(jué)中樞重建的重要因子,一旦重建完成,GAP-43表達(dá)逐漸減少。由此推測(cè),當(dāng)噪聲影響后,聽(tīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元受損,使GAP-43受到刺激大量表達(dá),從而使受損神經(jīng)元發(fā)生軸突再生及突觸大量生長(zhǎng),最終導(dǎo)致聽(tīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元產(chǎn)生新的連接和突觸效率的變化,促進(jìn)耳鳴的病理生理過(guò)程。

綜上所述,100dB SPL噪聲作為誘導(dǎo)因素可有效、快捷構(gòu)建穩(wěn)定的耳鳴動(dòng)物模型,為耳鳴發(fā)病機(jī)制等研究貢獻(xiàn)良好的模型基礎(chǔ)。GAP-43與聽(tīng)皮層的突觸可塑性高度相關(guān),在噪聲干預(yù)兩組中GAP-43表達(dá)升高,與小鼠出現(xiàn)耳鳴行為一致,這說(shuō)明聽(tīng)覺(jué)中樞重塑化改變可能參與耳鳴的發(fā)生發(fā)展,為進(jìn)一步探索藥物阻斷、保護(hù)新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。