王逢博，高登科＊，李 超，李 丹，劉 薇，張海森，楊王浩，靳亞平，陳華濤*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

【研究意義】RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding Proteins，RBPs）是一類存在于細(xì)胞中與mRNA 有高度親和性的蛋白質(zhì)，包含2 000種以上的蛋白質(zhì)，是RNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程的關(guān)鍵參與者。其RNA 結(jié)合域結(jié)構(gòu)的靈活性以及功能的多樣性，使RBPs 能夠調(diào)控大量轉(zhuǎn)錄本的代謝過程[1-2]。Quaking（QKI）是一類重要的RBP，通過QKI反應(yīng)元件（quaking response element，QRE）與RNA特異性結(jié)合，可以調(diào)控細(xì)胞分化[3-4]、細(xì)胞凋亡[5]、細(xì)胞周期、膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)和發(fā)育[6-7]等細(xì)胞生物過程。研究發(fā)現(xiàn)QKI 能夠抑制豬睪丸支持細(xì)胞凋亡，且可以促進(jìn)未成熟的豬睪丸支持細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-1 等分泌因子的分泌以及細(xì)胞增殖[8-9]。此外，QKI基因在山羊骨骼肌組織中高表達(dá)，且在山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的過程中表現(xiàn)出持續(xù)上升的表達(dá)規(guī)律，提示QKI 在山羊的骨骼肌發(fā)育的過程中可能也發(fā)揮一定作用[10]。近年來，許多研究證據(jù)表明Qki-5 轉(zhuǎn)錄本與前列腺癌[11]、肺癌[12-13]、卵巢癌[14]以及乳腺癌[15]等多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。但是，對(duì)于QKI-5的其他功能以及在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的影響作用鮮有報(bào)道。因此，預(yù)測(cè)QKI-5未知功能并研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】RBPs可通過直接或間接與mRNA 上的作用元件結(jié)合，在RNA 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[16-17]，參與調(diào)控RNA 加工過程的各個(gè)方面，在調(diào)控RNA 編輯、代謝、剪接、定位和翻譯等過程中發(fā)揮著重要作用[18-20]。研究證據(jù)表明，RBPs 表達(dá)改變和功能異常會(huì)影響RNA 表達(dá)的多個(gè)生理過程，進(jìn)而引起免疫性疾病[21]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[22]、心臟疾病[23-24]、急性白血病[25]以及結(jié)直腸癌[26-27]等多種疾病的發(fā)生。RNA 結(jié)合蛋白QKI 是STAR（signal transduction and activation of RNA）蛋白家族的一員，Qki基因位于人類第6 號(hào)染色體和小鼠第17 號(hào)染色體上，在KH 結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有一個(gè)RNA 結(jié)合基序，其兩側(cè)有兩個(gè)QUA 結(jié)構(gòu)域（QUA1 和QUA2）[28]。QKI 選擇性剪切生成5，6，7 kb大小的轉(zhuǎn)錄本，分別編碼QKI-5、QKI-6、QKI-7蛋白。其中，QKI-5在基因序列上有一段非經(jīng)典的核定位信號(hào)肽，因此其主要位于細(xì)胞核中，但在胞漿中也能檢測(cè)到QKI-5，其可以發(fā)揮將胞漿信號(hào)輸送到胞核的功能[29]，而QKI-6、QKI-7主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[30]。近年來有許多研究證據(jù)表明QKI-5作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在許多生理、病理過程中發(fā)揮作用。Cochrane 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的內(nèi)皮細(xì)胞中，過表達(dá)QKI-5能夠顯著改善實(shí)驗(yàn)性后肢缺血后血管生成、新生血管形成及血流恢復(fù)。Zhao 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Qki-5 基因在體外和體內(nèi)均能有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。趙易等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中QKI-5的高表達(dá)可能通過抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期致使細(xì)胞增殖變緩，從而具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。段小霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，QKI-5在卵巢癌細(xì)胞中特異性擴(kuò)增后能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞克隆形成并促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。【本研究切入點(diǎn)】QKI-5作為轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控的下游靶基因眾多，調(diào)控方式多種多樣。但人們對(duì)QKI-5 參與調(diào)控哺乳動(dòng)物多種生理、病理功能認(rèn)識(shí)仍不全面，亟待進(jìn)一步的深入探究。并且該基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程的影響仍尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過克隆小鼠Qki-5基因的蛋白編碼序列（coding sequence，CDS），構(gòu)建其真核表達(dá)載體，并對(duì)小鼠QKI-5進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步探究Qki-5基因的生物學(xué)功能提供關(guān)鍵材料支撐，為后續(xù)探究牛、羊等反芻動(dòng)物Qki-5基因的功能提供前期研究基礎(chǔ)；此外，本研究探索Qki-5 基因在不同組織的表達(dá)豐度及其在小鼠肝臟中的表達(dá)分布，分析在小鼠肝細(xì)胞AML12 中過表達(dá)Qki-5 基因后檢測(cè)其對(duì)癌癥相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為探究Qki-5 基因在小鼠AML12 細(xì)胞中影響癌癥相關(guān)基因表達(dá)的作用機(jī)制提供關(guān)鍵材料與前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022 年02 月至2022 年08 月在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)所用的組織包括小鼠肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、十二指腸、結(jié)腸、全腦、肌肉、附睪脂肪、皮下脂肪以及睪丸，共計(jì)12個(gè)組織，每種組織分別取自3只4月齡C57BL/6野生型雄鼠，小鼠購(gòu)自北京維通利華公司；HEK293T、AML12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

DH5α感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；胎牛血清、Opti-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone 公司，TurboFect Transfection Reagent 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；TRIzol、PrimerSTAR?Max DNA polymera 和Quick Cut?BmaHⅠ購(gòu)自日本TaKaRa 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO 公司、SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA 裂解液、PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；脫脂奶粉購(gòu)自BD 公司；兔抗HA 抗體購(gòu)自Abcam 公司；兔抗GAPDH 多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP 共軛山羊抗兔抗體購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司；ECL HRP 底物試劑盒購(gòu)自北京迪寧生物科技有限公司；多聚甲醛固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔抗QKI 單克隆抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司；非特異性兔抗IgG 抗體購(gòu)自Abcam 公司；免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中的小鼠Qki-5 基因CDS 區(qū)序列（登錄號(hào)：NM_001159517.1），使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，引物序列如下：F：5′-AGAGAATTCGATATCGGATCCATGGTCGGGGAAATGGAAAC-3′；R：5′-GGTCTCGAGGGTACCGGATCCTTAGTTGCCGGTGGCGG-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），在上下游引物5′分別添加了pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體BamHⅠ酶切位點(diǎn)兩側(cè)互補(bǔ)配對(duì)的同源序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 026 bp。引物交由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 稱取20 mg小鼠肝臟組織，加入1 mL TRIzol，使用TRIzol法提取總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)液均在冰上配制，反應(yīng)過程如下：RNA 5 μL 65 ℃變性5 min；反應(yīng)后加入4×DN Master Mix 2 μL、Nuclease-free water 1 μL混勻，37 ℃溫育5 min；之后加入5×RT Master Mix Ⅱ 2 μL，37 ℃ 15 min、50 ℃ 5 min、98 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后置于-20 ℃保存。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增帶有同源序列的Qki-5基因CDS區(qū)片段。PCR 反應(yīng)體系50 μL：2×PrimerSTAR Max Premix 25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 4 μL（50 ng/μL），加ddH2O 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，53.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸75 s，循環(huán)35次，72 ℃終延伸5 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，符合預(yù)期的條帶進(jìn)行膠回收。

1.3.3 pcDNA3.1-mQki-5真核表達(dá)載體的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ對(duì)pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體進(jìn)行線性化，反應(yīng)體系：pcDNA3.1 2 μL，Quick CutTMBamHⅠ 1.5 μL，10×Quick Cut Green Buffer 2 μL，加ddH2O 至20 μL。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將目的條帶進(jìn)行膠回收純化。之后將膠回收純化的Qki-5基因CDS區(qū)片段與pcDNA3.1-Puro-N-3HA線性化載體進(jìn)行重組連接，反應(yīng)體系：線性化載體104.22 ng，插入片段41.04 ng，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，加ddH2O 至20 μL，37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，按照說明書將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，在含有羧芐青霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基中倒置培養(yǎng)37 ℃ 16 h，之后挑取單克隆菌落，置于37 ℃搖床擴(kuò)增培養(yǎng)12 h，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)濃度。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和PCR 鑒定，將符合預(yù)期的重組質(zhì)粒送至西安擎科生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 上的序列進(jìn)行比對(duì)，并將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒重命名為pcDNA3.1-mQki-5。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 利用DNASTAR 及MEGA11 軟件對(duì)小鼠的Qki-5 基因和大鼠、人、山羊、綿羊、牛、牦牛、豬、馬、雙峰駝、斑馬魚、鯉魚的Qki基因CDS 區(qū)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；應(yīng)用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)小鼠QKI-5蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，包括蛋白分子式及分子質(zhì)量、原子總數(shù)、氨基酸數(shù)、理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族系數(shù)等理化性質(zhì)；應(yīng)用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件對(duì)小鼠QKI-5 蛋白氨基酸序列的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用NetPhos 3.1 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）在線軟件對(duì)小鼠QKI-5 蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；使用SingaIP5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）在線軟件預(yù)測(cè)小鼠QKI-5 蛋白信號(hào)肽；使用TMHMM2.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線程序進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；使用PSORTII Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；應(yīng)用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線工具網(wǎng)站預(yù)測(cè)小鼠QKI-5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用在線軟件SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)山羊、小鼠和人QKI-5 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL 對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行比較；最后，使用STRING（https：//cn.string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)小鼠QKI-5蛋白的互作蛋白。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)Qki-5基因在小鼠不同組織的表達(dá)譜 在同一時(shí)間點(diǎn)收取同一環(huán)境中3 只C57BL/6 雄鼠的肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、十二指腸、結(jié)腸、全腦、肌肉組織、附睪脂肪組織、皮下脂肪組織以及睪丸組織，共12 個(gè)組織樣品，分別稱取各組織樣品20 mg，加入1 mL TRIzol，提取組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋至2.5 ng/μL 備用。使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)小鼠的Qki-5 基因和36b4基因的引物序列（表1），使用CFX96 熒光定量?jī)x器反應(yīng)，檢測(cè)Qki-5 基因和36b4基因的表達(dá)。并以36b4基因?yàn)閮?nèi)參，使用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算不同組織Qki-5 基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)[31]。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.3.6 免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）檢測(cè)QKI-5 在小鼠肝臟組織中的分布 使用多聚甲醛固定小鼠的肝臟組織，并將已固定的組織制成石蠟切片。使用二甲苯以及梯度酒精將石蠟切片脫蠟脫水；之后使用抗原修復(fù)液高火煮沸后調(diào)至中火維持20 min 斷續(xù)沸騰狀態(tài)，冷卻至室溫后，PBS 清洗3 次，每次5 min；0.2% TrionX-100室溫透膜30 min，PBS 清洗3次，每次5 min；使用1% BSA 室溫封閉1 h，之后甩干封閉液；QKI抗體（1：150 稀釋）或非特異性IgG 抗體（1：200 稀釋）在濕盒中4℃孵育過夜，分別為試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組，次日室溫孵育30 min 后，PBS 清洗5 次，每次5 min；使用免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，之后使用光學(xué)顯微鏡觀察QKI-5的分布并保存圖像[32]。

1.3.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AML12 細(xì)胞 復(fù)蘇AML12 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞分別傳代至兩個(gè)6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pcDNA3.1-Puro-N-3HA 空載體和pcDNA3.1-mQki-5 重組質(zhì)粒按照Turbofect 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染至AML12 細(xì)胞。每個(gè)6 孔板中，對(duì)照組和試驗(yàn)組各轉(zhuǎn)染3孔，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h收取RNA樣品，48 h后收取蛋白樣品，分別用于檢測(cè)小鼠QKI-5在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。

1.3.8 qRT-PCR 檢測(cè)Qki-5 基因在AML12 細(xì)胞的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h 后，加入TRIzol 提取試驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋至2.5 ng/μL 備用。使用qPCR 檢測(cè)Qki-5 基因和36B4基因在mRNA水平的表達(dá)（表1）。反應(yīng)體系如下：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL、cDNA 5 μL（2.5 ng/μL），加ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。使用熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，并以36b4基因?yàn)閮?nèi)參，使用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算試驗(yàn)組與對(duì)照組Qki-5基因相對(duì)表達(dá)量及相對(duì)倍數(shù)。

1.3.9 Western Blotting（WB）檢測(cè)QKI-5在AML12細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞樣品，按說明書使用RIPA 裂解液提取試驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞總蛋白，之后使用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并加入裂解液將樣品稀釋至統(tǒng)一濃度，之后加入上樣緩沖液，100 ℃ 水浴10 min，樣品放-20 ℃保存或直接進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，之后使用10%脫脂奶粉封閉2 h。封閉完后，使用TBST 洗膜3 次，每次10 min；之后將PVDF 膜置于兔抗HA 標(biāo)簽的一抗工作液（1∶4 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min；之后將PVDF 膜置于山羊抗兔二抗工作液（1∶5 000），室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。之后將膜在ECL發(fā)光液中浸泡2 min，于暗室曝光顯影并保存蛋白結(jié)果[33]。

1.3.10 在AML12細(xì)胞中檢測(cè)癌癥相關(guān)基因的表達(dá) 分別在mRNA 和蛋白水平驗(yàn)證QKI-5在AML12細(xì)胞成功過表達(dá)后，使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列（表2），使用熒光定量系統(tǒng)檢測(cè)Bcl2、P53、Ccnd1、CerbB2、Rasa1、Kras、Cdkn1a、Cdkn1b等8個(gè)癌癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量，并以36b4基因?yàn)閮?nèi)參，使用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算不同基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

表2 癌癥相關(guān)基因引物序列信息Tab.2 Primer sequence information for cancer-related gene

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用2-ΔΔCt法將qPCR中的Ct值轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量，利用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠Qki-5基因克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以小鼠肝臟cDNA 為模板，使用帶有同源臂的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1A 所示，擴(kuò)增片段符合預(yù)期目的片段大?。? 026 bp）。將目的條帶進(jìn)行膠回收，與使用BamHⅠ限制性內(nèi)切酶線性化的載體進(jìn)行同源重組連接，構(gòu)建pcDNA3.1-mQki-5 真核表達(dá)載體。對(duì)重組載體與空載體進(jìn)行單酶切鑒定，結(jié)果如圖1B所示，空質(zhì)粒大小為5 211 bp，目的片段大小為1 026 bp，酶切結(jié)果符合預(yù)期。并將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mQki-5進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布序列完全一致。以上結(jié)果表明，pcDNA3.1-mQki-5真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 小鼠Qki-5基因CDS擴(kuò)增與pcDNA3.1-mQki-5真核表達(dá)載體鑒定結(jié)果Fig.1 Results of mouse Qki-5 gene CDS amplification and identification of pcDNA3.1-mQki-5 eukaryotic expression vector

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 不同物種間Qki基因CDS 序列相似性比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建 利用DNASTAR 及MEGA11 對(duì)12 個(gè)物種的Qki基因CDS區(qū)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。相似性比對(duì)結(jié)果如圖2所示，小鼠Qki基因的CDS 區(qū)與人、大鼠、山羊、綿羊、牛、牦牛、豬、馬、雙峰駝、斑馬魚、鯉魚的相似性分別是96.4%、95.5%、94.5%、94.6%、94.2%、92.7%、95.6%、95.7%、89.8%、68.5%、67.8%，由此可知，小鼠Qki基因的CDS區(qū)與人的相似性最高，與鯉魚的相似性最低。系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果如圖3所示，這12個(gè)物種之間，小鼠Qki基因與大鼠的遺傳距離最近，其次是人、馬和豬等其他哺乳動(dòng)物，與鯉魚的遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖2 Qki基因CDS區(qū)序列相似性比對(duì)Fig.2 Homology comparison of Qki gene’s CDS region

圖3 小鼠Qki基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Qki gene in mice

2.2.2 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 應(yīng)用ProtParam 在線軟件對(duì)小鼠QKI-5 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示小鼠QKI-5蛋白分子式為C1672H2713N463O493S15，原子總數(shù)為5 356，分子質(zhì)量約為37.67 ku。QKI-5蛋白的氨基酸組成如表3 所示，共包含氨基酸341 個(gè)，其中色氨酸（Trp）含量最低，丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）和脯氨酸（Pro）含量較高，不含有吡咯賴氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）。理論等電點(diǎn)為8.63，為堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)為35.08，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)；總平均親水性（GRAVY）為-0.388；脂肪系數(shù)為87.01。

表3 小鼠QKI-5蛋白氨基酸組成Tab.3 Amino acid composition of mouse QKI-5 protein

2.2.3 親/疏水性預(yù)測(cè) 應(yīng)用ProtScale 在線軟件對(duì)小鼠QKI-5蛋白氨基酸序列的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，最低分值（-3.744）位于第134、135位氨基酸，表明親水性最強(qiáng)；最高分值（1.789）位于第217、218位氨基酸，表明疏水性最強(qiáng)；且該蛋白大部分位于親水區(qū)域，故小鼠QKI-5蛋白為親水性蛋白。

2.2.4 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用NetPhos 3.1 server在線軟件對(duì)小鼠QKI-5蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，QKI-5 蛋白含9 個(gè)絲氨酸（Serine）磷酸化位點(diǎn)，12 個(gè)蘇氨酸（Threonine）磷酸化位點(diǎn)，5 個(gè)酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)，共26個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2.2.5 信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SingaIP5.0 在線軟件預(yù)測(cè)小鼠QKI-5 蛋白信號(hào)肽。結(jié)果顯示，該蛋白不存在信號(hào)肽；使用TMHMM2.0 Server 程序進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，QKI-5 蛋白不存在跨膜區(qū)域；使用PSORTII Prediction 在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白有56.5%定位于細(xì)胞核上，17.4%定位于細(xì)胞質(zhì)中，8.7%定位于高爾基體，4.3%定位于分泌小泡、過氧化物酶體、線粒體和細(xì)胞骨架。

2.2.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用SOPMA 在線工具網(wǎng)站預(yù)測(cè)小鼠QKI-5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果表示：小鼠QKI-5 主要由α-螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中α-螺旋占32.84%，β 轉(zhuǎn)角占4.40%，延伸鏈占14.96%，無規(guī)則卷曲占47.80%，推測(cè)無規(guī)則卷曲是QKI-5最大的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件。

2.2.7 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用在線軟件SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)小鼠的QKI-5 蛋白（NCBI 登錄號(hào)：NP_001152989.1），以及人（NCBI 登錄號(hào)：NP_006766.1）和大鼠QKI 蛋白（NCBI 登錄號(hào)：NP_001108493.1）的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4 所示。使用PyMOL 對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，三者QKI 蛋白模型間原子位置均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation，RMSD）均為0.00，說明小鼠預(yù)測(cè)QKI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與人和大鼠之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有差異；并且將三者的氨基酸序列在NCBI 在線網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示小鼠與人的氨基酸序列完全相同，小鼠與大鼠的氨基酸序列相似率為91%。3 個(gè)物種之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)一致，說明其在功能上可能也具有高度相似性。

圖4 小鼠、人、大鼠QKI蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the tertiary structure of mouse QKI protein in mouse，human and rat

2.2.8 QKI-5蛋白的互作蛋白預(yù)測(cè) 使用STRING 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)小鼠QKI-5蛋白的互作蛋白，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示，QKI-5蛋白主要與多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白4（Poly rC binding proteins，PCBP4）、多重剪接RNA結(jié)合蛋白2（RNA binding protein with multiple splicing 2，RBPMS2）、真核翻譯起始因子4E 核輸入因子1（Eukaryotic translation initiation factor 4E nuclear import factor 1，Eif4enif1）、RNA 結(jié)合fox-1 同源物2（RNA binding fox-1 homolog 2，RBFOX2）、RNA 結(jié)合蛋白mRNA 加工因子（RNA binding protein mRNA processing factor，RBPMS）、遠(yuǎn)上游元件結(jié)合蛋白（Far upstream element binding protein 3，F(xiàn)UBP3）、U2 小核RNA輔助因子2（U2 small nuclear RNA auxiliary factor 2，U2AF2）、多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白29（Poly rC binding protein 2，PCBP2）、多聚嘧啶束結(jié)合蛋白2（Polypyrimidine tract binding protein 2，PTBP2）、核異質(zhì)核糖核蛋白L樣（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L like，hnRNPLL）等蛋白之間存在互作。

圖5 小鼠QKI-5蛋白互作蛋白預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of proteins interaction with mouse QKI-5 protein

2.3 Qki-5基因在小鼠不同組織中的表達(dá)譜

提取3 只C57BL/6 雄性小鼠的12 個(gè)組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，檢測(cè)小鼠Qki-5 基因的表達(dá)，以36b4基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算Qki-5 基因的相對(duì)表達(dá)量，并均一化各組織表達(dá)量，分析12 個(gè)組織的表達(dá)相對(duì)變化，結(jié)果如圖6所示。在12個(gè)組織中，全腦的表達(dá)量最高，其次是肺臟、皮下脂肪組織以及附睪脂肪組織等，肝臟的表達(dá)量處于中等水平，十二指腸和結(jié)腸的表達(dá)量最低。

圖6 小鼠Qki-5基因mRNA在不同組織的表達(dá)豐度Fig.6 Expression abundance of mouse Qki-5 gene’s mRNA in different tissues

2.4 QKI-5蛋白在小鼠肝臟組織中的表達(dá)分布

通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟中QKI-5 的表達(dá)分布，結(jié)果如圖7 所示，QKI-5 表達(dá)分布于肝細(xì)胞中，且主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。

圖7 QKI-5在小鼠肝臟組織中的表達(dá)分布Fig.7 The distribution of QKI-5 in mouse’s liver

2.5 QKI-5在AML12細(xì)胞中成功過表達(dá)

將pcDNA3.1-mQki-5 重組質(zhì)粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA 空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至AML12 細(xì)胞后，檢測(cè)QKI-5的表達(dá)水平。結(jié)果如圖8A 所示，pcDNA3.1-mQki-5試驗(yàn)組Qki-5基因的mRNA 表達(dá)量升高，為對(duì)照組的5.78 倍（P＜0.01）。表明，pcDNA3.1-mQki-5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AML12 細(xì)胞中在mRNA 水平成功過表達(dá)。由圖8B可知，試驗(yàn)組細(xì)胞樣品中經(jīng)HA抗體孵育后，在約38 ku處有明顯的條帶出現(xiàn)，而在對(duì)照組中無條帶出現(xiàn)。該結(jié)果表明pcDNA3.1-mQki-5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AML12 細(xì)胞中在蛋白水平成功過表達(dá)。以上結(jié)果表明pcDNA3.1-mQki-5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AML12細(xì)胞中在mRNA和蛋白水平均成功過表達(dá)。

圖8 qPCR及Western Blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Results of qPCR and WB analysis

2.6 AML12細(xì)胞過表達(dá)Qki-5對(duì)癌癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

基于結(jié)果2.5，進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組原癌基因Bcl2、Kras、Ccnd1、CerbB2以及抑癌基因P53、Rasa1、Cdkn1a、Cdkn1b8 個(gè)癌癥相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖9 所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的P53mRNA 水平顯著增加至3.32 倍（P＜0.01），試驗(yàn)組的Ccnd1mRNA 增加至1.69 倍（P＜0.05），Bcl2、CerbB2、Rasa1、Cdkn1a、Cdkn1b、Kras基因的mRNA水平均未見變化。

圖9 癌癥相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative mRNA expression levels of cancer related genes

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于RBPs 的研究不斷深入，逐漸證明RBPs 在許多生理過程中都發(fā)揮重要作用。QKI蛋白是一類重要的RNA 結(jié)合蛋白，而QKI-5作為其重要轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白，在RNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的過程中也發(fā)揮著重要作用。QKI-5作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，人們對(duì)其的生理、病理功能的認(rèn)識(shí)尚不全面。目前，對(duì)于RNA 結(jié)合蛋白QKI-5 的研究主要集中在其對(duì)于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的影響作用[11-15,34]，而其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中作用的研究未見報(bào)道。癌癥在動(dòng)物中的發(fā)生率和死亡率很高，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的生命與健康。因此，本研究構(gòu)建了小鼠Qki-5基因真核表達(dá)載體，通過生物信息學(xué)在線軟件對(duì)QKI-5 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特征進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；檢測(cè)QKI-5 在不同組織的表達(dá)譜以及在小鼠肝臟中的表達(dá)分布；并對(duì)于在AML12 細(xì)胞中過表達(dá)QKI-5 后對(duì)癌癥相關(guān)基因的影響進(jìn)行研究，以期為后續(xù)研究QKI-5在不同生理、病理過程中的功能以及在小鼠AML12細(xì)胞中影響癌癥相關(guān)基因表達(dá)的作用機(jī)制提供前期材料。

蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)結(jié)果表明，與QKI-5蛋白相互作用的前十位蛋白中，主要包括PCBP4、RBPMS2、RBPMS、RBFOX2 以及FUBP3。其中，RNA 結(jié)合蛋白PCBP4 是p53 的靶蛋白，在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，并參與肺腫瘤的抑制作用。Yan 等[35]研究結(jié)果表明PCBP4 缺乏的小鼠容易發(fā)生肺腺癌、淋巴瘤和腎腫瘤，并且PCBP4缺乏的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）表現(xiàn)出細(xì)胞增殖增加但細(xì)胞衰老減少。Notarnicola 等[36]發(fā)現(xiàn)，RNA 結(jié)合蛋白R(shí)BPMS2具有調(diào)節(jié)雛雞胃腸道平滑肌發(fā)育的作用，其持續(xù)表達(dá)可通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白的活性，來抑制平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)，從而刺激平滑肌細(xì)胞的增殖。此外，Rabelo-Fernandez 等[37]的研究證據(jù)表明，RBPMS 可作為抑癌基因發(fā)揮作用，降低RBPMS 水平可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。研究證據(jù)表明，在糖尿病的發(fā)展過程中，RBFOX2 通過與靶基因AS結(jié)合，破壞正常的基因在心臟的表達(dá)模式，從而引起糖尿病早期心肌病的發(fā)生[38]。遠(yuǎn)上游元件結(jié)合蛋白FUBP3具有抵抗豬流行性腹瀉感染的功能，研究證據(jù)表明，F(xiàn)UBP3可以降解豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白并誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生[39]。上述證據(jù)表明，QKI-5可能參與調(diào)控癌癥、心臟相關(guān)疾病以及參與免疫等眾多生理、病理過程，但該功能僅為初步預(yù)測(cè)分析結(jié)果，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，本研究通過qPCR檢測(cè)小鼠Qki-5基因在不同組織表達(dá)分布，結(jié)果表明該基因在所檢測(cè)的12個(gè)組織中均有表達(dá)且在全腦中表達(dá)量最高，其次是肺臟。由于全腦主要與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)功能有關(guān)，因此推測(cè)QKI-5可能在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)和肺臟的生命活動(dòng)過程中具有一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，Qki基因的突變會(huì)導(dǎo)致中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成障礙而引起頻繁震顫，嚴(yán)重可于胚胎早期死亡，也因此得名為Quaking[40]。Hayakawa-Yano 等[41]研究發(fā)現(xiàn)QKI-5可以抑制神經(jīng)元遷移并誘導(dǎo)異位有絲分裂細(xì)胞，在神經(jīng)干細(xì)胞中發(fā)揮功能。Wang等[12]研究結(jié)果表明，QKI-5可以調(diào)控肺癌細(xì)胞骨架基因ADD3的可變剪接，反映了QKI-5的對(duì)肺癌的抑制作用；Zhou等[42]研究發(fā)現(xiàn)QKI-5可以通過抑制β-catenin信號(hào)通路，從而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲性。以上結(jié)果表明Qki-5基因在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及肺臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

有許多研究表明QKI-5 對(duì)于多種癌癥的發(fā)生發(fā)展具有一定影響作用，因此筆者在小鼠肝細(xì)胞中過表達(dá)QKI-5 后檢測(cè)對(duì)癌癥相關(guān)基因的影響。由圖9 結(jié)果可知，QKI-5 過表達(dá)后會(huì)引起P53和Ccnd1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而Bcl2、CerBb2、Rasa1、Cdkn1a、Cdkn1b、Kras未見明顯變化。P53基因是重要的腫瘤抑制因子，可以保護(hù)細(xì)胞免受癌基因激活、輻射、有絲分裂應(yīng)激、核糖體應(yīng)激等一系列生理應(yīng)激反應(yīng)[43]。在AML12 細(xì)胞中過表達(dá)QKI-5 后引起P53基因表達(dá)水平升高，說明在正常細(xì)胞中QKI-5 的過表達(dá)可以激活P53的水平升高，從而可以產(chǎn)生一定的抑癌作用。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）由位于11號(hào)染色體第一區(qū)3號(hào)帶（11q13）的Ccnd1基因編碼，是一種調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白，在細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用[44]，能夠造成細(xì)胞增殖甚至惡性增長(zhǎng)，具有腫瘤因子的性質(zhì)。有研究結(jié)果表明，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，QKI-5的低表達(dá)可增加Ccnd1的表達(dá)，從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞增殖。而在AML12細(xì)胞中過表達(dá)QKI-5 后，Ccnd1的mRNA 水平升高，說明在正常細(xì)胞中過表達(dá)QKI-5 不能抑制Ccnd1的表達(dá)，反而會(huì)造成Ccnd1的水平升高，通過該結(jié)果推測(cè)QKI-5 在正常細(xì)胞中不能通過抑制Ccnd1發(fā)揮抑癌作用，推測(cè)QKI-5 主要通過Ccnd1mRNA 抑制癌細(xì)胞的增殖而發(fā)揮抑癌作用，對(duì)正常細(xì)胞沒有抑癌作用。通過P53和Ccnd1基因表達(dá)結(jié)果，可推測(cè)對(duì)于癌癥疾病QKI-5可能在正常細(xì)胞中通過激活P53的表達(dá)而具有預(yù)防作用，而在正常細(xì)胞中QKI-5并不通過Ccnd1產(chǎn)生抑癌作用。

本研究成功構(gòu)建了小鼠Qki-5基因真核表達(dá)載體，并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了其蛋白功能。獲得了不同組織的表達(dá)譜，Qki-5基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)，且不同組織間表達(dá)量有明顯差異，在全腦、肺臟中表達(dá)量較高。在小鼠肝臟中，QKI-5表達(dá)分布于肝細(xì)胞中，且主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。在AML12細(xì)胞中，QKI-5的過表達(dá)引起P53和Ccnd1的水平升高，提示QKI-5在正常細(xì)胞中可通過激活P53而發(fā)揮抑癌作用，在正常細(xì)胞中QKI-5并不通過Ccnd1產(chǎn)生抑癌作用。本研究結(jié)果提示QKI-5可能參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)、心臟疾病等生理、病理過程，并證明QKI-5對(duì)于小鼠AML12細(xì)胞中癌癥相關(guān)基因的表達(dá)具有一定影響。

致謝：國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2022 年度開放基金（NHCC-2022-01）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！