劉 鑫,張亞紅,袁 苗,劉 帥,葛 靜,周 娟

(1.寧夏大學農(nóng)學院,銀川 750021;2.寧夏大學食品與葡萄酒學院,銀川 750021)

【研究意義】我國是葡萄(VitisviniferaL.)最大生產(chǎn)國,近年來設(shè)施葡萄迅速發(fā)展,成為推動葡萄產(chǎn)業(yè)繁榮的新動力[1]。但設(shè)施中的弱光環(huán)境導(dǎo)致設(shè)施‘紅地球’葡萄栽培連續(xù)形成花芽能力差、分化數(shù)量少,成為設(shè)施葡萄栽培生產(chǎn)中的突出問題[2]。因此,花芽分化不良已成為阻礙設(shè)施‘紅地球’葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸,能否形成量多質(zhì)優(yōu)的花芽已成為設(shè)施葡萄栽培取得成功的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M展】‘紅地球’葡萄對光反應(yīng)敏感,設(shè)施弱光環(huán)境下的花芽更多形成卷須,導(dǎo)致成花率下降,目前主要通過選用一些耐弱光品種[3]或采取更新修剪措施[4],但兩種措施都存在局限性,前者缺乏適合西北地區(qū)的優(yōu)質(zhì)耐弱光品種,后者對設(shè)施‘紅地球’葡萄萌發(fā)新梢成花規(guī)律尚未展開研究。光照作為必不可少的環(huán)境因子,影響園藝作物生長發(fā)育[5],也是最容易調(diào)控的設(shè)施環(huán)境因素。光照強度直接影響植物的生長發(fā)育和形態(tài)特征[6];光照周期影響植物的生育進程和營養(yǎng)生長[7];光質(zhì)調(diào)節(jié)激素平衡、光合產(chǎn)物累積等改變植物內(nèi)部因子,從而調(diào)控成花基因的表達[8-9],是花芽分化的重要影響因素。不同光質(zhì)對園藝植物成花的影響不同[10]。藍光通過改變?nèi)~片中營養(yǎng)物質(zhì)積累,抑制了蘋果開花,而紅光對蘋果開花影響不大[11]。紅光處理可促使茉莉花提前開花且增加花蕾數(shù)量,而藍光延遲茉莉開花但花蕾數(shù)量減少[12]。因此,不同光質(zhì)對長日照植物成花誘導(dǎo)的影響取決于所涉及的物種,而紅光與藍光的結(jié)合可形成適合植物光合作用和形態(tài)發(fā)生的光譜吸收峰,激活植物中復(fù)雜的光系統(tǒng),啟動生理和生化反應(yīng),形成完全發(fā)育的花芽[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c】LED能精準提供植物所需波長的光質(zhì)、光強和光長,在設(shè)施園藝光環(huán)境調(diào)控中具有重要意義和作用[15]。目前,使用不同光質(zhì)LED提高產(chǎn)量和品質(zhì)在花卉和蔬菜[16-18]上已有廣泛應(yīng)用,在果樹上也有一些研究[19-20]。但利用LED光照措施提升設(shè)施內(nèi)的光環(huán)境,改善設(shè)施葡萄花芽分化的研究較少,且對設(shè)施葡萄花芽分化過程中內(nèi)源物質(zhì)變化及基因?qū)用娴难芯窟€較欠缺,因此,深入研究LED光質(zhì)對調(diào)控葡萄花芽分化具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過不同紅藍光處理,對花芽分化進程進行組織學、生理指標和成花相關(guān)基因研究,進而了解紅藍光對‘紅地球’葡萄花芽分化的調(diào)控機理,為設(shè)施‘紅地球’葡萄連年優(yōu)質(zhì)穩(wěn)產(chǎn)提供理論依據(jù)和解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年4—10月在銀川市賀蘭縣園藝產(chǎn)業(yè)園15號陰陽結(jié)合型日光溫室的陰棚內(nèi)進行(106°16′ E,38°20′ N),屬中溫帶大陸性氣候。陰棚坐南朝北,東西走向,東西長度90 m,南北跨度9 m,脊高4.5 m,覆蓋材料為聚氯乙烯薄膜(PVC),年平均日照時數(shù)2800～3000 h,年平均氣溫9.7 ℃。試驗材料為日光溫室9年生的‘紅地球’(Vitisviniferacv.‘Red Globe’)葡萄,主干傾斜L樹形,株行距為0.8 m×1.5 m。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)計5種不同比例紅藍光,紅光波長620 nm,藍光波長435 nm。分別為紅(R)、藍(B)、紅藍2∶1(R2B1)、紅藍4∶1(R4B1)、紅藍6∶1(R6B1)的LED植物燈,以溫室自然光作為對照(CK),不同處理間以遮光膜相隔。共72株樹,分6個小區(qū),每個小區(qū)12株,3次重復(fù),在每組試驗行樹體上方30 cm安置燈管,葉面光照強度300 μmol/(m2·s),時長14 h/d,光照時段為8:00—22:00。選取健康、長勢相同的葡萄植株掛牌標記,觀察試驗植株情況,新梢長至10葉時進行摘心,副梢留1葉摘心,進行常規(guī)水肥管理。

1.3 生理指標測量

‘紅地球’葡萄從萌發(fā)開始光照,到果實成熟(2020年9月15日)采收結(jié)束光照。新梢展葉時(2020年4月15日)開始采集長勢相近、基部粗度一致的枝條,隨機取樣,每個處理采集20只枝條。選擇4～6節(jié)花芽和葉片,用鋒利刀片取下,剝?nèi)ネ獠亏[片,取下主芽放入FAA液(90 mL 70%乙醇+5 mL 38%甲醛+5 mL冰乙酸)固定液中,用于制作花芽切片。

花芽石蠟切片和花芽分化進程劃分參照朱維等[21]的方法;將不同節(jié)位葉片混勻,可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮-硫酸比色法測定,可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定,類黃酮含量采用分光光度法測定,所有測量指標3次重復(fù),具體步驟參考王學奎等[22]的方法。

1.4 成花相關(guān)基因的表達分析

選擇成熟期(2020年9月15日)9:00 取各處理第5節(jié)花芽,以減少由于晝夜節(jié)律而導(dǎo)致基因表達差異的可能性。將取下的花芽立即置于液氮中,用OminiPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取樣品的RNA,利用Nanodrop 2000檢測RNA的濃度和純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,使用Agilent 2100測定RIN值。根據(jù)Genbank發(fā)表的葡萄基因序列,利用Primer 6.0軟件設(shè)計成花基因特異性引物(表1)[23],由生物工程(上海)股份有限公司合成,選用VvACTIN1(GenBank:XP_008654957.1)為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。qRT-PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司),PCR反應(yīng)體系為20 μL:one step RT-qPCR Master Mix 10 μL,上游引物和下游引物各0.4 μL,Template(RNA)1 μL,RT enzyme Mix 0.65 μL,ddH2O 7.55 μL。反應(yīng)程序為50 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min,95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸30 s,40次循環(huán),3次重復(fù)。

表1 實時熒光定量PCR基因引物序列Table 1 Primer sequences for the quantification of transcripts by real-time PCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 25.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA),Duncan法進行多重比較(α=0.05),Origin Pro 2021軟件進行制圖,數(shù)據(jù)為平均值±標準差。采用Cytoscape 3.8.0軟件,選取相關(guān)性大于0.6的基因,構(gòu)建基因間相互作用網(wǎng)絡(luò),使用CytoHubba工具(Method:MNC),找出節(jié)點基因,并將基因按總關(guān)聯(lián)度大小進行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘紅地球’葡萄花芽分化進程劃分

通過對不同處理下‘紅地球’葡萄各節(jié)位花芽分化觀察,將花芽分化進程分為未分化期、始分化期、花原始體發(fā)育期、花序主軸發(fā)育期和花序二級軸發(fā)育期5個階段(圖1)。

a.未分化期;b.始分化期;c.花原始體發(fā)育期;d.花序主軸發(fā)育期;e.花序二級軸發(fā)育期。A.生長點;LP.葉原基;IP.花序原基;BR.苞片;BP.分枝原基。a.Undifferentiated stage; b.Beginning of differentiation; c.Flower anlagen development; d.Formation of main cob of inflorescene; e.Formation of second cob of inflorescene; A.Apex; LP.Leaf primordium; IP.Inflorescence primordium; BR.Bracts; BP.Branching primordium.圖1 ‘紅地球’葡萄花芽分化進程切片F(xiàn)ig.1 Paraffin section of flower bud differentiation process of ‘Red Globe’ grape

2.2 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄第4節(jié)花芽分化進程的影響

‘紅地球’葡萄的花芽分化是一個循序漸進的過程,且各階段持續(xù)時間長。從圖2可以看出,對照和紅藍光處理下的第4節(jié)花芽于5月15日開始進入始分化期,并且同期R4B1和R6B1處理已有花芽進入花原始體發(fā)育期。6月15日,所有處理進入花序主軸發(fā)育期,6月30日,R4B1和R6B處理已經(jīng)進入花序二級軸發(fā)育期,7月15日所有處理進入花序二級軸發(fā)育期,其中,R4B1和R6B1處理所占比例為40%和35%,對照為10%,而R和B處理僅為5%。所有處理于7月30日通過始分化期,8月30日通過花原始體發(fā)育期。

圖2 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄第4節(jié)花芽分化進程的影響Fig.2 Effect of different proportions of red and blue light on flower bud differentiation process in section 4 of ‘Red Globe’grape

2.3 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄第5節(jié)花芽分化進程的影響

由圖3可以看出,紅藍光處理下‘紅地球’葡萄第5節(jié)花芽分化速度差異明顯。4月30日,所有處理均沒有進入分化期,R4B1和R6B1處理在5月15日已有花芽進入花原始體發(fā)育期,而其他處理在5月30日才開始有花芽進入花原始體發(fā)育期。R2B1、R4B1和R6B1處理在6月30日開始進入花序二級軸發(fā)育期,進入分化期的花芽分別占比為75%、90%和90%,而CK、R和B處理進入分化期的花芽占比為75%、65%和55%。7月15日,所有處理均進入花序二級軸發(fā)育期,并在8月30日通過花原始體發(fā)育期。

圖3 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄第5節(jié)花芽分化進程的影響Fig.3 Effect of different proportions of red and blue light on flower bud differentiation process in section 5 of ‘Red Globe’ grape

2.4 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄第6節(jié)花芽分化進程的影響

由圖4可以看出,紅藍光處理下的‘紅地球’葡萄第6節(jié)花芽在5月15日全部進入始分化期,5月30日進入花原始體發(fā)育期,6月15日進入花序主軸發(fā)育期。其中,R4B1和R6B1處理分化速度大于其他處理,6月15日時,R和B處理仍有部分花芽未進入分化期。7月15日,所有處理均進入花芽分化期,且R2B1、R4B1和R6B1處理全部通過始分化期。7月30日,全部處理均通過始分化期,進入花序二級軸發(fā)育期,R4B1和R6B1處理進入花序二級軸發(fā)育期的花芽占比分別為55%和45%,CK為20%,而B處理僅為10%。8月15日,R4B1處理全部進入花序主軸發(fā)育期和花序二級軸發(fā)育期。

圖4 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄第6節(jié)花芽分化進程的影響Fig.4 Effect of different proportions of red and blue light on flower bud differentiation process in section 6 of ‘Red Globe’ grape

2.5 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄成花率的影響

不同紅藍光處理下‘紅地球’葡萄各節(jié)位成花率差異顯著(圖5),單一紅、藍光補光處理下成花率降低,紅藍光組合補光處理下成花率升高,第5節(jié)成花率高于第4和第6節(jié)。不同處理下,第5節(jié)以單一藍光成花率最低,為38%,R2B1處理和CK成花率相等,為50%,R6B1和R4B1處理均顯著高于CK,分別為62%和66%,表明R4B1和R6B1處理能顯著提高‘紅地球’葡萄成花率。

圖5 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄成花率的影響Fig.5 Effect of different proportions of red and blue light on flowering rate of ‘Red Globe’ grape

2.6 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄葉片可溶性糖和淀粉含量的影響

從圖6可以看出,CK葉片可溶性糖含量在花芽未分化時上升,花芽分化前期含量持續(xù)下降,進入花序二級軸發(fā)育期后開始上升,直到花芽分化末期;不同紅藍光處理下葉片可溶性糖含量變化趨勢基本相同,花芽分化前期可溶性糖含量持續(xù)上升,進入花原始體發(fā)育期后含量開始下降,進入花序二級軸發(fā)育期后開始上升。不同處理下葉片的淀粉含量變化趨勢相同,在花芽分化前期淀粉含量持續(xù)上升,進入花原始體分化期后迅速下降,隨后在花序二級軸發(fā)育期開始上升。進入花序原基分化期后,消耗了大量的糖和淀粉,R4B1和R6B1處理下的可溶性糖和淀粉含量高于其他處理,這些較高水平的碳水化合物為前期花芽分化提供了能量。

圖6 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄葉片可溶性糖和淀粉含量的影響Fig.6 Effect of different proportions of red and blue light on soluble sugar and starch content of ‘Red Globe’ grape leaves

2.7 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄葉片可溶性蛋白和類黃酮含量的影響

由圖7可以看出,不同處理后葉片可溶性蛋白含量變化趨勢相同,花芽分化前期至花序二級軸分化期葉片可溶性蛋白含量不斷上升,在花芽分化后期下降后趨于穩(wěn)定,整個過程中R4B1和R6B1處理含量高于其他處理,CK和R處理含量最低。葉片類黃酮含量在花芽分化開始前水平較低,在花芽始分化期迅速上升,進入花原始體發(fā)育期后含量開始下降,最高點分別為:R處理在花原始體發(fā)育期、R2B1處理在花序主軸發(fā)育期,其他處理在花序二級軸發(fā)育期。

圖7 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄葉片可溶性蛋白和類黃酮含量的影響Fig.7 Effect of different proportions of red and blue light on soluble protein and flavonoid contents of ‘Red Globe’ grape leaves

2.8 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄成花基因表達量的影響

以CK成花基因表達量為對照,對不同補光組合下花芽成花基因表達進行了實時熒光定量PCR分析(圖8)。在不同補光組合處理下,花芽中VvAP2、VvSOC1表達量均顯著提高,VvLFY表達量顯著降低。在R和B處理下,花芽中VvAP2和VvAP3表達量最高;在R2B1處理下,花芽中VvAP1表達量最高;在R4B1處理下,花芽中VvFT、VvAG、VvAP2和VvSOC1表達量最高;在R6B1處理下,花芽中VvFUL、VvFT和VvSPL10表達量最高。

圖8 不同比例紅藍光對‘紅地球’葡萄花芽成花基因表達量的影響Fig.8 Effects of different proportions of red and blue light on flowering gene expression of ‘Red Globe’ grape

2.9 不同比例紅藍光下‘紅地球’葡萄成花基因間的相關(guān)性分析及相互作用

對不同補光組合下的成花率和10個成花相關(guān)基因的表達量進行相關(guān)性分析(表2)。CK的成花率與VvAP2表達量呈顯著正相關(guān),與VvSOC1表達量呈負相關(guān);R處理的成花率與VvFT表達量呈顯著正相關(guān),與VvAP1表達量呈顯著負相關(guān);B處理的成花率與VvSOC1表達量呈顯著正相關(guān),與VvAG表達量呈負相關(guān);R2B1處理的成花率與VvAP2表達量呈負相關(guān);R4B1處理的成花率與VvFUL、VvFT和VvSPL10表達量呈顯著正相關(guān);R6B1處理的成花率與VvFUL、VvFT、VvAG和VvSPL10表達量呈正相關(guān)。

表2 不同比例紅藍光下‘紅地球’葡萄成花基因與成花率的相關(guān)性分析Table 2 The correlation analysis between flowering gene and flowering rate of ‘Red Globe’ grape under different proportions of red and blue light

續(xù)表2 Continuedtable 2

R4B1和R6B1處理下成花率顯著提高,因此,對R4B1和R6B1處理下相關(guān)性大于0.6的成花基因進一步的相互作用進行網(wǎng)絡(luò)分析(圖9)?？梢钥闯?R4B1和R6B1處理下,VvAP1、VvAP2和VvSOC1的相對表達量較高。此外,在R4B1處理下,VvAP1、VvAP2、VvAP3和VvLFY為節(jié)點基因。其中,VvAP1與VvFT呈正相關(guān),與VvAP2、VvAP3呈負相關(guān);VvFLC和VvAG呈負相關(guān),VvFT與VvAP2、VvSOC1和VvSPL10呈正相關(guān)。在R6B1處理下,VvAP1、VvAP2、VvSOC1和VvLFY為節(jié)點基因。其中,VvAP1與VvAP2、VvLFY呈負相關(guān);VvAP2與VvLFY、VvFT和VvSOC1呈正相關(guān);VvFLC與VvSOC1和VvAG呈負相關(guān)。

圓代表基因,圓的大小與基因表達水平呈正相關(guān),圓的顏色深淺與總關(guān)聯(lián)度正相關(guān),粗框圓為節(jié)點基因。連接線粗細與基因間的相關(guān)性大小呈正相關(guān),紅色為正相關(guān),藍色為負相關(guān)。The circle represents genes.The size of the circle is positively correlated with the relative expression level of the gene.The colour depth of the circle is positively correlated with the total correlation degree.The coarse frame circle is the node gene.The thickness of the connecting line is positively correlated with the correlation between genes, and red is positively associated, and blue is negatively correlated.圖9 R4B1和R6B1處理下成花基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.9 Interaction network of flowering genes under R4B1 and R6B1 treatments

3 討 論

光照是花芽形成的必需條件,光質(zhì)影響植物內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)積累,進而調(diào)節(jié)枝梢營養(yǎng)和生殖平衡[24]。眾所周知,碳水化合物代謝涉及淀粉和糖的合成、分解代謝和相互轉(zhuǎn)化,在多個成花途徑中具有重要的信號和能量作用[25]?？扇苄蕴鞘腔ㄑ糠只^程中的營養(yǎng)基礎(chǔ),與甜櫻桃[26]、駿棗[27]等果樹的花芽分化顯著正相關(guān);淀粉是碳水化合物中最重要的部分,代表著植物體有機營養(yǎng)水平,并根據(jù)植物需要進行調(diào)動或積累,葉片中較高的淀粉含量促進蘋果樹花芽形成[28]。本研究中,可溶性糖和淀粉含量在花芽分化前期持續(xù)上升,進入花序原基分化期后下降,在花序二級軸發(fā)育期開始上升。不同光照處理下的碳水化合物含量均高于CK,其中,R4B1和R6B1處理下碳水化合物含量最高。表明在‘紅地球’葡萄花芽分化中期消耗了大量的碳水化合物,而補光處理下葉片較高的碳水化合物水平促進了花芽分化。

可溶性蛋白作為花芽分化的重要生理指標,與植物性狀表達密切相關(guān),在植物花芽轉(zhuǎn)變過程中是不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)[29]。黃酮類化合物在植物體內(nèi)合成代謝起源于光合產(chǎn)物,遍布植物體的各個組織,對植物生殖生長起著重要作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn),不同補光處理葉片蛋白含量顯著提高,與劉帥等[31]的研究結(jié)果一致,并在花芽未分化期開始上升至花序二級軸發(fā)育期達到最大值;葉片類黃酮含量在花序原基分化期迅速上升,并在花芽分化中后期保持較高水平,表明良好的花芽分化需要積累大量的可溶性蛋白和類黃酮。

控制花芽分化的基因需要特定的外界刺激和內(nèi)部各種生理調(diào)節(jié)后進行表達,成花基因的相關(guān)研究有助于從根本上了解光環(huán)境對花芽分化的影響。FT蛋白作為開花素,促使花分生組織特異性基因的表達,促進開花[32]。R4B1和R6B1處理下VvFT基因的表達水平顯著上調(diào),說明植物光受體在受到紅藍光刺激后,通過信號傳遞調(diào)控相關(guān)基因表達,進而影響花芽分化[33]。此外,FT還可以激活花整合基因SOC1和花分生組織基因AP1,啟動擬南芥的花轉(zhuǎn)換和花芽分化,然后,SOC1激活花分生組織識別基因LFY,控制花的誘導(dǎo)[34]。SOC1既作為信號通路的響應(yīng)因子,又作為開花信號整合因子調(diào)節(jié)擬南芥開花[35];AP1和FUL是花分生組織特征基因,調(diào)控花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變[36];LFY通過整合環(huán)境和內(nèi)源信號,控制植物花的生長發(fā)育[37]。本研究中R4B1處理下VvFT和VvAP1、VvSOC1表達呈正相關(guān)。AP2、AP3和AG是花器官特征基因,參與植物花芽分化,FLC是調(diào)控春化作用的關(guān)鍵基因,對成花基因FT和SOC1有抑制作用[38],SPL10是成花網(wǎng)絡(luò)中赤霉素途徑調(diào)控基因,對成花有正向調(diào)控作用[39]。成花率較高的R4B1和R6B1處理下成花基因與成花率相關(guān)性分析表明,成花率與VvFUL、VvFT、VvAG和VvSPL10表達量呈正相關(guān),與VvLFY、VvAP3和VvFLC表達量呈負相關(guān),進一步的網(wǎng)絡(luò)互作圖表明,VvAP1、VAP2和VvSOC1表達量和總關(guān)聯(lián)度較高,VvAP1、VvAP2、VvSOC1和VvLFY是成花基因相互作用關(guān)鍵節(jié)點。

4 結(jié) 論

不同比例紅藍光對設(shè)施‘紅地球’葡萄的花芽分化和成花基因表達有顯著影響。其中,R4B1處理下葉片可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、類黃酮含量顯著提高,成花基因VvFUL、VvFT、VvAG、VvAP1、VvAP2、VvSOC1和VvSPL10上調(diào)表達,VvLFY和VvFLC下調(diào)表達,促進了‘紅地球’葡萄的花芽分化。成花率與VvFUL、VvFT、VvAG和VvSPL10表達量呈正相關(guān),VvAP1、VvAP2、VvSOC1和VvLFY是成花基因相互作用關(guān)鍵節(jié)點,但光質(zhì)是如何影響植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)合成轉(zhuǎn)運以及成花基因的調(diào)控機制仍需進一步研究。