萬 穎,韓 婧,鄧子怡,汪 洋,王國凱,2,劉勁松,2*

(1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院,安徽 合肥 230012;2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(DioscoreabulbiferaL.)多年生草質(zhì)纏繞藤本植物的地下塊莖,分布廣泛,具有較高的藥用價值,但因其具有肝毒性,極大限制了其廣泛應用[1]。黃藥子化學成分豐富多樣,結(jié)構(gòu)類型主要涉及黃酮類、聯(lián)芐類及降二萜內(nèi)酯類成分,本課題組近年持續(xù)對黃藥子的化學成分進行了研究[2-3],并從乙酸乙酯萃取部位中分離了44個化合物,探究小極性萃取部位的物質(zhì)基礎[4],對黃藥子正丁醇部位進行系統(tǒng)的化學成分研究,以期尋找正丁醇部位的物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

AV-600 MHz型核磁共振譜儀(德國Bruker公司);Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱,HP1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Waters AutoSpec Premier P776(美國Waters公司);Sephadex LH-20凝膠(瑞士GE公司);Lichroprep Rp-18(40～75 μm)(日本Fuju Silysia化學公司);GF254TLC預制硅膠板和柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥

黃藥子2016年9月采購于金寨縣,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學彭華勝教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(DioscoreabulbiferaL.)的新鮮塊莖。

1.3 提取與分離

稱取黃藥子20 kg,洗凈,晾干,95%的乙醇回流提取3次,合并提取液,減壓濃縮至浸膏無醇味。用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇不同極性溶劑依次萃取,得到石油醚萃取物150 g,乙酸乙酯萃取物400 g和正丁醇萃取物170 g。稱取正丁醇部位萃取物150 g,經(jīng)硅膠柱色譜,二氯甲烷-甲醇(10∶1→1∶100)梯度洗脫,得9個亞組分Fr1～Fr9。

Fr1經(jīng)硅膠柱色譜,以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,得5個亞組分Fr1.1～Fr1.5。Fr1.5經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離得到化合物1(3.3 mg)。Fr2經(jīng)硅膠柱色譜,二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,得9個亞組分Fr 2.1～Fr 2.9。Fr2.1經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離純化得到化合物2(7.7 mg)、3(5.4 mg)、13(4.6 mg)、4(4.4 mg)。Fr2.7經(jīng)硅膠色譜柱,二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,得到5個亞組分;Fr 2.7.3經(jīng)MCI柱洗脫,得6個亞組分;Fr2.7.3.1通過制備液相色譜[甲醇-水,5∶95～70∶30(V/V),流速8 mL/min]分離純化得到化合物10(4.3 mg,tR=36 min),Fr2.7.3.6通過制備液相色譜[乙腈-水,30∶70～85∶15(V/V),流速8 mL/min]分離純化得到化合物5(5.1 mg,tR=36 min)、6(3.67 mg,tR=20 min)、7(4.9 mg,tR=32 min);Fr2.7.5經(jīng)ODS反相柱色譜分離得4個亞組分Fr2.7.5.1～Fr2.7.5.4。Fr2.7.5.1靜置析出結(jié)晶,經(jīng)反復重結(jié)晶得化合物8(6.3 mg)。Fr3經(jīng)硅膠柱色譜,二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,共得6個亞組分Fr3.1～Fr3.6;Fr3.5經(jīng)Sephadex LH -20凝膠柱,得到5個亞組分。Fr3.5.1經(jīng)制備液相色譜[甲醇-水,20∶80～35∶65(V/V),流速8 mL/min]分離得化合物11(5.3 mg,tR=21 min)、12(4.3 mg,tR=33 min)、14(3.3 mg,tR=36 min)。Fr3.4經(jīng)ODS反相柱色譜分離得5個亞組分Fr3.4.1～Fr3.4.5。Fr3.4.3經(jīng)制備液相色譜[甲醇-水,25∶75～30∶70(V/V),流速8 mL/min]純化得化合物15(4.7 mg,tR=15 min),Fr3.4.5經(jīng)制備液相色譜[甲醇-水,15∶85～35∶65(V/V),流速8 mL/min]純化得化合物9(4.1 mg,tR=32 min)。

2 結(jié)果與分析

化合物1：無色方晶(氯仿),分子式為C21H24O7。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δH：7.47(1H,s,H-16),7.38(1H,d,J=3.3 Hz,H-15),6.40(1H,d,J=3.2 Hz,H-14),5.49(1H,dd,J=12.6,3.2 Hz,H-12),5.11(1H,dd,J=2.7,2.6 Hz,H-6),4.84(1H,dd,J=5.1,5.1 Hz,H-2),2.79(1H,dd,J=15.2,2.8 Hz,H-7α),2.56(1H,dd,J=12.8,5.3 Hz,H-10),2.53(1H,d,J=6.0,H-4),2.49(1H,dd,J=11.4,6.0 Hz,H-3α),2.30(1H,dd,J=6.3,2.5 Hz,H-8),2.17(1H,dd,J=12.0,4.0 Hz,H-11α),2.12(1H,dd,J=14.2,4.8 Hz,H-1α),1.92(1H,d,J=12.6 Hz,H-11β),1.91(1H,d,J=12.1,H-5),1.86(1H,ddd,J=14.3,3.0,5.2 Hz,H-7β)1.76(1H,d,J=11.4,H-3β),1.44(1H,dd,J=14.2,13.7 Hz,H-1β),1.12(3H,s,H-20),2.02(3H,s,-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δC：28.4(C-1),69.8(C-2),34.6(C-3),42.4(C-4),41.3(C-5),69.3(C-6),26.8(C-7),46.0(C-8),39.8(C-9),38.7(C-10),31.7(C-11),76.9(C-12),124.9(C-13),108.5(C-14),143.8(C-15),139.9(C-16),170.8(C-17),176.0(C-18),21.9(C-20),171.0(-OCOCH3),21.0(-OCOCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[5]報道基本一致,鑒定該化合物為8-表黃獨素E-乙酸酯。

化合物2：無色針狀晶體(氯仿),分子式為C19H20O6。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δH：7.55(1H,s,H-16),7.38(1H,d,J=1.8 Hz,H-15),6.92(1H,d,J=1.8 Hz,H-14),5.29(1H,dd,J=10.9,5.4 Hz,H-12),4.87(1H,dd,J=4.8,4.8 Hz,H-2),4.70(1H,d,J=4.8 Hz,H-6),2.74(1H,d,J=5.4 Hz,H-4),2.60(1H,dd,J=10.5,5.2 Hz,H-7α),2.56(1H,dd,J=11.8,5.8 Hz,H-3α,)2.14(1H,d,J=10.6 Hz,H-7β),2.13(1H,d,J=11.2 Hz,H-5),2.12(1H,dd,J=12.4 Hz,5.4 Hz,H-11α),2.06(1H,dd,J=10.3,4.8 Hz,H-1α),1.96(1H,dd,J=12.3,11.7 Hz,H-11β),1.79(1H,d,J=11.7 Hz,H-3β),1.60(1H,d,J=11.8 Hz,H-1β),1.24(3H,s,20-CH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δC：29.7(C-1),76.5(C-2),38.7(C-3),42.5(C-4),43.0(C-5),75.4(C-6),37.5(C-7),89.4(C-8),45.8(C-9),39.5(C-10),41.9(C-11),75.4(C-12),125.1(C-13),110.1(C-14),143.5(C-15),141.4(C-16),176.4(C-17),175.3(C-18),16.7(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致,鑒定該化合物為黃獨素B。

化合物3：無色針狀結(jié)晶(甲醇),分子式為C20H24O7。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δH：8.48(1H,dd,J=1.6,0.8 Hz,H-16),8.39(1H,d,J=1.7 Hz,H-15),7.41(1H,dd,J=1.9,0.9 Hz,H-14),6.45(1H,dd,J=11.8,4.8 Hz,H-12),4.17(1H,m,H-2),3.71(1H,m,H-8),3.53(1H,dd,J=11.4,4.2 Hz,H-4),3.25(1H,dd,J=13.2,4.8 Hz,H-10),3.15(1H,dd,J=15.5,3.6 Hz,H-7α),2.78(1H,dd,J=16.9 Hz,6.5 Hz,H-7β),2.74(1H,dd,J=14.4,3.1 Hz,H-3α),2.65(1H,dd,J=14.9,3.6 Hz,H-11α),2.30(1H,m,H-5),1.94(1H,dd,J=14.4,11.9 Hz,H-11β),1.84(1H,d,J=13.9 Hz,H-1α),1.75(1H,d,J=13.9 Hz,H-3β),1.73(1H,d,J=14.2 Hz,H-1β),0.86(3H,s,H-20),3.51(3H,s,-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δC：32.9(C-1),65.2(C-2),34.4(C-3),36.7(C-4),49.8(C-5),207.9(C-6),36.9(C-7),44.4(C-8),35.1(C-9),40.1(C-10),41.8(C-11),70.6(C-12),124.4(C-13),108.4(C-14),143.7(C-15),140.1(C-16),174.6(C-17),174.9(C-18),17.3(C-20),50.6(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致,鑒定該化合物為黃獨素F。

化合物4：淡黃色粉末(氯仿),分子式為C18H16O7。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δH：7.96(1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),7.95(1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6′),7.47(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.67(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),6.42(1H,d,J=1.6 Hz,H-6),3.94(3H,s,3′-OCH3),3.93(3H,s,5-OCH3),3.90(3H,s,3-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δC：157.6(C-2),132.0(C-3),183.3(C-4),158.6(C-5),95.9(C-6),161.5(C-7),95.6(C-8),158.3(C-9),110.6(C-10),120.5(C-1′),111.9(C-2′),132.8(C-3′),149.8(C-4′),111.9(C-5′),121.0(C-6′),61.7(3-OCH3),56.4(5-OCH3),55.8(3′-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致,鑒定該化合物為3,5,3′-三甲氧基槲皮素。

化合物5：白色粉末(甲醇),分子式為C18H16O5。1H-NMR氫譜中,δ7.50～7.41(5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′)為黃酮類化合物B環(huán)上的質(zhì)子信號,說明B環(huán)上未被取代;δ3.94(3H,s,7-OCH3),3.89(3H,s,5-OCH3),3.47(3H,s,6-OCH3)為3個甲氧基信號,分別為7-OCH3、6-OCH3、5-OCH3處的信號峰,δ7.03(1H,s,H-3),6.41(1H,s,H-8)兩處尖銳的單峰分別為為C環(huán)3位碳及A環(huán)8位碳上的信號,13C-NMR中δ183.3(C-4)為4位羰基信號。其波譜數(shù)據(jù)與參考文獻[9]基本一致,鑒定該化合物為5,6,7-三甲氧基黃酮,1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表1。

表1 化合物51H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 5

化合物6：淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于氯仿,分子式為C18H18O5。1H-NMR氫譜中,δ7.47-7.33(5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′)為黃酮類化合物B環(huán)上的質(zhì)子信號,顯示B環(huán)未被取代;δ3.00 (1H,dd,J=16.8,12.6 Hz,H-3α),2.87(1H,dd,J=16.8,3.0 Hz,H-3β)說明該化合物為二氫黃酮。δ3.93(3H,s,7-OCH3),3.91(3H,s,8-OCH3),3.79(3H,s,5-OCH3)分別為7-OCH3、8-OCH3、5-OCH3處3個甲氧基信號,δ6.12(1H,s,H-6),5.46(1H,dd,J=12.6,3.0Hz,H-2)為6位,2位氫信號,波譜數(shù)據(jù)與參考文獻[10]基本一致,鑒定化合物為5,7,8-三甲氧基二氫黃酮,1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表2。

表2 化合物61H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 2 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 6

化合物7：黃色固體(氯仿),分子式為C19H18O7。1H-NMR氫譜中,δ7.03(1H,d,J=9.0 Hz,H-3′),7.04(1H,dd,J=9.0,3.0 Hz,H-4′)為黃酮類化合物B環(huán)上的質(zhì)子信號,說明B環(huán)被取代,結(jié)合13C-NMRδ113.2(C-3′),118.4(C-4′)說明且為對位取代。氫譜δ3.94(3H,s,7-OCH3),3.90(3H,s,8-OCH3),3.84(3H,s,2′-OCH3),3.89(3H,s,5′-OCH3)分別為7-OCH3、8-OCH3、3′-OCH3處的信號峰,δ7.07(1H,s,H-3),6.41(1H,s,H-6)處單峰分別為為3位碳及6位碳上的信號,波譜數(shù)據(jù)與參考文獻[11]基本一致,鑒定化合物為5-羥基7,8,2′,5′-四甲氧基黃酮,1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表3。

表3 化合物7 1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)Table 3 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 7

化合物8：白色針狀結(jié)晶(氯仿),分子式為C29H50O。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δH：5.29(1H,s,H-6),3.48(1H,m,H-3),0.99(3H,s,19-CH3),0.91(3H,s,29-CH3),0.83～0.78(9H,m,H-21,26,27),0.68(3H,s,18-CH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δC：37.3(C-1),31.8(C-2),71.9(C-3),42.4(C-4),140.8(C-5),121.8(C-6),32.0(C-7),32.0(C-8),50.2(C-9),36.6(C-10),21.2(C-11),39.8(C-12),42.3(C-13),56.9(C-14),24.4(C-15),29.2(C-16),56.0(C-17),12.1(C-18),19.5(C-19),36.9(C-20),18.9(C-21),36.2(C-22),28.3(C-23),45.9(C-24),29.8(C-25),19.5(C-26),18.9(C-27),23.2(C-28),11.9(C-29)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致,鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物9：白色粉末(甲醇),分子式為C30H50O2。1H-NMR氫譜中δ2.58(3H,s,27-CH3),2.53(3H,s,26-CH3),2.43(3H,s,25-CH3),2.38(3H,d,J=6.6 Hz,29-CH3),2.36(3H,s,23-CH3),2.29(3H,d,J=2.4 Hz,30-CH3),2.18(3H,s,24-CH3)表明共有個7甲基信號。δ2.99(1H,dd,J=17.4,6.0 Hz,H-3)顯示3位叔碳連接一個羥基。δ3.21(1H,d,J=6.0 Hz,H-28α),2.84(1H,d,J=6.0 Hz,H-28β)為28位仲醇碳上的偕偶的質(zhì)子信號。δ4.92(1H,t,J=11.4 Hz,H-12)為12位雙鍵信號。13C-NMR碳譜中顯示共有30個碳原子,δ138.9(C-13),125.0(C-12)為烏蘇烷型化合物特征的烯碳信號,δ78.4(C-3)為3位連羥基的碳原子信號,δ68.4(C-28)顯示為28位連接一個仲醇基團。波譜數(shù)據(jù)與參考文獻[13]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物為熊果醇,1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表4。

表4 化合物9化合物1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 4 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 9

化合物10：白色粉末(甲醇),分子式為C27H42O3。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δH：5.33(1H,d,J=5.4 Hz,H-6),3.48(1H,m,H-3),3.36(2H,m,H-26),1.26(3H,d,J=11.4 Hz,21-CH3),1.01(3H,s,19-CH3),0.95(3H,d,J=6.6Hz,27-CH3),0.78(3H,s,18-CH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δC：37.3(C-1),31.9(C-2),71.8(C-3),42.3(C-4),140.9(C-5),121.5(C-6),32.1(C-7),31.5(C-8),50.1(C-9),36.7(C-10),21.0(C-11),39.9(C-12),40.3(C-13),56.6(C-14),31.9(C-15),80.9(C-16),62.2(C-17),16.4(C-18),19.5(C-19),41.7(C-20),14.6(C-21),109.4(C-22),31.5(C-23),28.9(C-24),30.4(C-25),66.9(C-26),17.2(C-27)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致,鑒定該化合物為薯蕷皂苷元。

化合物11：黃色粉末(甲醇),分子式為C16H16O4。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δH：8.07(1H,d,J=9.0 Hz,H-5),6.64(1H,s,H-8),6.63(1H,s,H-6),6.62(1H,s,H-1),3.82(3H,s,4-OCH3),3.58(3H,s,2-OCH3),2.61(4H,m,H-9α,-9β,-10α,-10β);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δC：107.1(C-1),146.6(C-2),138.2(C-3),145.4(C-4),120.5(C-4a),124.4(C-4b),127.9(C-5),114.0(C-6),155.6(C-7),112.9(C-8),139.6(C-8a),29.6(C-9),30.1(C-10),129.1(C-10a),55.3(2-OCH3),58.8(4-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致,鑒定該化合物為3,7-二羥基-2,4-二甲氧基-9,10-二氫菲。

化合物12：棕綠色晶體(甲醇),分子式為C16H14O4。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δH：9.25(1H,d,J=9.0 Hz,H-5),7.51(1H,d,J=8.4 Hz,H-10),7.38(1H,d,J=8.4 Hz,H-9),7.12(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),7.08(1H,dd,J=9.0,2.4 Hz,H-6),3.96(3H,s,4-OCH3),3.85(3H,s,2-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δC：160.2(C-1),147.6(C-2),139.8(C-3),144.4(C-4),129.2(C-5),110.9(C-6),154.7(C-7),116.0(C-8),125.7(C-9),127.9(C-10),127.0(C-10a),123.0(C-4a),124.2(C-5a),135.1(C-8a),58.5(2-OCH3),55.1(4-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致,鑒定該化合物為3,7-二羥基-2,4-二甲氧基菲。

化合物13：無色晶體(氯仿),分子式為C9H8O2。1H-NMR中δ7.55(2H,m,H-2,6),7.41(1H,m,H-4),7.40(2H,m,H-3,5)為苯環(huán)上的5個氫,δ7.77(1H,d,J=15.6 Hz,H-7),6.46(1H,d,J=16.2 Hz,H-8)表明7位8位連有雙鍵,且為反式。上述波譜數(shù)據(jù)與參考文獻[17]基本一致,確定此化合物為肉桂酸,1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表5。

表5 化合物13 1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 5 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 13

化合物14：白色粉末(甲醇),分子式為C8H8O4。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δH：7.53(1H,s,H-6),7.52(1H,d,J=8.4 Hz,H-2),6.81(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),4.83(3H,s,3-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δC：123.9(C-1),114.5(C-2),151.3(C-4),147.3(C-5),122.0(C-6),55.1(-OCH3),168.8(-COOH)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致,鑒定該化合物為香草酸。

化合物15：白色片狀晶體(石油醚、丙酮),分子式為C10H14O5。1H-NMR中δ1.38(3H,s,9-CH3),1.37(3H,s,10-CH3)為異亞丙基上的兩個甲基,δ6.82處出現(xiàn)一個烯氫,為2位上的H質(zhì)子峰,13C-NMR中δ169.6(-7)在低場區(qū)顯示有一個羧基,δ78.4(C-3),73.6(C-4),69.0(C-5)3個峰表明有3個碳與雜原子氧相連。131.5(C-1),135.4(C-2)表明化合物中有雙鍵的存在。上述波譜數(shù)據(jù)與參考文獻[19]基本一致,鑒定該化合物為3,4-O-異亞丙基莽草酸,1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表6。

表6 化合物15 1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 6 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 15

3 結(jié)論與討論

黃藥子歷代本草均有述及,《簡要濟眾方》中記載治鼻衄不止：黃藥子為末,每服6 g,煎阿膠湯下。良久以新水調(diào)面一匙頭服之。《貴州草藥》[20]治腹瀉：黃藥子研末,每次3 g,開水吞服。在傳統(tǒng)用藥方法中,黃藥子大多用水煎液入藥,說明其大極性部位也存在一定的藥理活性。但在已有報道中,國內(nèi)外學者多是研究其小極性部位的化學成分分離及藥理活性,缺少大極性部位,所以在此基礎上需對黃藥子大極性部位進行化學成分研究,不僅能豐富這一類植物化學成分研究,還能增強黃藥子臨床用藥的安全性,這為黃藥子進一步研究及其開發(fā)利用提供參考和依據(jù),具有現(xiàn)實意義。