閆 霖，陸玨秀，羅 穎，劉先霞

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，海南 ?？?570100

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心血管系統(tǒng)的急癥和重癥,發(fā)病率和病死率居高不下,及時開通罪犯血管是治療心梗的首選策略[1]。然而在心梗血運重建后的再灌注過程可能會導(dǎo)致心臟損傷進(jìn)一步加重,出現(xiàn)心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MI/RI)[2]。近年來,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)移植治療作為一項前沿的臨床新技術(shù),逐漸應(yīng)用于心肌缺血/再灌注治療領(lǐng)域[3]。越來越多的研究證據(jù)表明,BM-MSCs可通過旁分泌大量細(xì)胞因子、外泌體(exosomes, exos),發(fā)揮抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖、減少凋亡、誘導(dǎo)血管新生和心肌再生等作用[4-5]。

外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑30～150 nm的盤狀囊泡,可攜帶多種蛋白、mRNA、lncRNA、miRNA等,并參與到細(xì)胞之間的通訊[6]。外泌體能夠通過配體/受體直接識別,或經(jīng)胞飲、胞吞及與受體細(xì)胞膜融合等多種方式調(diào)控復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)功能[7]。初步研究表明外泌體在MSCs旁分泌途徑治療心肌缺血及再灌注損傷過程中發(fā)揮重要的作用[8]。因此,本文將從細(xì)胞層面探討B(tài)M-MSCs來源外泌體(BM-MSCs-derived exosome,BM-MSCs-exo)對缺氣/復(fù)氧(anoxia-reoxygenation,A/R)心肌細(xì)胞損傷的保護作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞: 大鼠心肌細(xì)胞系(rat cardiomyoblast cell line,H9c2)、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。

1.1.2 主要試劑: 一抗TSG101、CD81、CD9、GPX4、SLC7A11、TFR1和GAPDH(CST公司);鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin(MCE生物科技公司);鐵死亡生化試劑盒包括丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、Fe2+離子檢測試劑盒和谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒(北京普萊利基因技術(shù)有限公司);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 BM-MSCs外泌體(BM-MSCs-exo)的獲取與鑒定:采用梯度離心法提取BM-MSCs來源外泌體。待BM-MSCs增殖至80～90%匯合度,更換不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后收集上清。在4 ℃下分別經(jīng)300×g、2 000×g、12 000×g各離心30 min后,棄沉淀獲得上清。濃縮的上清經(jīng)超高速離心機110 000×g離心1h,獲得外泌體沉淀。取少量PBS重懸外泌體沉淀,染色后在透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)并拍照;Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白TSG101、CD9、CD81的表達(dá),連續(xù)上樣3 次排除誤差。

取對數(shù)增殖期H9c2細(xì)胞接種于6孔板中,大鼠BM-MSCs細(xì)胞接種于孔徑為0.4 μm的Transwell小室中,并將完全培養(yǎng)基更換成PBS,然后將小室置入接種有H9c2細(xì)胞的培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行共培養(yǎng)。使用PHK26紅色熒光標(biāo)記外泌體,熒光顯微鏡下觀察H9c2 細(xì)胞對BM-MSCs-exos的內(nèi)吞情況。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理:將H9c2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于5% CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃恒溫)培養(yǎng),待細(xì)胞增殖至80～90%匯合度,將原高糖DMEM培養(yǎng)基替換成無血清的低糖DMEM,并在95% N2、5% CO2的缺氧環(huán)境中培養(yǎng)4 h,最后在10% FBS的高糖DMEM中復(fù)氧培養(yǎng)6 h,構(gòu)建細(xì)胞A/R模型。

將H9c2 細(xì)胞分為對照組,A/R組(模型組),A/R+BM-MSCs-exo組(BM-MSCs-exo干預(yù)組,50 μg/mL),A/R+BM-MSCs-exo+ Erastin組(Erastin干預(yù)組,30 μmol/L)。每組設(shè)3個復(fù)孔,48 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞活力:取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中(5×103/孔),按實驗方案處理后加入CCK-8溶液培養(yǎng)2～4 h,去上清后加入DMSO,采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的A值。數(shù)據(jù)分析,H9c2細(xì)胞活力(%)=(A450實驗組-空白組)/(A450對照組-空白組)×100%。

1.2.4 EdU細(xì)胞增殖的檢測:取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中(5×103/孔)。采用EdU試劑A標(biāo)記細(xì)胞,2 h后用 4%多聚甲醛固定30 min, 并以0.1% Triton-X-100通透30 min, 最后使用Apollo染色反應(yīng)液37 ℃避光孵育30～60 min,在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的檢測:根據(jù)實驗方案處理細(xì)胞并獲取細(xì)胞上清,根據(jù)鐵死亡相關(guān)試劑盒說明書步驟,采用生化法檢測Fe2+、MDA、GSH含量。

1.2.6 Western blot檢測蛋白質(zhì):使用RIPA裂解液裂解H9c2細(xì)胞,收集細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)定量。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PDVF膜上,用5 % BSA封閉1 h,然后與一抗(GPX4, 1∶1 000,SLC7A11, 1∶1 000,TFR1,1∶1 000,GAPDH, 1∶1 000,)在4 ℃搖床孵育過夜,最后山羊抗兔二抗IgG(1∶5 000)反應(yīng)1 h,通過ECL超敏化學(xué)發(fā)光顯影液曝光蛋白質(zhì)條帶。

1.2.7 DCFH-DA法檢測活性氧(reactive oxygen species, ROS):用熒光探針2’,7’-二氫二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)標(biāo)記H9c2細(xì)胞,DCFH被ROS氧化生成熒光物質(zhì)2’-7’二氯熒光素(2’,7’-dichlorofluorescein,DCF),應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測DCF熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外泌體的表征

BM-MSCs-exos呈圓形形態(tài),直徑約120 nm(圖1A),并表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白TSG101,CD81、CD9 (圖1B);H9c2細(xì)胞可內(nèi)吞BM-MSCs-exos(圖1C)。

A.electron microscopic graphs of the exosomes; B.expression of the exosome marker proteins; C.immunofluorescence image of the exosomes

2.2 外泌體減輕A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

與對照組相比,A/R組細(xì)胞活力和增殖活性顯著降低(P<0.05);與A/R組比較,A/R+ BM-MSCs-exo組細(xì)胞在BM-MSC-exos干預(yù)后,細(xì)胞活力和增殖活性得到顯著增強(P<0.05)(圖2)。

2.3 外泌體抑制A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡

與對照組相比,A/R組心肌細(xì)胞鐵死亡標(biāo)志蛋白GPX4、SLC7A11表達(dá)及GSH含量降低,TFR1蛋白表達(dá)及Fe2+、MDA、ROS水平升高(P<0.05);與A/R組相比,A/R+ BM-MSCs-exo組細(xì)胞在BM-MSC-exos干預(yù)后,GPX4, SLC7A11蛋白表達(dá)及GSH含量升高,TFR1蛋白表達(dá)及Fe2+、MDA、ROS水平升高降低(P<0.05)(圖3)。

A.expression of ferroptosis related proteins; B-D.the levels of Fe2+ ions, MDA and GSH; E.fluorescence intensity of ROS; *P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with A/R group

2.4 外泌體通過細(xì)胞鐵死亡改善心肌細(xì)胞損傷

與A/R+ BM-MSCs-exo組相比,A/R+ BM-MSCs-exo+Erastin組細(xì)胞活力與增殖活性顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A.cell proliferation capacity test; B.CCK-8 assay; *P<0.05 compared with A/R group;#P<0.05 compared with A/R+BM-MSCs-exo group

3 討論

外泌體(exosomes)主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體內(nèi)陷形成的多囊泡體,囊泡外膜經(jīng)與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中介導(dǎo)細(xì)胞通訊。外泌體可通過其攜帶的多種蛋白、核酸、脂類等來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)功能[9-10]。目前越來越多的研究報道證實間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)血管新生和抗凋亡,從而促進(jìn)心肌梗死后的心臟修復(fù)進(jìn)程[11-12]。本研究通過觀察H9c2細(xì)胞內(nèi)吞BM-MSCs-exos后的功能變化,發(fā)現(xiàn)A/R損傷的H9c2細(xì)胞在內(nèi)吞外泌體后細(xì)胞活力和增殖能力得到顯著改善。本研究的實驗結(jié)果與國內(nèi)外報道的相關(guān)文獻(xiàn)一致,外泌體能改善A/R損傷的心肌細(xì)胞功能,但其具體機制有待于進(jìn)一步研究探討。

心肌缺血/再灌注損傷的病理生理機制與氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、鐵死亡(ferroptosis)等密切相關(guān)[13]。其中,鐵死亡是近年來提出的一種新型細(xì)胞死亡方式,被定義為細(xì)胞內(nèi)異常鐵代謝導(dǎo)致的活性氧堆積和脂質(zhì)過氧化引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[14]。研究發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷可引起大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化損傷并死亡,且這種細(xì)胞死亡方式受鐵死亡抑制劑ferrostatin-1影響[15]。由此可知,心肌細(xì)胞鐵死亡在MI/RI進(jìn)程中扮演重要角色。本研究結(jié)果顯示,BM-MSCs來源外泌體在改善H9c2心肌細(xì)胞A/R損傷的同時,發(fā)現(xiàn)鐵死亡標(biāo)志物在細(xì)胞A/R過程中升高,而在外泌體干預(yù)后鐵死亡現(xiàn)象被抑制,佐證了外泌體對H9c2細(xì)胞A/R損傷的保護作用與鐵死亡密切關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步驗證BM-MSCs來源外泌體對A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護作用是通過抑制鐵死亡介導(dǎo),本實驗在BM-MSCs來源外泌體干預(yù)的同時使用Erastin誘導(dǎo)鐵死亡,發(fā)現(xiàn)A/R心肌細(xì)胞的保護作用被顯著逆轉(zhuǎn),推測得到進(jìn)一步證實。

綜上,BM-MSCs來源外泌體可通過抑制細(xì)胞鐵死亡發(fā)揮對H9c2細(xì)胞A/R損傷的保護作用。雖然本實驗研究僅局限于細(xì)胞層面,但相信隨著體內(nèi)實驗的開展以及對分子機制的深入探索,將為臨床上急性心梗及再灌注損傷的間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療提供新的見解。