燕存堯,賈 凱,閆會(huì)轉(zhuǎn),高 杰

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

蕪菁(BrassicarapaL. subsp.rapa),俗名蔓菁、盤菜、恰瑪古等,為十字花科兩年生草本植物,因具有食用、藥用和飼用價(jià)值而被廣泛種植[1]。南疆地區(qū)是蕪菁的主產(chǎn)地,土壤鹽堿度大,而且蕪菁的栽培季節(jié)主要在秋冬季,其在生長(zhǎng)過(guò)程中常受到干旱脅迫、鹽堿脅迫以及冷害等非生物脅迫,從而使得蕪菁產(chǎn)量減少[2-3],因此研究并提高蕪菁的抗逆性具有重要的意義。

脂氧合酶(lipoxygenase)是一種多功能酶[4],目前,在水稻[5]、馬鈴薯[6]、柿[7]、甜瓜[8]、谷子[9]等作物中對(duì)LOX基因功能均進(jìn)行了相關(guān)研究,其廣泛參與種子萌發(fā)、塊根發(fā)育、果實(shí)軟化、香氣形成、色素積累等生理過(guò)程。同時(shí)LOX基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中也發(fā)揮著重要作用,研究發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫和高鹽脅迫下,辣椒CaLOX1在擬南芥中過(guò)表達(dá),增強(qiáng)了植株對(duì)干旱脅迫和高鹽脅迫的耐受性[10]。干旱脅迫下,甜瓜CmLOX10基因在擬南芥中過(guò)表達(dá),增強(qiáng)了植株耐旱性[11]。在高溫脅迫和葉霉病侵染下,抑制番茄TomloxD基因的表達(dá),降低了番茄耐熱性并增加其對(duì)葉霉病的易感性[12]。然而關(guān)于蕪菁BrrLOX基因在蕪菁抗性相關(guān)內(nèi)容尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以蕪菁為研究對(duì)象,從蕪菁中克隆BrrLOX7基因,通過(guò)生物信息學(xué)方法分析BrrLOX7基因的理化性質(zhì)、序列特征和進(jìn)化關(guān)系,利用熒光定量PCR技術(shù)分析蕪菁BrrLOX7基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式,為探究該基因在非生物脅迫中的作用和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以新疆天地禾種業(yè)有限公司生產(chǎn)的“卡瑪古”種子為材料,將種子播種在濕濾紙上,在25 ℃黑暗條件下催芽,2 d后,將萌動(dòng)的種子移栽到基質(zhì)配比草炭∶蛭石∶珍珠巖體積比為2 ∶ 1 ∶ 1的塑料盆中后,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照周期為16 h光照/8 h黑暗,溫度25 ℃白天/20 ℃夜晚,相對(duì)濕度為60%)。在幼苗生長(zhǎng)到4片真葉時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

采用Trizol法(總RNA抽提試劑,上海碧云天生物技術(shù)有限公司),按照說(shuō)明書(shū)操作,提取不同處理的總RNA,利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Quantscript RT Kit,北京天根生化科技有限公司)合成cDNA第一鏈,反應(yīng)體系和程序參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 基因克隆

從BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.cn/#/)下載蕪菁基因組數(shù)據(jù),從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥LOX基因序列,利用TBtools的BLAST工具篩選出位于7號(hào)染色體上的BrrLOX7基因序列。利用Primer Premier5.0軟件參照同源基因序列設(shè)計(jì)特異性引物:

BrrLOX7-F:5′-ATGTTTTGTAAAGAGTCGTCG-3′;

BrrLOX7-R: 5′-TTAGATAGAGACACTGTAGGG-3′。

以蕪菁cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR,利用TIANSeq高保真PCR反應(yīng)預(yù)混液(TIANSeq HiFi Amplification Mix,北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行蕪菁LOX基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的擴(kuò)增,PCR體系為50 μL的標(biāo)準(zhǔn)體系。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 45 s,25個(gè)循環(huán);68 ℃ 5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,利用DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,并將其連接至pMD19-T載體[pMD19-T Vector Cloning Kit,寶生物工程(大連)有限公司]上,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證,陽(yáng)性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

將蕪菁BrrLOX7蛋白序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),利用Blast搜索功能,獲取不同物種的LOX蛋白序列,使用MUSCLE軟件進(jìn)行多序列比對(duì),并使用MEGA-X通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(重復(fù)1 000次),并使用iTOL(https://itol.embl.de/)進(jìn)行美化;蕪菁LOX蛋白序列使用Expassy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行理化性質(zhì)分析;使用SignalP 4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)進(jìn)行信號(hào)肽分析;使用TMHMM 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析;使用Expasy protscale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè);使用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);使用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查看結(jié)構(gòu)域;使用SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析;使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析;使用Plant care(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)LOX啟動(dòng)子上游2 000 bp序列進(jìn)行順式作用元件的分析并利用TBtools進(jìn)行可視化。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

進(jìn)行非生物脅迫處理時(shí),將蕪菁幼苗放置在4 ℃和40 ℃培養(yǎng)箱中模擬低溫和高溫,進(jìn)行干旱脅迫和鹽分脅迫處理時(shí),幼苗葉片背腹面分別噴施20%的PEG6000和200 mmol·L-1的NaCl,以25 ℃常溫栽培并只噴施純水的蕪菁幼苗為對(duì)照組,在處理后24 h采集蕪菁幼苗葉片,迅速置于液氮中保存,每個(gè)處理3個(gè)生物重復(fù)。

根據(jù)已獲得的目的基因序列,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,BrrLOX7-qRTF:5′-GGCATCACAGTCAAATAGTGAACC-3′,BrrLOX7-qRTR:5′-CGAGACCTCTCGACCAACG-3′;以β-actin為內(nèi)參基因,β-actinF:5′-CATGTTCGAGACGTTCAATG-3′,β-actinR:5′-GAACATGTAACCTCTCTCGG-3′。將蕪菁不同處理的cDNA用ddH2O稀釋20倍后作為模板,采用7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)BrrLOX7基因在不同處理中的表達(dá)情況,用內(nèi)參基因檢測(cè)擴(kuò)增效率一致性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系參照說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrrLOX7基因的克隆

利用特異性引物擴(kuò)增BrrLOX7基因的CDS區(qū)域,獲得一條清晰明亮的條帶(圖1),與已知BrrLOX7基因CDS的大小相近,回收目的片段后連入克隆載體送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

M,DL5000 marker;1和2表示BrrLOX7基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M, DL5000 marker; 1 and 2 indicate PCR amplification products of the BrrLOX7 gene.圖1 BrrLOX7反轉(zhuǎn)錄PCRFig.1 RT-PCR of BrrLOX7

2.2 蕪菁BrrLOX7基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蕪菁BrrLOX7氨基酸組成及理化性質(zhì)

測(cè)序結(jié)果顯示,蕪菁BrrLOX7基因CDS序列長(zhǎng)度為2 715 bp,共編碼904個(gè)氨基酸,亮氨酸、谷氨酸、賴氨酸、脯氨酸的使用頻率較高,分別占氨基酸總數(shù)的9.85%、8.30%、6.97%、6.86%(表1)。

表1 BrrLOX7基因編碼蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of the protein encoded by BrrLOX7 gene

蕪菁BrrLOX7蛋白分子式為C4641H7178N1234O1371S28,分子量為103.10 ku,等電點(diǎn)為5.53,脂肪族指數(shù)為81.32,不穩(wěn)定指數(shù)為45.92,屬于不穩(wěn)定蛋白,帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)為136,帶正電荷的殘基(Arg+Lys)為112,無(wú)信號(hào)肽,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。利用WoLF PSORT預(yù)測(cè)BrrLOX7蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示,BrrLOX7蛋白定位于葉綠體中。

2.2.2 BrrLOX7蛋白磷酸化位點(diǎn)和蛋白親水性分析

蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明,BrrLOX7蛋白中含有41個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、24個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和16個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),第837位氨基酸的Score值最高為0.995(圖2)。

圖2 BrrLOX7蛋白編碼磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Phosphorylation site prediction of BrrLOX7 protein

利用Expasy protscale軟件分析BrrLOX7蛋白質(zhì)的親水性和疏水性,第328位的氨基酸殘基的疏水性最強(qiáng)為2.256,第295位的氨基酸殘基的親水性最強(qiáng)為-2.922;另外,在該序列中,親水性氨基酸累計(jì)有614個(gè),疏水性氨基酸累計(jì)有280個(gè),親水性氨基酸的數(shù)目大于疏水性氨基酸的數(shù)目,因此,推測(cè)BrrLOX7蛋白屬于親水性蛋白(圖3)。

圖3 BrrLOX7基因編碼蛋白親水性Fig.3 BrrLOX7 gene encodes a protein with hydrophilicity

2.2.3 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蕪菁BrrLOX7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-折疊組成,其中無(wú)規(guī)則卷曲(41.70%)和α-螺旋(40.27%)的占比最高,β-折疊(5.75%)占比最低(圖4)。使用4wfo.1.A蛋白模型進(jìn)行建模,蕪菁BrrLOX7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與模型的相似性為42.34%,模型覆蓋率為91%(圖5)。

藍(lán)色代表 α-螺旋; 紅色代表延伸鏈; 綠色代表 β-折疊; 紫色代表無(wú)規(guī)則卷曲。Blue for α-helix; red for extended chain; green for β-turn; purple for irregularly curled.圖4 BrrLOX7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Secondary structure of BrrLOX7 protein

圖5 BrrLOX7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure of BrrLOX7 protein

2.2.4 BrrLOX7蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

NCBI CDD預(yù)測(cè)顯示,BrrLOX7蛋白序列包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,PLAT_LH2結(jié)構(gòu)域(位于第86～209位氨基酸)和Lipoxygenase結(jié)構(gòu)域(位于第221～887位氨基酸)。PLAT_LH2結(jié)構(gòu)域和Lipoxygenas結(jié)構(gòu)域是LOX家族基因所特有的,進(jìn)一步說(shuō)明本試驗(yàn)克隆得到的基因?yàn)長(zhǎng)OX基因(圖6)。

圖6 BrrLOX7蛋白序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Structural domain prediction of the BrrLOX7 protein sequence

2.2.5 蕪菁BrrLOX7蛋白的同源性比對(duì)

將蕪菁BrrLOX7蛋白質(zhì)序列提交至NCBI,利用BLASTP搜索功能,獲取了11個(gè)物種的LOX蛋白序列,蛋白多序列比對(duì)結(jié)果表明,BrrLOX7與白菜(XP_009 104 416.3)、蘿卜(XP_018 446 361.1)、鹽芥(XP_024 016 495.1)、擬南芥(CAA0384539.1)4種同科物種的序列同源性分別為100%、91.59%、86.92%、81.01%,與桃(XP_007 220 253.2)、甜瓜(NP_001 315 400.1)、蘋(píng)果(RXH94122.1)、黃瓜(XP_004 142 135.2)、辣椒(PHT59204.1)、馬鈴薯(NP_001 274 843.1)、葡萄(XP_034 705 038.1)7種非同科物種的序列同源性分別為63.02%、62.07%、62.07%、61.82%、61.14%、61.09%、56.84%(圖7)。進(jìn)一步利用MEGA-X構(gòu)建BrrLOX7蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),其結(jié)果表明,BrrLOX7與芥菜親緣關(guān)系最近,與桃和蘋(píng)果親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖8)。

圖7 蕪菁與其他植物BrrLOX7蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.7 Comparison of amino acid sequence of BrrLOX7 protein in turnip and other plants

圖8 蕪菁BrrLOX7蛋白與其他植物相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of turnip BrrLOX7 protein and other plant-related protein sequences

2.2.6 蕪菁BrrLOX7基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

使用TBtools軟件提取蕪菁基因組中BrrLOX7上游2 000 bp啟動(dòng)子序列并提交至Plantcare在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)可能的順式作用元件(圖9)。結(jié)果顯示,在啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了13種(108個(gè))順式作用元件,除核心啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box外,還存在脫落酸誘導(dǎo)順式作用元件ABRE,晝夜節(jié)律順式作用元件Circadian,參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)元件02-site,光響應(yīng)元件TCT-motif、G-box、GATA-motif、Box 4,參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件TC-rich repeats,無(wú)氧誘導(dǎo)元件ARE和順式調(diào)節(jié)元件A-box。

圖9 蕪菁BrrLOX7基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of cis-acting elements of the BrrLOX7 gene promoter in turnip

2.2.7BrrLOX7基因在不同非生物脅迫下的差異表達(dá)

為檢測(cè)BrrLOX7基因在4種逆境脅迫下的表達(dá)特性,以4葉期蕪菁為材料,提取不同脅迫處理下的蕪菁葉片總RNA,以反轉(zhuǎn)錄稀釋后的cDNA為模板,進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖10所示,BrrLOX7基因在4種脅迫處理下均有響應(yīng),但表達(dá)量存在一定差異,在高溫處理下BrrLOX7基因表達(dá)量較高,鹽脅迫和低溫居中,在低溫處理下表達(dá)量增加的最少。

圖10 蕪菁BrrLOX7基因在非生物脅迫下的表達(dá)Fig.10 Expression of the BrrLOX7 gene in turnip under abiotic stress

3 討論

本試驗(yàn)從蕪菁中克隆得到BrrLOX7基因,該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 715 bp,預(yù)測(cè)其分子量為103.10 ku,等電點(diǎn)為5.53,高于蘋(píng)果MdLOX1a基因的分子量97.69 ku和等電點(diǎn)5.14[13],同時(shí)小于薄皮甜瓜CmLOX08基因的分子量104.93 ku和等電點(diǎn)8.44[14]。在BrrLOX7蛋白磷酸化位點(diǎn)的分析中,預(yù)測(cè)到41個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),24個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和16個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),這些磷酸化位點(diǎn)可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮著重要作用[15]。預(yù)測(cè)的BrrLOX7蛋白無(wú)信號(hào)肽,不具有跨膜結(jié)構(gòu),說(shuō)明該基因編碼的蛋白不屬于分泌蛋白,這一結(jié)果在小白杏PaLOX中也有發(fā)現(xiàn)[16],將BrrLOX7與11個(gè)物種的同源序列進(jìn)行多序列比較和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),蕪菁的BrrLOX7基因與芥菜和蘿卜同科作物的遺傳距離較近,說(shuō)明該基因在種屬進(jìn)化中具有高度保守性。NCBI CDD的結(jié)果顯示,BrrLOX7蛋白含有脂氧合酶家族特有的PLAT_LH2結(jié)構(gòu)域和Lipoxygenas結(jié)構(gòu)域,前人研究發(fā)現(xiàn),PLAT_LH2結(jié)構(gòu)域在酶的催化和膜脂結(jié)合能力中發(fā)揮作用[17],Lipoxygenas結(jié)構(gòu)域中,由組氨酸(His)組成的高度保守的38氨基酸殘基區(qū)域[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His]在LOX與鐵離子結(jié)合發(fā)揮酶穩(wěn)定性和活性中發(fā)揮作用[18]。我們對(duì)BrrLOX7基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,BrrLOX7基因主要定位于葉綠體。這一結(jié)果與擬南芥的AtLOX2[19],馬鈴薯LOXH1和LOXH3[20],甜瓜的CmLOX13蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[21],因此,BrrLOX7基因可能在葉綠體中發(fā)揮著重要作用。

Ju等[22]利用Plant CARE軟件在甜瓜CmLOX09啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到激素響應(yīng)元件、應(yīng)激響應(yīng)元件和信號(hào)類物質(zhì),并以此為突破口,探究了CmLOX09基因?qū)δ婢场⒓に睾托盘?hào)類物質(zhì)的響應(yīng),結(jié)果表明,CmLOX09基因通過(guò)氫過(guò)氧化物裂解酶(HPL)途徑產(chǎn)生的綠葉揮發(fā)物(GLV)來(lái)響MeJA,并通過(guò)丙二烯合酶(AOS)途徑產(chǎn)生的茉莉酸來(lái)響應(yīng)真菌脅迫。在本研究中,通過(guò)對(duì)BrrLOX7基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了脫落酸響應(yīng)元件和防御脅迫應(yīng)答元件,推測(cè)BrrLOX7基因可能通過(guò)調(diào)控脫落酸等植物激素參與了植物逆境脅迫響應(yīng)。這為今后繼續(xù)深入研究蕪菁BrrLOX7基因的表達(dá)調(diào)控及防御脅迫響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中,時(shí)常會(huì)受到干旱和鹽害等非生物脅迫的影響,導(dǎo)致作物的生長(zhǎng)發(fā)育受阻,因此植物需通過(guò)響應(yīng)并適應(yīng)脅迫而正常生長(zhǎng),當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí),通過(guò)誘導(dǎo)脂氧合酶基因的表達(dá)提高植物抗性已有許多文獻(xiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn),在高溫處理下,番茄TomLOXC基因超表達(dá)植株通過(guò)JA積累來(lái)調(diào)節(jié)植株的抗性[23]。在干旱脅迫和鹽脅迫處理下,甜瓜CmLOX08基因通過(guò)提高植株的LOX活性、脅迫基因表達(dá)水平和清除活性氧能力,增強(qiáng)了植物的抗旱和抗鹽性[14]。在干旱脅迫下,甜瓜CmLOX13在擬南芥中過(guò)表達(dá),通過(guò)降低分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)和ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,提高了抗旱能力[21]。在本研究中,BrrLOX7基因在NaCl、高溫、低溫、干旱中均有應(yīng)答,暗示該基因可能在蕪菁抗逆生長(zhǎng)中扮演重要的角色。

本研究從蕪菁中克隆得到了BrrLOX7基因序列,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性分析,初步確定BrrLOX7基因在蕪菁響應(yīng)不同非生物脅迫中發(fā)揮功能,為后續(xù)深入探究BrrLOX7基因在蕪菁中的功能奠定了基礎(chǔ)。