周鶴林 黎琪 寇德會(huì)

摘要：為研究在人類活動(dòng)和水流運(yùn)動(dòng)影響下的長(zhǎng)江微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，選取長(zhǎng)江廈嘉睦江在重慶城區(qū)的河段為研究對(duì)象，采用16S rRNA高通量測(cè)序QPCR技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：研究河段的細(xì)菌總數(shù)為5.22×10-1.38×10 copies/mL。長(zhǎng)江和嘉陵江細(xì)菌群落在門水平上群落組分差異不大，但嘉陵江細(xì)菌群落多樣性與豐富度較低。廢水排放與流態(tài)變化對(duì)水質(zhì)、細(xì)菌群落多樣性指數(shù)、細(xì)菌總數(shù)均沒有顯著影響。但是污水廠排水對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，引起Sporichthyaceae顯著增加和Burkholderiaceae顯著減少。研究河段細(xì)菌群落具有豐富的降解外源物質(zhì)的功能基因，污水廠排水井未導(dǎo)致該類功能基因數(shù)量的變化。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)江；嘉睦江；城市河流；細(xì)菌群落；功能基因

中圖分類號(hào)：X171 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

前言

細(xì)菌在水體中降解轉(zhuǎn)化污染物，改善水體環(huán)境，同時(shí)水環(huán)境變化變化會(huì)對(duì)菌群的構(gòu)成和多樣性造成影響。因此細(xì)菌群落組成常被用作監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)一個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)健康與否的標(biāo)準(zhǔn)。

長(zhǎng)江流域是中國(guó)重要的水資源，沿岸污水的排人會(huì)引相關(guān)水質(zhì)參數(shù)的變化，可能導(dǎo)致菌群的改變。水體自凈作用中的物理凈化、懸浮顆粒的吸附與河流水動(dòng)力特性有關(guān)，因此流態(tài)變化可能導(dǎo)致水質(zhì)和菌群改變。此外，研究發(fā)現(xiàn)污水廠排水是河流致病菌的重要來(lái)源。對(duì)國(guó)內(nèi)外多條河流的致病菌調(diào)查顯示，污水廠排水增加了受納水體中多種致病菌的豐度。長(zhǎng)江、嘉陵江兩岸人口密集，排污量大，兩江的菌群穩(wěn)定性關(guān)系到該區(qū)域的水環(huán)境質(zhì)量。目前對(duì)長(zhǎng)江微生物群落的研究?jī)?nèi)容主要針對(duì)特定區(qū)域微生物群落的構(gòu)成和分布特征，對(duì)于人類活動(dòng)和水流運(yùn)動(dòng)的影響研究較少。

研究于2019年8月下旬在長(zhǎng)江和嘉陵江部分河段采樣，基于16S rRNA高通量測(cè)序和QPCR技術(shù)，分析水體細(xì)菌群落特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系，探究水流運(yùn)動(dòng)和污水廠排水影響下菌群的變化；借助PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析，研究細(xì)菌群落功能基因的構(gòu)成，為評(píng)估長(zhǎng)江水生態(tài)狀況和合理規(guī)劃人類活動(dòng)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)域樣品采集與水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定

2019年8月22日在重慶城區(qū)長(zhǎng)江與嘉陵江匯合河段至雞冠石污水廠下游共設(shè)置11個(gè)采樣點(diǎn)，如圖1所示。雞冠石污水廠是重慶市最大、全國(guó)第五大污水廠，日處理能力為80萬(wàn)噸，污水處理量占重慶主城污水處理量的55%。在每個(gè)采樣點(diǎn)采集2L表層水體，其中1L用于高通量測(cè)序，1L用于水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定。采樣現(xiàn)場(chǎng)記錄水溫和采樣點(diǎn)坐標(biāo)，同時(shí)，使用ST300D型便攜式溶解氧儀檢測(cè)溶解氧（DO），PHB-4型便攜式pH計(jì)檢測(cè)pH。水樣采集后冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理分析。1L水樣經(jīng)孔徑為0.22 um的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾，濾膜在-20℃下冷凍保存。總氮（TN）、總磷（TP）和化學(xué)需氧量（COD）按《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）進(jìn)行檢測(cè)。采用tecplot軟件對(duì)河段流場(chǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬得出各采樣點(diǎn)流速。

1.2樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

濾膜樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用FastDNASPINkitforsoil（MPBiomedicals，USA）試劑盒提取樣本DNA。DNA完整性檢測(cè)使用1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA濃度、純度檢測(cè)均采用NanoDrop2000（ThermoFisherScientific，USA）.送檢的樣本經(jīng)檢驗(yàn)滿足：有明顯條帶，且清晰完整，無(wú)降解；OD260/280在1.58-2.08之間。采用細(xì)菌通用引物338F-806R對(duì)16SrRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 uL，其中含：5×FastPFuBuffer4 uL，2.5 mMdNTPs2 uL，正反向引物各0.8 VL（5 uM），F(xiàn)astPFu聚合酶0.4 uL，牛血清蛋白（BSA）0.2 uL，模板DNA10 ng，用雙蒸水補(bǔ)至20 uL。采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的MiSeqPE300測(cè)序儀（Illuminalne，SanDiego，CA，USA）進(jìn)行序列測(cè)定。原始數(shù)據(jù)已上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）序列讀取存檔（sequence read arcruve，SRA），數(shù)據(jù)所屬登錄號(hào)為：PRJNA663032。

1.3測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)，然后在97%相似度下用Usearch（verSlon7.0）進(jìn)行OTU聚類，并將OTU代表序列比對(duì)SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132，http：//www.arb-silva.de）進(jìn)行物種分類學(xué)分析。利用Mothur（Versionl.30.1）計(jì)算樣本的a多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、ACE、Chaol和Coverage）。采用QUME計(jì)算樣本的unweightedUniFrac多樣性矩陣，然后用R語(yǔ)言繪制PCoA圖，ANOSIM分析檢驗(yàn)組間差異顯著性。為探究細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系，利用R語(yǔ)言進(jìn)行冗余分析（RedundancyAnalysis，RDA）。功能預(yù)測(cè)采用PICRUSt軟件進(jìn)行分析，將OTU表與KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得功能預(yù)測(cè)信息，具體分析步驟基于在線分析平臺(tái)（http：//pioust.github.io/picrust/）。

1.4細(xì)菌總數(shù)qPCR定量

細(xì)菌總數(shù)通過(guò)qPCR進(jìn)行計(jì)數(shù)，總細(xì)菌數(shù)的DNA片段擴(kuò)增使用正向引物1369F：5-CGGTGAATACGT-TCYCGG-3，反向引物1492R：5-GGWTACCITGT-TACGACW -3，退火溫度為55℃。qPCR反應(yīng)采用三個(gè)平行樣，每個(gè)反應(yīng)體系為10 uL，包括5uL的2×PremixExTaq，200 nM每種引物，0.1 uL的50 xROX作為參照染料以及1 uL的DNA模板?？瞻讓?duì)照包含所有相同的反應(yīng)試劑，但是用1 uL的無(wú)菌水替代DNA模板。制備DNA標(biāo)準(zhǔn)品每次上樣同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線（r2>0.99）。記錄標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增效率，每次擴(kuò)增效率相似，為91%-99%，具體數(shù)值取決于實(shí)際試驗(yàn)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

利用IBMSPSSStatistics26進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)不符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1水體理化指標(biāo)分析

各采樣點(diǎn)水質(zhì)理化參數(shù)如表1所示。各水質(zhì)參數(shù)隨采樣點(diǎn)位置不同而有所差異，水溫的變化可能主要來(lái)自于采樣時(shí)間的不同（采樣時(shí)間跨度為早上到下午）。pH較為穩(wěn)定?？偟獫舛容^高，總磷濃度低。COD的最高值出現(xiàn)在長(zhǎng)江和嘉陵江未匯合前，隨著二者的匯合，COD下降了49%，這可能是由于水量的增大稀釋了COD濃度。COD在S5、S7和S8均出現(xiàn)升高，前者可能是由于污水廠的排水，后兩者可能由于河道的突然變窄，而后隨著水流，COD值總體呈下降趨勢(shì)。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，污水廠上下游的水質(zhì)參數(shù)不存在顯著差異（p>0.05）。一些采樣點(diǎn)（S7、S9）的流速較低（0.2m/s左右），但并未出現(xiàn)有機(jī)物和營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度高值。近年來(lái)，氮磷，尤其是磷，已成為影響長(zhǎng)江水質(zhì)的主要污染物質(zhì)。而在研究河段，除了總氮的濃度較高外，其它水質(zhì)參數(shù)均達(dá)到Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析

11個(gè)樣品共得到617 952條高質(zhì)量序列，每個(gè)樣品32 858～74 136條序列。依據(jù)97%相似度劃分，共得到1 278條OTUs，每個(gè)樣品的OTU數(shù)目為644-897。通過(guò)評(píng)估各樣品的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)（如表2所示），表明嘉陵江（S2）水體中細(xì)菌群落多樣性（Shannon指數(shù)：3.44）和豐富度（Chaol指數(shù)：643.04）都低于長(zhǎng)江水體（除S2號(hào)點(diǎn)以外的10個(gè)樣本點(diǎn)）細(xì)菌群落的多樣性（Shannon指數(shù)：4.31-4.72）和豐富度（Chaol指數(shù)：942.52-1 172.60）。長(zhǎng)江水體的細(xì)菌群落多樣性（Shannon指數(shù)：0.56-5.42）和豐富度（Chaol指數(shù)：137-12 601）在較大范圍變動(dòng)，該河段的細(xì)菌群落多樣性和豐富度較為穩(wěn)定。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，污水廠上下游水體的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)不存在顯著性差異（p>0.05），各流態(tài)、流速不同的采樣點(diǎn)細(xì)菌群落多樣性指數(shù)也不存在顯著性差異（p>0.05）。

2.3細(xì)菌群落組成分析

長(zhǎng)江水體中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類有：放線菌門（Actinobactena，41.02%-54.15%）、變形菌門（Proteobacteria，22.51%-35.18%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，9.56%-14.60%）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobactena，4.70%-13.30%）（如圖2所示）。嘉陵江水體中細(xì)菌群落構(gòu)成與長(zhǎng)江水體相似，差異在于放線菌所占比例更高（68.78%）。這些細(xì)菌都是河湖等淡水水體中的典型細(xì)菌，長(zhǎng)江和嘉陵江的細(xì)菌群落已被發(fā)現(xiàn)主要由這些細(xì)菌門類以及厚壁菌門（Firmicutes）構(gòu)成，但各門類的比例隨采樣時(shí)間和位置存在差異。

2.4細(xì)菌群落構(gòu)成相似性分析

利用PCoA分析各樣本的細(xì)菌群落構(gòu)成相似度（如圖3所示）。對(duì)雞冠石污水廠排水口上下游樣品進(jìn)行分組，上游S1、S3、S4為Gl組，下游S5至S11為G2組。PCoA分析表明，G2組樣品（S5-S11）成聚集狀態(tài)，說(shuō)明G2組各樣本的細(xì)菌群落構(gòu)成較為相似，不受流速、流態(tài)變化的影響。Gl組S2和S3聚集，而S1與S2、S3較為分散，可能是因?yàn)镾l在嘉陵江匯人前，S2、S3在嘉陵江匯入后，嘉陵江的匯人引起了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)ANOSIM相似性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，污水廠排水口上下游的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（p<0.05）。沈杰等也研究發(fā)現(xiàn)污水廠上下游的微生物群落構(gòu)成存在顯著性差異，表明污水廠排水對(duì)河流微生物群落有影響。

2.5細(xì)菌群落構(gòu)成與環(huán)境園子關(guān)系

應(yīng)用RDA分析細(xì)菌群落構(gòu)成與環(huán)境因子的關(guān)系（如圖4所示）。結(jié)果表明，對(duì)研究河段細(xì)菌群落影響最大的環(huán)境因子是pH，其次是COD，然后是溫度，總磷（TP）對(duì)細(xì)菌群落的影響最小。pH與COD、溫度呈負(fù)相關(guān)，COD與溫度呈正相關(guān)。放線菌門（Actinobacteria）與水溫、流速和COD呈正相關(guān)關(guān)系，與TP、DO、pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）與pH、DO、TP正相關(guān)，與COD、流速、水溫負(fù)相關(guān)。藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）與COD、pH、DO呈正相關(guān)關(guān)系，與TP、TN、水溫、流速負(fù)相關(guān)。河流微生物群落受到氣候、水文、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等眾多環(huán)境因子的共同影響。研究沒有水文氣象條件變化，主要分析水質(zhì)指標(biāo)對(duì)河流微生物群落的影響。

2.6顯著性差異物種分析

對(duì)雞冠石污水廠上下游豐度差異顯著的物種進(jìn)行分析。在科分類水平上，共有2個(gè)科的細(xì)菌存在顯著豐度差異，主要為孢魚菌科（Sporichthyaceae）和伯克氏菌科（Burkholderiaceae）。相比污水廠上游，Sporichthyaceae在污水廠下游顯著增加，而Burkholderiaceae顯著減少。Sporichthyaceae屬于放線菌，研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)降解顆粒有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)，能夠在不利條件下生存，同時(shí)對(duì)環(huán)境的變化有很好的適應(yīng)能力。Burkholderiaceae屬于變形菌，包括了很多的人類和動(dòng)物致病菌以及條件致病菌。

2.7功能基因預(yù)測(cè)分析

利用PICRUSt預(yù)測(cè)的各樣品KEGG通路包括代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境信息處理等幾個(gè)功能組。其中，代謝通路所占比例最高（69.5%71.2%）。代謝通路中外源物質(zhì)的降解和代謝功能基因與細(xì)菌對(duì)污染物的降解有關(guān)，所有樣品具有的該類別功能基因中基因數(shù)最高的包括苯甲酸鹽（Benzoate降解基因、氨基苯甲酸鹽（Aminobenzoate）降解基因、己內(nèi)酰胺（Caprolactam）降解基因以及氯代烷烴（Chloroalkane）和氯代烯烴（Chloroalkene）降解基因。各樣品相比較，嘉陵江細(xì)菌群落（S2）具有的降解和代謝外源物質(zhì)的功能基因數(shù)最多。結(jié)果表明，除了阿特拉津（Atrazine）和DDT降解基因外，其它各外源物質(zhì)降解代謝基因的相對(duì)豐度均為嘉陵江細(xì)菌群落（S2）最高。污水廠下游除了S7的污染物降解功能基因相對(duì)豐度較高外，沒有發(fā)現(xiàn)污染物降解基因的明顯富集。有研究發(fā)現(xiàn)，有毒化學(xué)物質(zhì)的存在會(huì)增加微生物的代謝酶和代謝路徑。但是，污染物降解功能基因豐度和污染物濃度的關(guān)系還尚不明確，需要進(jìn)一步的研究。

3結(jié)語(yǔ)

嘉陵江和長(zhǎng)江水體均具有豐富的浮游細(xì)菌，細(xì)菌總數(shù)達(dá)到5.22×10-1.38×10 copies/mL，細(xì)菌群落構(gòu)成主要包括放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門。嘉陵江菌群豐富度和多樣性低于長(zhǎng)江，但放線菌在菌群構(gòu)成中具有更高的比例。污水廠排水對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)造成了顯著影響，引起Sporichthyaceae顯著增加和Burkholderiaceae顯著減少。河流流速、流態(tài)變化并未引起水質(zhì)、菌群多樣性指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌總數(shù)的顯著變化，表明細(xì)菌群落不受水流運(yùn)動(dòng)的影響。影響研究河段細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子有pH、COD和水溫。PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析表明，嘉陵江細(xì)菌群落具有最多的外源物質(zhì)降解和代謝功能基因，對(duì)于大部分外源物質(zhì)，其降解和代謝的功能基因的相對(duì)豐度也最高。污水廠排水并未導(dǎo)致該類功能基因的富集。