曲遠(yuǎn)航 劉天聰 鹿秀云 李社增 郭慶港 馬平

摘要：【目的】評價菌糠對棉花黃萎病的防治效果（防效），明確菌糠對棉花根際微生物群落的影響?！痉椒ā客ㄟ^溫室盆栽試驗及田間小區(qū)試驗評價香菇菌糠對棉花黃萎病的防效；利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測棉花根際大麗輪枝菌數(shù)量；利用宏基因組測序及生物信息學(xué)分析棉花根際微生物群落和功能基因組成?！窘Y(jié)果】土壤中添加2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的菌糠對棉花黃萎病的溫室防效達(dá)到76.8%。添加菌糠后棉花根際大麗輪枝菌數(shù)量較空白對照減少81.02%。添加菌糠后棉花根際微生物中微桿菌屬（Microbacterium spp.）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium spp.）、梨形孢屬（Serendipita spp.）、毛殼菌屬（Chaetomium spp.）等有益微生物豐度顯著上升；同時，添加菌糠還改變了棉花根際細(xì)菌和真菌的共現(xiàn)模式，在提高細(xì)菌物種間關(guān)聯(lián)性的同時降低真菌物種間關(guān)聯(lián)性。利用京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫功能注釋發(fā)現(xiàn)，菌糠處理后棉花根際微生物ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ko02010）、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（ko02020）、群體感應(yīng)（ko02024）等涉及細(xì)菌信號識別和定植的基因相對豐度顯著提高。在河北和新疆，菌糠對棉花黃萎病的田間防效最高分別為36.84%和43.98%?！窘Y(jié)論】菌糠能夠有效防治棉花黃萎病并降低棉花根際大麗輪枝菌數(shù)量，同時可改變棉花根際微生物群落和功能基因組成。

關(guān)鍵詞：菌糠；大麗輪枝菌；棉花黃萎??；根際微生物；宏基因組

Effects of spent mushroom substrate on cotton Verticillium wilt and the cotton rhizosphere microbiome

Qu Yuanhang1， 2， Liu Tiancong1， 2， Lu Xiuyun1， Li Shezeng1， Guo Qinggang1*， Ma Ping1

（1. Institute of Plant Protection， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Integrated Pest Management Innovation Center of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Baoding， Hebei 071000， China; 2. College of Plant Protection， Agricultural University of Hebei， Baoding， Hebei 071000， China）

Abstract： [Objective]? The objective of this study is to evaluate the control effect of spent Lentinus edodes substrate （SMS） on cotton Verticillium wilt and to clarify the effect of SMS on microbial community of cotton rhizosphere. [Method] The control effect of SMS on cotton Verticillium wilt was evaluated by pot and plot experiments under greenhouse and field condition. The population of Verticillium dahliae WX-1 in cotton rhizosphere was quantified by real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction. The microbiome and functional genes composition in cotton rhizosphere were analyzed by metagenomic sequencing and bioinformatics method. [Result] Soil amended with 2% （mass fraction） SMS could successfully suppress cotton Verticillium wilt， and the greenhouse control effect of SMS on cotton Verticillium wilt was 76.8%. The population of V. dahliae WX-1 in cotton rhizosphere amended with SMS decreased by 81.02% compared with the blank control. The abundances of beneficial microorganisms such as Microbacterium spp.， Mesorhizobium spp.， Serendipita spp.， Chaetomium spp. were significantly increased. Meanwhile， the co-occurrence pattern of bacteria and fungi was also changed in the SMS treatment， and the interspecific association of bacteria was increased while the interspecific association of fungi was decreased. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） functional annotation showed that the relative abundance of ABC transporter （ko02010）， two-component regulatory system （ko02020）， and quorum sensing （ko02024） genes involved in bacterial signal recognition and colonization of cotton rhizosphere microorganisms were significantly increased after SMS treatment. In Hebei and Xinjiang， the highest field control effect of SMS on cotton Verticillium wilt was 36.84% and 43.98%， respectively. [Conclusion] SMS can effectively control cotton Verticillium wilt and decrease the population of V. dahliae in the cotton rhizosphere， and change the microbiome and functional gene composition.

Keywords： spent mushroom substrate; Verticillium dahliae; cotton Verticillium wilt; rhizosphere microbiome; metagenomic

由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的土傳病害之一。目前生產(chǎn)上抗黃萎病棉花品種缺乏，且抗性不穩(wěn)定，加之在沒有寄主的情況下大麗輪枝菌能夠以微菌核的形式在土壤中存活15年之久[1]；因此，通過使用抗病品種和輪作等措施仍然難以有效防治黃萎病，導(dǎo)致黃萎病在我國主產(chǎn)棉區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，亟需研發(fā)有效的防治措施。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤中添加生物有機(jī)質(zhì)能防治作物黃萎病。生物炭是一種作為土壤改良劑的木炭，能促進(jìn)植物的生長，并提高其抗逆能力。Ogundeji等[2]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭對茄子（Solanum melongena）黃萎病防效超過70%，且根際細(xì)菌多樣性和豐度均顯著提高，有益微生物如芽孢桿菌（Bacillus spp.）、毛殼菌（Chaetomium spp.）等在茄子根際得到富集。西藍(lán)花殘體粉碎后還田能有效防治生菜、馬鈴薯和棉花黃萎病，異硫氰酸鹽及其水解產(chǎn)物氫氰酸是西藍(lán)花殘體分解過程中產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)[3]；此外，西藍(lán)花殘體還田能增加作物根際有益菌鏈霉菌（Streptomyces spp.）和芽孢桿菌的豐度[4]。利用作物秸稈或動物糞便堆肥后的生物有機(jī)肥同樣能增強(qiáng)土壤生物酶活性，改善土壤微生物區(qū)系，防治作物黃萎病[5-6]。

菌糠是種植食用菌后剩余的廢料，我國每年生產(chǎn)食用菌后約有菌糠2億t。菌糠作為農(nóng)業(yè)廢棄物如果不加利用隨意堆放將造成資源浪費和環(huán)境污染。因此，菌糠的回收和科學(xué)利用是目前食用菌生產(chǎn)中迫切需要解決的問題，科學(xué)有效利用菌糠具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。菌糠富含有機(jī)物及礦質(zhì)元素、有毒元素少、結(jié)構(gòu)疏松、保水能力強(qiáng)，是一種良好的土壤處理劑[7]。另外，菌糠富含食用菌菌絲體及其代謝產(chǎn)物，使其具有多種與微生物互作相關(guān)的生物學(xué)特性[8]。國內(nèi)外研究證明，土壤中添加菌糠能有效防治尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的作物枯萎病。菌糠能增加作物根際有益微生物數(shù)量，降低病原菌數(shù)量，從而達(dá)到控制病害、促進(jìn)作物生長的效果[9-10]。然而，目前有關(guān)菌糠防治作物黃萎病的報道甚少。本研究通過溫室盆栽試驗和田間小區(qū)試驗，評價土壤添加菌糠對棉花黃萎病的防治效果，并對棉花根際土壤進(jìn)行宏基因組分析，從生態(tài)學(xué)角度解析菌糠防治棉花黃萎病的機(jī)理，為菌糠的科學(xué)利用以及棉花黃萎病的綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用棉花品種為感黃萎病品種“鄂荊1號”，大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株WX-1由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實驗室提供。所用土壤收集自棉花連作地塊。香菇（Lentinus edodes）菌糠（spent mushroom substrate， SMS）收集自河北阜平食用菌廠，菌糠自然風(fēng)干后粉碎至粒徑約150 μm備用。

1.2 病原菌接種液的制備

WX-1在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB；含馬鈴薯200 g·L－1，葡萄糖20 g·L－1）中，25 ℃、180 r·min－1下培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)液經(jīng)4層紗布過濾，濾液在4 ℃、10 000 r·min－1條件下離心20 min，去除上清液后用無菌水重懸孢子并調(diào)整孢子含量至1×107 mL－1。

1.3 菌糠對大麗輪枝菌WX-1的影響

為了分析菌糠對WX-1的抑制作用，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA；主要成分：馬鈴薯200 g·L－1，葡萄糖20 g·L－1，瓊脂15 g·L－1）和PDB培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的菌糠粉（121 ℃滅菌15 min）。取5 μL WX-1孢子懸浮液（孢子含量為1×107 mL－1，下同）接種于添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)菌糠粉的PDA培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中間，25 ℃黑暗培養(yǎng)20 d，測量菌落直徑。按照1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的接種量將WX-1孢子懸浮液接種于添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)菌糠粉的PDB培養(yǎng)液中，25 ℃、180 r·min－1黑暗培養(yǎng)6 d，利用血球計數(shù)板測量孢子含量。評價菌糠粉對WX-1微菌核形成的影響，在Buffered Minimal Methanol （BMM）培養(yǎng)基（主要成分：5 g·L－1葡萄糖、0.2 g·L－1 NaNO3、0.52 g·L－1 KCl、1.52 g·L－1 KH2PO4、0.52 g·L－1 MgSO4·7H2O、3 μmol·L－1維生素B1、0.1 μmol·L－1維生素B7；pH＝8.5）中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的菌糠粉（121 ℃滅菌15 min），在含有菌糠粉的BMM培養(yǎng)皿上鋪1層微孔濾膜（孔徑0.2 μm），然后將WX-1孢子懸浮液（100 μL）均勻涂布在濾膜上，25 ℃黑暗培養(yǎng)14 d，利用顯微鏡觀察菌糠粉對WX-1微菌核形成的影響，記錄每個視野下微菌核數(shù)量。以上每個處理設(shè)3個重復(fù)，以不添加菌糠粉的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.4 菌糠對棉花黃萎病的影響

通過溫室盆栽試驗評估菌糠對棉花黃萎病的防治效果（防效，control effect， CE）。將2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）菌糠粉與土壤充分混勻，裝入書式育苗盒中。棉種表面消毒后于25 ℃催芽，每孔播種2粒露白的棉花種子。育苗盒于溫室（白天30 ℃，夜間20 ℃）中培養(yǎng)，待出苗后僅保留1株長勢一致的幼苗。以土壤中未添加菌糠的處理為空白對照。棉苗長至2葉1心時，采用切根蘸孢子懸浮液的方法接種大麗輪枝菌[11]。接菌后棉苗繼續(xù)在溫室中培養(yǎng)，接菌后21 d調(diào)查植株發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)（disease index， DI）。計算公式：DI＝∑（n×d）/（N×4）×100。式中，n代表各級病株數(shù)，d代表相應(yīng)病級值，N代表總株數(shù)。分級標(biāo)準(zhǔn)[12]如下：0級為植株無癥狀表現(xiàn)；1級為1～2片真葉發(fā)病；2級為3～4片真葉發(fā)病；3級為4片以上真葉發(fā)病或脫落；4級為全株枯死。根據(jù)病情指數(shù)計算菌糠處理對棉花黃萎病的防效。計算公式：CE（%）＝（DI0－DI1）/ DI0×100。式中，DI0代表空白對照的病情指數(shù)，DI1代表菌糠處理的病情指數(shù)。

1.5 宏基因組分析

接種病原菌后28 d，打開書式育苗盒并將棉花從中輕輕取出，抖掉根圍土后，用毛刷仔細(xì)將緊密吸附在根表的根際土刷落并收集。收集到的根際土過孔徑280 μm（50目）篩，去除根及其他植物組織，立即凍存于－80 ℃，以備提取土壤DNA。

使用FastDNATM SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals， Solon， OH， USA）試劑盒提取根際土壤總DNA。使用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham， MA， USA）測定DNA的質(zhì)量濃度和質(zhì)量。宏基因組測序和生物信息分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用高通量測序儀HiSeq○R? 2000 System（Illumina，美國）完成。每個樣品設(shè)6個生物學(xué)重復(fù)。

空白對照和菌糠處理的棉花根際群落結(jié)構(gòu)使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology，version 1.9.1）計算距離矩陣（基于Bray-Curtis算法），再使用R軟件（version 3.2.1）中vegan包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis， PCoA）。使用DIAMOND（https：//github.com/bbuchfink/diamond）將非冗余基因集與非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（non-redundant protein sequence database， NR）在京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）中進(jìn)行比對并注釋，獲得物種或功能基因注釋信息，然后使用對應(yīng)的基因豐度總和計算該物種或功能基因豐度，在門、屬、直系同源物和代謝通路水平上統(tǒng)計非冗余基因集在各個樣品中的豐度，構(gòu)建相應(yīng)分類水平上的豐度表，并利用R軟件作圖。

通過Cytoscape平臺的CoNet計算根際微生物的相關(guān)性和相似性，構(gòu)建細(xì)菌和真菌群落的共現(xiàn)模式。相關(guān)分析采用皮爾遜和斯皮爾曼數(shù)值為衡量標(biāo)準(zhǔn)，微生物不同屬之間利用Bray-Curtis和Kullback-Leibler數(shù)值衡量不相似性。當(dāng)相關(guān)系數(shù)高于0.8且P＜0.01時，認(rèn)為分類群之間存在統(tǒng)計學(xué)上具有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系的共現(xiàn)模式。使用Brownian法將6次測量的P值合并，然后使用Benjamini-Hochberg程序進(jìn)行調(diào)整，以減少獲得假陽性結(jié)果的概率。使用Gephi軟件對共現(xiàn)模式進(jìn)行可視化，以節(jié)點代表微生物組網(wǎng)絡(luò)中的單個微生物分類群（屬），網(wǎng)絡(luò)邊線表示節(jié)點之間的成對相關(guān)性，表明在生物學(xué)上有意義的相互作用。使用Cytoscape平臺的MCODE對微生物網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣鬟M(jìn)行評估，包括節(jié)點數(shù)（number of nodes， NN）、總邊數(shù)（total number of edges， TE）、正相關(guān)邊的比例（proportion of positive edges， PE）、負(fù)相關(guān)邊的比例（proportion of negative edges， NE）、平均度（average degree， AD）、平均路徑長度（average path length， APL）、網(wǎng)絡(luò)直徑（network diameter， ND）、平均聚類系數(shù)（average clustering coefficient， ACC）和模塊化（modularity， MO）。

1.6 根際土中大麗輪枝菌定量檢測

使用FastDNATM SPIN Kit for Soil試劑盒提取土壤DNA，通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction， RT-PCR）技術(shù)定量檢測棉花根際土中WX-1含量[13]。利用大麗輪枝菌特異性引物對WX-1基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段插入到pMD19-T載體，經(jīng)PstⅠ限制性內(nèi)切酶線性化后進(jìn)行系列10倍梯度稀釋，獲得拷貝數(shù)為101～107 μL－1的DNA稀釋液。以系列稀釋液為模板進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以RT-PCR的循環(huán)閾值（cycle threshold， Ct）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同處理棉花根際土中WX-1的豐度（以每克土壤的質(zhì)?？截悢?shù)計，單位：copies·g－1）。

1.7 菌糠防治棉花黃萎病田間小區(qū)試驗

為了進(jìn)一步驗證菌糠對棉花黃萎病的防效，分別在河北省高陽縣北于八村（簡稱為“高陽地塊”）和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師十六團(tuán)8連3116號地（簡稱為“第一師地塊”）開展田間小區(qū)試驗。按照30 t·hm－2施用菌糠粉，于播種前翻地時撒施于試驗地塊。高陽地塊所用棉花品種為農(nóng)大棉36號，新疆試驗地塊所用棉花品種為塔河2號。在高陽地塊和第一師地塊分別于2022年8月17日、29日和7月21日、8月25日調(diào)查黃萎病發(fā)生情況，病情指數(shù)分級及防效計算同1.4。第一師地塊在8月25日測產(chǎn)，每個小區(qū)隨機(jī)選取6 m2地塊，調(diào)查棉花鈴數(shù)，以反映對產(chǎn)量的影響。2個試驗地塊空白對照和菌糠處理均設(shè)置3次重復(fù)。

1.8 統(tǒng)計分析

采用單因素方差分析計算菌糠各處理與空白對照之間在防治棉花黃萎病的溫室試驗中的差異。當(dāng)單因素方差分析顯示有顯著差異（P＜0.05）時，使用Fisher最小顯著差數(shù)（least significant difference， LSD）法檢驗處理間的差異性。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS Statistics R26.0.0.0軟件（SPSS， Chicago， IL， USA）進(jìn)行。利用GraphPad Prism 9.0.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇菌糠對大麗輪枝菌的影響

抑菌試驗結(jié)果（表1）表明，與空白對照相比，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）菌糠處理對WX-1微菌核形成和菌落生長沒有顯著影響。

2.2 菌糠對棉花黃萎病的防治效果

溫室盆栽試驗結(jié)果（圖1）顯示：接菌后21 d，空白對照棉花黃萎病病情指數(shù)為42.19，而2%菌糠（SMS）處理的棉花黃萎病病情指數(shù)僅為9.78。SMS處理對棉花黃萎病的防效達(dá)到76.8%。表明土壤添加2%菌糠對棉花黃萎病具有較好防效。

2.3 菌糠處理對棉花根際WX-1數(shù)量的影響

利用RT-PCR技術(shù)對不同處理棉花根際土壤中大麗輪枝菌數(shù)量的測定結(jié)果（圖2）表明，空白對照中根際WX-1豐度為3.62×106 copies·g－1；2%SMS處理后棉花根際WX-1數(shù)量為6.87×105 copies·g－1，與空白對照相比極顯著下降81.02%。

2.4 菌糠對棉花根際微生物群落的影響

對棉花根際土壤中微生物進(jìn)行宏基因組分析，通過Hiseq高通量測序，每個土壤樣品產(chǎn)生約6 Gb的數(shù)據(jù)量，對原始序列進(jìn)行質(zhì)控處理，去除低質(zhì)量序列、模糊序列和嵌合體序列后，空白對照和SMS處理分別得到5.28×107和5.25×107條質(zhì)控序列（表2）。所有處理覆蓋率均超過97%，表明分析數(shù)據(jù)基本覆蓋環(huán)境樣品中全部微生物，能夠比較全面真實地反映棉花根際土壤微生物群落組成。

與空白對照相比，SMS處理對棉花根際細(xì)菌和真菌群落影響差異明顯。主坐標(biāo)分析表明，2種處理方式下細(xì)菌（圖3A）和真菌（圖3B）群落組成在分類學(xué)基礎(chǔ)上分別沿第一和第二坐標(biāo)軸分開聚集，第一主成分（PC1）分別解釋所有變量的95.82%和70.93%；第二主成分（PC2）分別解釋所有變量的0.79%和5.07%，累積貢獻(xiàn)率分別為96.61%和76.00%，說明能夠表征細(xì)菌和真菌群落組成的特征。SMS處理與空白對照處理在細(xì)菌和真菌群落上沿PC1顯著分開，說明菌糠是引起棉花根際細(xì)菌和真菌群落差異的主要因素。

在門水平，共注釋到152個細(xì)菌門和8個真菌門。細(xì)菌群落中，變形菌門（Proteobacteria，48.62%）占比最高，其次分別為放線菌門（Actinobacteria，31.84%）、酸桿菌門（Acidobacteria，5.72%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，5.64%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，1.78%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，1.77%）、浮霉菌門（Plancto-mycetes，1.15%）和綠彎菌門（Chloroflexi，1.00%），相對豐度小于1%的類群歸入其他（圖4A）。真菌群落中，子囊菌門（Ascomycota，61.75%）占主導(dǎo)地位，其次分別為擔(dān)子菌門（Basidiomycota，27.67%）、毛霉門（Mucoromycota，6.42%）、壺菌門（Chytridiomycota，2.30%）和捕蟲霉門（Zoopagomycota，1.67%），相對豐度小于1%的類群歸入其他（圖4B）。

在屬水平，共注釋到3 380個細(xì)菌屬和347個真菌屬。細(xì)菌群落中，14個屬相對豐度大于1%（表3）。其中，相對豐度較高的屬有類諾卡氏菌屬（Nocardioides spp.，11.02%）、羅河桿菌屬（Rhodanobacter spp.，4.04%）、溶桿菌屬（Lysobacter spp.，2.90%）、德沃斯氏菌屬（Devosia spp.，2.90%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium spp.，2.32%）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas spp.，2.05%）。真菌群落中，13個屬相對豐度大于1%（表3）。其中，相對豐度較高的屬有梨形孢屬（Serendipita spp.，13.76%）、輪枝孢屬（Verticillium spp.，12.59%）、油脂酵母屬（Lipomyces spp.，4.64%）、曲霉屬（Aspergillus spp.，4.19%）和小菇屬（Mycena spp.，4.01%）。

屬水平差異分析顯示，空白對照和SMS處理中，3 380個細(xì)菌屬中有1 922個屬相對豐度差異顯著，347個真菌屬中有87個屬相對豐度差異顯著。相對豐度前10的差異物種中，類諾卡氏菌屬、德沃斯氏菌屬、諾爾氏菌屬、微桿菌屬、中慢生根瘤菌屬細(xì)菌（圖5A）和梨形孢屬、毛殼菌屬、Thermothielavioides spp.、柄孢殼屬真菌（圖5B）相對豐度在菌糠處理（SMS）中顯著提高，而羅河桿菌屬、溶桿菌屬、慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬細(xì)菌和輪枝菌屬、油脂酵母屬、曲霉屬、小菇屬、毛霉屬、根孢囊霉屬真菌相對豐度在SMS處理中則顯著降低。

2.5 棉花根際微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

網(wǎng)絡(luò)分析表明，與空白對照相比（圖6A、C），菌糠處理后根際土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，物種間聯(lián)系緊密（圖6B）；而真菌網(wǎng)絡(luò)則更簡單，物種間聯(lián)系松散（圖6D）。從拓?fù)涮卣鱽砜矗ū?），不同處理節(jié)點數(shù)相近，而總邊數(shù)差異較大。與空白對照相比，菌糠處理后細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)總邊數(shù)提高了85.44%，真菌網(wǎng)絡(luò)總邊數(shù)降低了43.49%；從正負(fù)相關(guān)邊的比例（PE和NE）來看細(xì)菌群落以協(xié)同作用為主，而真菌群落協(xié)同和競爭作用共存；細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)模塊化（MO）水平降低了12.68%，真菌網(wǎng)絡(luò)模塊化（MO）水平提高了21.88%，說明與對照相比，菌糠處理的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)更穩(wěn)定而真菌網(wǎng)絡(luò)波動性更強(qiáng)。

2.6 菌糠對棉花根際微生物功能基因的影響

通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫獲得基因?qū)?yīng)的功能注釋并進(jìn)行統(tǒng)計，共獲得333條KEGG途徑。PCoA結(jié)果（圖7）顯示，菌糠處理和空白對照的根際微生物群落功能基因沿第一坐標(biāo)軸分開聚集，第一主成分（PC1）解釋所有變量的74.05%，第二主成分（PC2）解釋所有變量的11.08%；累積貢獻(xiàn)率為85.13%，說明能夠表征根際微生物功能基因組成的特征。菌糠處理在功能基因上與空白對照處理沿PC1顯著分開，說明菌糠是引起功能基因差異的主要因素。

在去除非微生物KEGG途徑后，61條KEGG途徑的相對豐度（38.54%）在空白對照和菌糠處理間差異顯著。其中，相對豐度較高的15類KEGG途徑中（圖8），與ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter， ABC transporters， ko02010）、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（two-component regulatory system， ko02022）和群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing， ko02024）相關(guān)基因的豐度在菌糠處理后顯著提高，而與氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids，ko01230）、碳代謝（carbon metabolism， ko01200）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism， ko00620）等12條途徑相關(guān)基因的豐度在菌糠處理中則顯著降低。

2.7 菌糠對棉花黃萎病的田間防效及結(jié)鈴影響

在河北高陽地塊和第一師地塊的田間小區(qū)試驗中，2個試驗地塊的2次病害調(diào)查中菌糠對棉花黃萎病均表現(xiàn)出較好的防效（表5）。在高陽地塊的2次調(diào)查中防效分別為34.48%和36.84%；在第一師地塊的2次調(diào)查中防效分別為43.98%和41.81%，整體好于高陽地塊。第一師地塊的調(diào)查結(jié)果顯示，菌糠處理地塊的單位面積結(jié)鈴數(shù)增加5.44%。

3 討論

菌糠作為一種來源廣泛且廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物，作為土壤添加劑防治作物土傳病害的潛力受到越來越多關(guān)注。以往研究證明菌糠對由尖孢鐮刀菌引起的經(jīng)濟(jì)作物枯萎病具有良好防效，而菌糠防治其他土傳病害的報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤添加菌糠能有效防治棉花黃萎病，顯著降低棉花根際大麗輪枝菌的數(shù)量。菌糠作為培養(yǎng)食用菌的廢棄物，其中含有食用菌菌絲體及其代謝產(chǎn)物，因此，菌糠具有與微生物互作相關(guān)的生物學(xué)特性。本研究中，溫室盆栽試驗表明0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的香菇菌糠對大麗輪枝菌的生長和微菌核形成沒有顯著影響，據(jù)此推測，菌糠防治棉花黃萎病與其抑菌活性無關(guān)。

植物根際富集有益微生物可能是防治作物土傳病害的機(jī)理之一[14]。本研究分析了菌糠處理對棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，與空白對照相比，菌糠處理增加了棉花根際德沃斯氏菌屬、微桿菌屬、中慢生根瘤菌屬、梨形孢屬、毛殼菌屬等潛在有益微生物的豐度，在黃瓜上的應(yīng)用中得到類似結(jié)果[9]。有益微生物在維持作物健康生長，抵御病原菌侵染中扮演重要角色[15]。Pereira等[16]利用食石油微桿菌（M. oleovorans）處理玉米種子能夠減少玉米出苗后根內(nèi)擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）數(shù)量，從而緩解病害嚴(yán)重程度。植物內(nèi)生真菌印度梨形孢（S. indica）定植于多種植物的根部，可以增強(qiáng)這些植物的生長和抗逆能力，Cheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)印度梨形孢能誘導(dǎo)香蕉對香蕉枯萎菌（F. oxysporum f. sp. cubense）產(chǎn)生抗性。毛殼菌是一類重要的生防菌，能有效防治多種植物真菌病害[18]。Ogundeji等[2]研究發(fā)現(xiàn)，毛殼菌在茄子根際的富集可能是生物炭防治茄子黃萎病的主要機(jī)理之一。以上結(jié)果表明，棉花根際富集有益微生物可能是菌糠防治棉花黃萎病的機(jī)理之一。

研究證明，根際微生物間較高的關(guān)聯(lián)性有助于減輕病原微生物的侵染[19]。模塊化可在一定程度上反映網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性，較高的模塊化代表種群間競爭的加劇導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性降低[20]。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，菌糠是導(dǎo)致微生物群落聯(lián)系改變的主要因素，而變化模式在細(xì)菌和真菌群落中則截然相反。在細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中，菌糠提高了網(wǎng)絡(luò)規(guī)模，節(jié)點數(shù)增加，物種間關(guān)聯(lián)性提高，協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)；而真菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)規(guī)模減小，物種間關(guān)聯(lián)性降低。菌糠促進(jìn)了細(xì)菌群落間聯(lián)系，降低了模塊化，使得網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)固。

根際微生物群落基因功能注釋表明多條涉及微生物信號識別和定植的通路在菌糠處理中富集。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)是芽孢桿菌和假單孢菌等生防細(xì)菌中一類重要的信號傳遞系統(tǒng)，調(diào)控抑菌物質(zhì)的合成、生物膜形成與根際定植等重要生防相關(guān)性狀[21]。群體感應(yīng)指微生物群體在其生長過程中，由于群體密度的增加，導(dǎo)致其生理和生化特性的變化，是細(xì)菌中一類重要的調(diào)控系統(tǒng)，參與細(xì)菌抗生素產(chǎn)生、生物膜形成以及根際定植等生防性狀[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤添加菌糠提高了群體感應(yīng)相關(guān)基因的豐度，推測菌糠處理可富集棉花根際有益微生物，有益微生物數(shù)量增加能激活群體感應(yīng)系統(tǒng)，提高生防菌在根際的定植能力和抗生素產(chǎn)生能力，從而發(fā)揮生防效果。此外，植物根際存在豐富多樣的微生物，相互之間主要通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)而相互競爭營養(yǎng)和空間位點。ABC轉(zhuǎn)運蛋白參與調(diào)控細(xì)菌對抗生素的抗性，激活A(yù)BC轉(zhuǎn)運蛋白能提高細(xì)菌的抗藥性[24]。Armalyte等[25]分析了土壤微生物群落組成和抗生素耐藥性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮耐藥性并成為優(yōu)勢種群。Muller等[26]通過轉(zhuǎn)座子插入突變證明ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因在芽孢桿菌與黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）的競爭中起到關(guān)鍵作用。由此推測菌糠處理可激活根際有益菌ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，提高有益菌的根際競爭能力及環(huán)境適應(yīng)力，發(fā)揮生防效果。

4 結(jié)論

土壤中添加菌糠可有效防治由大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病，降低根際大麗輪枝菌的數(shù)量。增加根際有益微生物豐度、改變微生物共現(xiàn)模式是菌糠防治棉花黃萎病的重要作用機(jī)理。該研究從生態(tài)調(diào)控角度揭示了菌糠防治棉花黃萎病的機(jī)理，為創(chuàng)制高效防控作物黃萎病的生防制劑提供了理論依據(jù)。

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