甄 珍 宋錦蘋 李悠悠 杜銳凱 凌樹寬 胡利明* 李英賢*

(1.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部, 北京 100124;2.中國航天員科研訓練中心航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室, 北京 100094)

1 引言

航天飛行中,由于免疫功能的變化給航天員的健康帶來一系列風險[1],如發(fā)生罕見性感染,潛伏病毒激活[2]和過敏性疾病等。在長期飛行的深空探測任務中,若免疫系統(tǒng)失調(diào)狀況持續(xù)存在,極有可能會增加乘組人員的不良臨床風險,對航天任務的順利實施造成巨大威脅。觀察空間飛行對免疫功能的影響及其與疾病發(fā)生之間的相關性,對制定和采取相應措施保障航天員健康至關重要?？臻g飛行條件有限,因此常采用地面模擬失重模型進行相關研究[3]。小鼠尾吊是常用的地面模擬失重動物模型[4-5],由于其后肢模擬了空間飛行中的去負荷,整體模擬了血液的頭向分布、應激等,因此能較好地模擬失重條件下的骨質(zhì)丟失、肌肉萎縮、免疫系統(tǒng)和心血管等效應。

過敏性哮喘是一種過敏性疾病的主要模型[6],它是一種由于過敏源刺激發(fā)生的由多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T 淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥,在易感者中此種炎癥可引起反復發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和咳嗽等癥狀。目前很少有關于尾吊模擬失重對過敏性疾病發(fā)生程度影響的研究。

本文旨在研究尾吊模擬失重對小鼠免疫細胞及其亞群和過敏性哮喘的影響,并通過肺組織學、肺炎性細胞滲出、脾細胞及Th 細胞分布闡明尾吊模擬失重所致的免疫失衡在過敏性哮喘中的作用機制。

2 方法

2.1 實驗動物與分組

選擇6～8 周齡、體重18 ～22 g 的BALB/c 雌性小鼠28 只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證SCXK(京2021-0006)。飼養(yǎng)于中國航天員科研訓練中心SPF 級動物房,適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。

實驗分為4 組,每組7 只小鼠。A 組:正常對照組(Ctrl);B 組:單純OVA 組(Ovalbumin,卵清蛋白);C 組:單純尾吊組(Hindlimb Unloading, HU,后肢去負荷);D 組:尾吊+OVA 組(HU+OVA)。

2.2 試劑與儀器

主要試劑:OVA, 佛波醇肉豆蔻酸酯(Phorbol Myristate Actetate,PMA), 離子霉素, 布雷菲德菌素A (Brefeldin-A, BFA) 購自Sigma 公司,紅細胞裂解液購自北京索來寶科技有限公司,CD4-PerCP-cy5.5, 干擾素(IFN)-γ-FITC, 白細胞介素(IL)4 -PE, IL17-APC, CD4-FITC, CD25-APC,Foxp3-PerCP-cy5.5 抗體, Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色套裝(Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set)購自eBioscience 公司。

主要儀器:BD FACS AriaⅡ流式細胞儀,Nikon ECLIPSE TS100 倒置顯微鏡,Nikon ECLIPSE Ni 正置顯微鏡,Eppendorf 5810R 離心機。

2.3 小鼠過敏性哮喘模型的誘導

小鼠用OVA 加佐劑氫氧化鋁造模,造模周期28 d,在第1 天用20 μg OVA 混懸液(含2 mg 氫氧化鋁)腹腔注射致敏,在第7、14 天再次用20 μg OVA 混懸液(含2 mg 氫氧化鋁)腹腔注射加強,在第21 ～28 天期間,每天用40 μg OVA 混懸液滴鼻刺激,對照組用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline, PBS)代替OVA 混懸液進行同樣處理,觀察小鼠外觀、精神和呼吸情況。第29 天處死小鼠。

2.4 小鼠尾吊模擬失重

在過敏性哮喘造模第15 ～28 天,小鼠頭低位尾部懸吊,保持軀干與地面夾角為30°,共尾吊14 d。

尾吊步驟如下:將醫(yī)用膠布剪成條狀,兩端粘貼于小鼠尾部兩側(cè),形成一個可通過掛鉤的環(huán)狀結(jié)構,約0.5 cm 左右,再用醫(yī)用膠布纏繞固定,將之固定于小鼠尾部中間靠后位置,以防止醫(yī)用膠布脫落。將鐵鏈上的鉤子穿過醫(yī)用膠布環(huán),完成后將鐵鏈的末端懸掛在尾懸吊裝置的轉(zhuǎn)輪上,并且視小鼠軀干與水平面的角度(保證頭低位30°尾懸吊)來調(diào)整鐵鏈的長短,每天定時檢查懸掛情況,隨時調(diào)整保持角度不變。小鼠尾吊模擬失重實驗圖見圖1。

圖1 小鼠尾吊模擬失重實驗圖Fig.1 Experimental diagram of tail-suspended mouse

2.5 小鼠肺部灌洗與肺組織切片染色

頸椎脫臼處死小鼠,小心剪開胸部,結(jié)扎左側(cè)支氣管,0.5 mL 磷酸鹽緩沖液PBS 灌洗右側(cè)肺組織,共3 次,合并3 次灌洗液,取灌洗液細胞進行計數(shù)。取未灌洗側(cè)肺組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片成3 μm 厚,采用蘇木精和伊紅(Hematoxylin-eosin Staining, HE)染色,顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤等組織學變化。

2.6 小鼠脾細胞計數(shù)及淋巴細胞亞群檢測

取出脾臟,研磨制備單細胞懸液,經(jīng)紅細胞裂解液裂解紅細胞后,計數(shù)脾細胞。取1×107個細胞用50 ng/mL PMA+ 1 μg/mL 離子霉素混合液激活4 h, 同時5 μg/mL BFA 阻斷, 經(jīng)表面分子CD4-PerCP-cy5.5 抗體(后續(xù)胞內(nèi)細胞因子染色)或CD4-FITC, CD25-APC 抗體(后續(xù)核內(nèi)Foxp3染色)染色后,經(jīng)Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色套裝破膜破核,胞內(nèi)分別進行IFNγ-FITC、IL4-PE 和IL17-APC 及核內(nèi)Foxp3-PerCP-cy5.5 抗體染色,熒光抗體用量均為5 μL。其中,CD4+細胞為Th 細胞群,CD4+IFN γ+細胞群為Th1 細胞亞群,CD4+IL4+細胞群為Th2 細胞亞群,CD4+IL17+細胞群為Th17 細胞亞群,CD4+CD25+Foxp3+細胞群為Treg細胞亞群。流式細胞儀檢測Th1、Th2、Th17、Treg細胞占CD4+細胞比。

2.7 統(tǒng)計學處理

利用軟件GraphPad Prism 9.0.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用雙因素方差分析,數(shù)值以平均值±標準誤(ˉ±sˉx)表示,P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 整體狀況變化

在用OVA 混懸液滴鼻刺激后,單純OVA 組小鼠表現(xiàn)體形消瘦、毛發(fā)豎起、煩躁不安、呼吸困難、擦鼻,尾吊+OVA 組小鼠同樣有上述表現(xiàn),癥狀顯著較單純OVA 組減輕。

正常對照組和單純尾吊組小鼠均精神正常、無消瘦、毛發(fā)無豎起、無呼吸困難和擦鼻。

3.2 肺組織學變化

圖2 為肺組織切片HE 染色圖,與正常對照組相比,單純尾吊組小鼠肺組織學無明顯炎性細胞滲出和肺泡壁增厚現(xiàn)象;而OVA 誘導小鼠肺組織炎性細胞大量增加,以支氣管周圍更為顯著。肺泡壁增厚,細胞間質(zhì)滲出增加,尾吊條件下OVA 誘導小鼠與OVA 相比,肺組織特別是支氣管周圍炎性細胞明顯減少,肺泡壁變薄,細胞間質(zhì)滲出減少。

圖2 代表性肺組織切片HE 染色圖(200×,比例尺=50 μm)Fig.2 Representative histological section of lung stained with HE(200×,scale bar=50 μm)

3.3 支氣管肺泡灌洗液細胞數(shù)變化

支氣管肺泡灌洗液細胞總數(shù)的變化如圖3 所示。與正常對照組相比,單純尾吊組小鼠支氣管肺泡灌洗液細胞數(shù)量無顯著性變化(P＞0.05)。OVA 誘導小鼠較對照顯著增加(P＜0.001),與之相比,尾吊條件下OVA 誘導小鼠的肺泡灌洗液細胞數(shù)量大為下降,且差異具有顯著性(P＜0.001)。

圖3 支氣管肺泡灌洗液細胞總數(shù)的變化Fig.3 Changes of total cell numbers in BALF

3.4 脾細胞和淋巴細胞亞群的變化

脾細胞總數(shù)與Th 細胞亞群分布結(jié)果如圖4所示。與正常對照組相比,單純尾吊組小鼠脾細胞總數(shù)和Th 細胞各亞群分布無顯著變化。而OVA 誘導小鼠的脾細胞總數(shù)顯著升高,與正常對照組和尾吊條件下OVA 誘導組均有顯著性差異(P＜0.001,P＜0.01)。Th1 細胞亞群百分比較對照組顯著升高(P＜0.05),Th2 和Th17 細胞亞群百分比較對照有升高趨勢。尾吊條件下OVA 誘導小鼠的脾細胞總數(shù)、Th1、Th2 和Th17 亞群百分比較單純OVA 組均下降。OVA 誘導小鼠Treg 細胞亞群百分比明顯升高,尾吊條件下OVA 誘導小鼠的Treg 百分比較單純OVA 組升高幅度更大,且差異具有顯著性(P＜0.05)。

圖4 脾細胞總數(shù)與Th 細胞亞群分布的變化Fig.4 Changes in the total numbers of splenocyte and the distribution of Th cell subsets

4 討論

大量研究表明,航天飛行可導致航天員免疫功能顯著變化[1,7-9],表現(xiàn)為白細胞分布及細胞因子分泌改變,NK 細胞、單核細胞和粒細胞功能下降。正常的免疫系統(tǒng)是機體健康的保障,免疫系統(tǒng)的改變會增加疾病的易感性。已有研究報導航天飛行中航天員感染性疾病[7]、自身潛在病毒激活[10-11]、過敏性疾病的發(fā)生[11-13];過敏性疾病的發(fā)病與免疫失衡密切相關;航天飛行中T 淋巴細胞亞群Th1、Th2、Th17、Treg 分布失衡[7,14]。

小鼠尾吊是常見的地面模擬失重動物實驗模型,但其對Th 淋巴細胞亞群的分布報導尚不明確,對過敏性疾病的影響研究也僅見一例[15]。

采用OVA 誘導過敏性哮喘的小鼠模型,觀察尾吊模擬失重對過敏性哮喘的作用,發(fā)現(xiàn)OVA 刺激后,整體上表現(xiàn)體形消瘦、毛發(fā)豎起、煩躁不安、呼吸困難、擦鼻。組織上能造成肺組織發(fā)生顯著的炎性滲出和炎性反應,尤其以支氣管周圍更加顯著,間質(zhì)增厚,支氣管肺泡灌洗液炎性細胞大量增加,表明了支氣管和肺組織的炎癥發(fā)生,這些變化影響正常行使肺臟通氣換氣功能。而與正常對照組相比,單純尾吊小鼠無整體上體形消瘦、毛發(fā)豎起、精神正常、無呼吸困難和擦鼻等表現(xiàn),同時無支氣管和肺組織的明顯變化,支氣管肺泡灌洗液細胞也沒有增加,說明尾吊模擬失重對小鼠的呼吸系統(tǒng)包括支氣管和肺組織無明顯損傷。但尾吊能明顯改善OVA 造成的過敏性哮喘癥狀、支氣管和肺組織炎性變化及灌洗液中炎性細胞的滲出。

同時,OVA 刺激后,小鼠脾細胞總數(shù)明顯升高,Th1、Th2 和Th17 亞群占Th 細胞百分比升高,表明炎性反應能力增強,促進了過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展。Treg 細胞主要具免疫抑制作用,能夠抑制Th1、Th2、Th17 細胞的炎性反應,起到維持免疫平衡的作用,能減少免疫炎性的損害[16-18]。而Treg 細胞亞群百分比在OVA 刺激后均有升高,但尾吊條件下,Treg 細胞亞群升高更為顯著,說明尾吊對OVA 刺激的炎性反應產(chǎn)生了抑制作用,尾吊本身對脾細胞總數(shù)和Th1、Th2、Th17 淋巴細胞亞群分布無明顯影響,但尾吊能明顯改變OVA 造成的脾細胞總數(shù)變化和Th 淋巴細胞亞群分布,表明尾吊模擬失重減輕了OVA 造成的免疫炎性反應。

本文研究表明,尾吊模擬失重減緩OVA 所致小鼠過敏性哮喘的病癥,而這與小鼠Treg 細胞數(shù)目升高有關。表明免疫功能的平衡程度與過敏性哮喘發(fā)生與發(fā)展具有一定相關性。

真實飛行中,航天員的免疫功能對航天環(huán)境非常敏感,過敏性疾病發(fā)生可能性增加,2016 年,一名國際空間站航天員的個案研究記錄了太空飛行期間出現(xiàn)皮疹和非典型過敏癥狀[12]。

隨著飛行條件和飛行時長不同,航天員免疫功能呈動態(tài)變化,免疫系統(tǒng)是否發(fā)生失衡,采取何種對抗措施來維持其平衡,與航天員是否發(fā)生過敏性疾病有重要關聯(lián)性。本文研究結(jié)果尾吊模擬失重減輕了過敏性疾病的程度,與預想不一致。這可能是由于不同的尾吊時間對小鼠免疫功能的影響不同,導致了對過敏性哮喘的不同調(diào)節(jié)。也有可能與OVA 通過鼻飼致敏的過程有關,頭低位尾吊減緩了OVA 對肺的直接刺激。在下一步的研究中,應觀察不同尾吊時間對免疫功能和過敏性疾病的影響,再者也需要同時觀察其他過敏性模型對尾吊模擬失重的反應,以更全面地闡明在在未來太空飛行中,過敏性疾病的發(fā)生以及與免疫功能的相關性,更準確地來保障航天員健康工作。

5 結(jié)論

在整體水平上,尾吊模擬失重顯著改善OVA誘導的過敏性哮喘小鼠的外觀、精神和呼吸變化;在組織水平上,尾吊模擬失重明顯減少OVA 誘導造成的支氣管肺組織炎性變化,支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞的滲出明顯下降;在細胞水平上,尾吊模擬失重減緩了OVA 誘導的機體免疫炎性細胞的增加,相反進一步促進了免疫抑制性T 細胞比例的升高。因此,OVA 刺激條件下,模擬失重將導致機體免疫功能發(fā)生改變,對過敏性哮喘的病情有一定影響。