鄒子云 光澤縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建光澤 354100

ELISA 是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中最普遍使用的試驗(yàn)種類之一，具有良好的準(zhǔn)確性和靈敏性，操作步驟簡(jiǎn)單，不易產(chǎn)生試驗(yàn)環(huán)境污染。 因此，被廣泛用于豬瘟、口蹄疫、 小反芻獸疫和豬繁殖與呼吸綜合征抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目中。 根據(jù)日常操作和試驗(yàn)步驟中細(xì)節(jié)問(wèn)題的處理， 總結(jié)分析ELISA 試驗(yàn)中常見(jiàn)的細(xì)節(jié)問(wèn)題，以減少試驗(yàn)過(guò)程中由主觀因素造成的誤差，從而提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備注意事項(xiàng)

1.1 樣品 樣品在采集、制備、保存過(guò)程中，要注意以下幾點(diǎn)。 首先，采集的每份樣品應(yīng)保證之后試驗(yàn)、復(fù)檢、留樣的使用數(shù)量；其次，采集完的樣品豎直向上擺放，避免劇烈震蕩，如果出現(xiàn)嚴(yán)重溶血現(xiàn)象，后期難以清洗干凈，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；最后，樣品保存時(shí)不能反復(fù)凍融，2～8 ℃保存3 d，-20 ℃可長(zhǎng)期保存。 此外，使用前須將樣品輕柔地上下顛倒混勻，保證離心管中各個(gè)位置抗體濃度一致， 不可劇烈晃動(dòng)混勻。

1.2 試劑盒 試劑盒在使用前需平衡至室溫 （20～25 ℃），若放置于實(shí)驗(yàn)室中自然回溫，耗時(shí)較長(zhǎng)且各組件回溫程度不均勻。 建議將試劑盒各組件放在恒溫箱中回溫，包括配制洗滌液使用的純凈水。恒溫箱溫度設(shè)定在25 ℃，內(nèi)部放置溫度計(jì)，確保箱內(nèi)溫度能準(zhǔn)確達(dá)到25 ℃，每一步使用時(shí)將所要用到的試劑組件取出。 不同批次的試劑不可混合使用。 試劑盒嚴(yán)格按照要求保存， 放在冰箱中應(yīng)避免靠在冰箱內(nèi)壁上，以免造成結(jié)冰。未使用完的反應(yīng)板要保存在放有干燥劑的密封袋內(nèi)。

2 試驗(yàn)操作過(guò)程注意事項(xiàng)

2.1 加樣 在加入第一個(gè)樣品與最后一個(gè)樣品之間存在時(shí)間差，因此，每個(gè)樣品與孔板接觸和反應(yīng)的時(shí)間就存在細(xì)微差異。 為保證每個(gè)孔的反應(yīng)時(shí)間大致一樣，在加樣過(guò)程中要把握移液槍的熟練使用，每次加樣都要?jiǎng)蛩贉?zhǔn)確。 此外，在加入不同試劑時(shí)，都要選擇相同的方向和順序， 如果一開(kāi)始加入樣品是從左往右，那么之后每一步都應(yīng)該從左往右，中途不能更換， 這樣可以有效減小和抵消反應(yīng)時(shí)間差帶來(lái)的不利影響。

2.2 孵育 目前使用的試劑盒通常有25 ℃室溫孵育和37 ℃恒溫箱孵育兩種方式。 室溫孵育時(shí)，溫度控制在20～25 ℃，反應(yīng)板應(yīng)避免放置在陽(yáng)光直射、冷熱風(fēng)出口、潮濕桌面等溫度不均勻的地方。恒溫箱孵育時(shí)，反應(yīng)板由25 ℃升至37 ℃需要時(shí)間，因此，可以推遲幾分鐘開(kāi)始計(jì)時(shí)。 孵育開(kāi)始前要用封膜蓋緊反應(yīng)板，避免液體蒸發(fā)。撕開(kāi)封膜時(shí)要緊緊按住反應(yīng)板中部， 否則反應(yīng)板容易被黏性封膜帶起后砸落在桌面上，造成液體飛濺。 多個(gè)反應(yīng)板不能疊加擺放，以免受熱不均。

2.3 洗版 洗滌液要按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求按比例稀釋。 稀釋之前應(yīng)該注意濃縮液中是否有結(jié)晶沉淀，如果有，就需要讓濃縮液繼續(xù)回溫直至沒(méi)有結(jié)晶沉淀才能進(jìn)行下一步稀釋。 通常使用多道移液器添加洗滌液，在吸取洗滌液時(shí)，應(yīng)稍微留意每個(gè)吸頭的液面是否一樣，而在打入洗滌液時(shí)，要避免太過(guò)用力，推力過(guò)大會(huì)導(dǎo)致洗滌液飛濺。吸水紙應(yīng)當(dāng)選擇干凈、 無(wú)塵、 吸水效果好的材料。 目前， 試驗(yàn)使用的ELISA 反應(yīng)板通常都是可拆卸的，而在棄去廢液時(shí)，容易造成反應(yīng)板脫落、 掉入廢液池中， 導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。 因此，建議在試驗(yàn)開(kāi)始前，可用白色膠帶固定反應(yīng)板四周，一是方便標(biāo)記橫豎序號(hào)，二是可以固定反應(yīng)板，避免松動(dòng)、脫落。

2.4 顯色 顯色反應(yīng)是試驗(yàn)的最后一個(gè)反應(yīng)步驟，酶催化反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，陰性不變，而陽(yáng)性會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而顏色加深。因此，影響因素除了之前的溫度和時(shí)間外，還有光照。 在加入反應(yīng)底物后，可將反應(yīng)板裝在深色紙袋中， 按說(shuō)明書(shū)要求的溫度放入恒溫箱或置于室溫環(huán)境。 加入終止液，溫和震蕩，讓液體充分混合、終止反應(yīng)，注意不要灑出，并盡快讀數(shù)。 在使用前要查看反應(yīng)底物和終止液是否無(wú)色透明，如果出現(xiàn)變色則不能使用。

2.5 讀數(shù) 讀數(shù)開(kāi)始前，用干凈的紙巾輕輕擦拭反應(yīng)板底部，去除底部吸附的雜質(zhì)和液體，避免影響反應(yīng)板的透光度。按照說(shuō)明書(shū)要求調(diào)整好波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀在使用前半小時(shí)打開(kāi)預(yù)熱，以提高讀數(shù)的準(zhǔn)確性。

2.6 其他 本地區(qū)除夏季外，其他季節(jié)早晚溫差較大，尤其是秋季集中監(jiān)測(cè)，通常在11 月底至12 月初進(jìn)行試驗(yàn)。早晨時(shí)試驗(yàn)環(huán)境溫度較低，回溫時(shí)間應(yīng)當(dāng)加長(zhǎng)。 值得注意的是，當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)工作臺(tái)臺(tái)面依然溫度過(guò)低， 用紅外測(cè)溫儀測(cè)量發(fā)現(xiàn)二者間溫差達(dá)6～7 ℃。因此，可以在臺(tái)面與反應(yīng)板之間放置一塊泡沫板， 從而減少溫度差異產(chǎn)生的不利影響。

3 總 結(jié)

ELISA 試驗(yàn)簡(jiǎn)單易懂， 但是每個(gè)步驟都有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從開(kāi)始的樣品、試劑準(zhǔn)備到最后的顯色、讀數(shù)都有可能產(chǎn)生誤差。 因此，精密的儀器、 良好的檢測(cè)試劑以及準(zhǔn)確無(wú)誤的操作都是試驗(yàn)是否準(zhǔn)確的組成部分。作為試驗(yàn)人員，所能把握的便是操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行， 尤其是對(duì)細(xì)節(jié)的把控，是試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、準(zhǔn)確的保障。