梁洪宇,劉成倩,高 駿,周佳明,司伏生,易建中

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海市金山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201500)

【研究意義】豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)屬于冠狀病毒科(Alphacoronavirus),是一種線(xiàn)性無(wú)節(jié)段、單股正鏈的RNA病毒,是引起豬流行性腹瀉(PED)的主要病原,臨床上對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。在病毒基因組編碼的眾多蛋白中S蛋白包含誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位,因此,S蛋白在PED基因工程疫苗的研究中倍受關(guān)注[1-3]。研究表明多肽可用于多種病原檢測(cè)[4],在臨床上作為一種診斷方法可以進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)。鑒于S蛋白在PEDV檢測(cè)和疫苗研發(fā)中的重要作用以及多肽在病原監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用,針對(duì)S蛋白設(shè)計(jì)多肽來(lái)檢測(cè)PEDV的流行具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】多肽間的相互作用是多肽用于抗原檢測(cè)的基礎(chǔ)。目前有多種方法可研究蛋白質(zhì)間的相互作用,其中能夠用來(lái)研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間相互作用的方法是Hu等[5-6]在2002年開(kāi)發(fā)的雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular fluorescent complimentary,BiFC)技術(shù)。彭也等[7]基于BiFC技術(shù)驗(yàn)證IMM-H004對(duì)CKLF1/CCR4結(jié)合的影響;楊迷等[8]利用BiFC技術(shù)對(duì)擬南芥的ROP2與GGB蛋白進(jìn)行了互作分析。BiFC技術(shù)也廣泛用于研究病毒與宿主之間的相互作用,研究病毒蛋白之間及其與寄主蛋白之間的互作關(guān)系,構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò),對(duì)于研究病毒蛋白的功能和致病機(jī)制等具有非常重要的意義[9]。Hemerka等[10]利用BiFC系統(tǒng)研究了流感病毒聚合酶復(fù)合物PA與PB2亞基的互作,并詳細(xì)分析了PA-PB2二元復(fù)合物的亞細(xì)胞定位與進(jìn)核。BiFC技術(shù)也已被用于一些與人類(lèi)病毒相關(guān)的研究,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中Epstein Barr病毒潛伏膜蛋白1的表征、HIV病毒Vor分子之間的互作[11]等。近年來(lái),多肽技術(shù)在疾病的診斷方面取得長(zhǎng)足進(jìn)展?？茖W(xué)家們已經(jīng)研究出放射性標(biāo)記的肽作為癌癥診斷的有效試劑,Farahani等[12]對(duì)放射性肽進(jìn)行了修飾,提高了用于腫瘤診斷和治療的多肽的特異性和敏感性。張蕾等[13]研究根據(jù)ASFV的p30、p54和p72 3種重要抗原設(shè)計(jì)3條合成肽,以此為包被抗原建立了 ASFV間接 ELISA 抗體檢測(cè)方法,并驗(yàn)證其敏感性、特異性、穩(wěn)定性。寧?kù)o等[14]發(fā)現(xiàn)RV1737多肽有成為潛伏結(jié)核診斷候選抗原潛力。目前,與靶標(biāo)蛋白相互作用的多肽或蛋白質(zhì)主要是利用噬菌體展示、酵母雙雜交或免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體等方法來(lái)篩選獲得,存在篩選周期長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn),且篩選的是線(xiàn)性結(jié)構(gòu)位點(diǎn),對(duì)天然蛋白質(zhì)結(jié)合力較弱[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PEDV的增殖依賴(lài)于其自身基因組編碼蛋白的表達(dá),封閉PEDV S蛋白上的受體結(jié)合位點(diǎn),可阻止病毒侵入細(xì)胞。設(shè)想依據(jù)S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽段的二級(jí)及空間結(jié)構(gòu),創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)與S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)相互作用的多肽,再結(jié)合當(dāng)前在活細(xì)胞內(nèi)研究多肽間互作的BiFC技術(shù)來(lái)探索2個(gè)肽段間互作的可能性以及兩者結(jié)合后形成的復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,為進(jìn)一步利用該肽段進(jìn)行臨床檢測(cè)奠定前期基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究依據(jù)S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽段的特征以及密碼子的偏好性首先設(shè)計(jì)出編碼靶標(biāo)肽(DEFFLIDEDYFD)的氨基酸序列,設(shè)計(jì)理論上與靶標(biāo)肽互補(bǔ)且可能與其發(fā)生相互作用的互補(bǔ)肽(KKFFLLRKYNWK),通過(guò)構(gòu)建互補(bǔ)肽和靶標(biāo)肽的BiFC真核表達(dá)載體,研究互補(bǔ)肽和靶標(biāo)肽在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用情況以及形成的BiFC復(fù)合物在活細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。因此,明確2個(gè)肽段間的互作關(guān)系以及兩者結(jié)合后形成復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位是本研究擬解決的2個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基及血清 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由實(shí)驗(yàn)室保存;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS),Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品,0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 DNA合成、試劑及BiFC系統(tǒng)載體 編碼靶標(biāo)肽及互補(bǔ)肽的引物由上海捷瑞有限公司合成;Venus雙分子熒光互補(bǔ)載體載體pBiFC-VC155和pBiFC-VN173以及陽(yáng)性對(duì)照載體pBiFC-bFos-VC155與pBiFC-bJun-VN173購(gòu)自Addgene公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品;NotI、SalI、EcoR I、XhoI等限制性?xún)?nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α為本實(shí)驗(yàn)室制備;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司。兔抗Calnexin抗體-ER Marker(ab22595)、鼠抗GM130抗體-Golgi Marker(ab169276)購(gòu)自Abcam公司;Alexa Flour 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG、4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司,Alexa Flour 594標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 核酸電泳儀和凝膠成像分析儀購(gòu)自上海天能科技有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱和EVOS M7000智能全自動(dòng)活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)購(gòu)自Thermo Fisher公司;熒光正置顯微鏡購(gòu)自卡爾ZEISS公司;熱循環(huán)PCR儀為伯樂(lè)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的設(shè)計(jì) 依據(jù)PEDV S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽段的氨基酸組成、所帶電荷種類(lèi)、形成分子間氫鍵的能力、極性強(qiáng)弱、疏水性能、側(cè)鏈基團(tuán)的大小和結(jié)構(gòu)等理化條件設(shè)計(jì)出編碼靶標(biāo)肽:天冬氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸(Asp-Glu-Phe-Phe-Leu-Ile-Asp-Glu-Asp-Tyr-Phe-Asp)的核苷酸序列,根據(jù)靶標(biāo)肽氨基酸序列設(shè)計(jì)理論上與靶標(biāo)肽互補(bǔ)的、可能與靶標(biāo)肽發(fā)生相互作用互補(bǔ)肽:賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-賴(lài)氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-色氨酸-賴(lài)氨酸(Lys-Lys-Phe-Phe-Leu-Leu-Arg-Lys-Tyr-Asn-Trp-Lys)對(duì)應(yīng)的核苷酸片段,將設(shè)計(jì)好的2條多肽按照偏愛(ài)密碼子轉(zhuǎn)換成核苷酸序列(表1),靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽均為12位氨基酸,36個(gè)堿基;并結(jié)合對(duì)載體序列的酶切位點(diǎn)分析分別在多肽對(duì)應(yīng)核苷酸序列的5’和3’加上合適的酶切位點(diǎn),經(jīng)分析無(wú)誤后送上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。

表1 設(shè)計(jì)的多肽編碼的核苷酸序列Table 1 The nucleotide sequence encoding the designed polypeptide

1.2.2 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 真核載體pBiFC-VC155和pBiFC-VN173進(jìn)行改造(圖1)。pBiFC-VC155用EcoRΙ/XhoΙ進(jìn)行雙酶切,pBiFC-VN173用NotΙ/SalΙ進(jìn)行雙酶切。上述反應(yīng)體系分別在37 ℃孵育4 h后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收,隨后將合成的核酸序列溶解后分別在10 μL體系經(jīng)95 ℃變性10 min后自然冷卻至室溫進(jìn)行退火處理,冷卻產(chǎn)物分別與經(jīng)雙酶切處理的pBiFC-VC155、pBiFC-VN173載體在22 ℃下連接2 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,對(duì)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定。

圖1 pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction map of pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide

1.2.3 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用瑞士生物信息學(xué)研究所開(kāi)發(fā)的ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)程序?qū)Π袠?biāo)肽與互補(bǔ)肽蛋白肽鏈的疏水性進(jìn)行分析;使用在線(xiàn)工具SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_sopma.html)進(jìn)行多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析;使用SWISS-MODLE與PDBsumGenerate(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)程序?qū)Π袠?biāo)肽與互補(bǔ)肽做建模分析[17-19]。

1.2.4 重組質(zhì)粒制備 對(duì)經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確的克隆在37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,搖菌后按照Axygen質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取并測(cè)定濃度,將質(zhì)量合格的質(zhì)粒-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光觀察 將Vero細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每空0.5×106個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至70%～80%匯合度時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染分組如下:①重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽單轉(zhuǎn)染組;②重組質(zhì)粒pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽單轉(zhuǎn)染組;③pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染組;④pBiFC-bFos-VC155與pBiFC-bJun-VN173共轉(zhuǎn)染組;⑤pBiFC-VC155與pBiFC-VN173共轉(zhuǎn)染組。具體轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)上的操作進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后36 h用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,隨后在EVOS M7000智能全自動(dòng)活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)下觀察綠色熒光的形成情況。

1.2.6 間接免疫熒光研究靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的亞細(xì)胞定位 為進(jìn)一步明確靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的亞細(xì)胞定位,對(duì)重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽和pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽參考上述轉(zhuǎn)染方法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),研究其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的定位情況。操作步驟參考實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行[20]:細(xì)胞接種于爬片上轉(zhuǎn)染36 h后用4%多聚甲醛室溫固定15 min,然后用0.1%的Triton-X 100室溫透化15 min,3%的山羊血清室溫封閉1 h,隨后用兔抗Calnexin細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白抗體(1∶200)和鼠抗GM130細(xì)胞高爾基體標(biāo)記蛋白抗體(1∶200)作為一抗進(jìn)行雙重染色,室溫孵育60 min,PBS洗3次后用Alexa Flour 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG(1∶50)和Alexa Flour 594標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶50)作為二抗,室溫避光孵育60 min后用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,隨后在正置顯微鏡下觀察靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽的定位情況。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察及拍照 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色后在正置顯微鏡上觀察BiFC的形成情況以及靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽在活細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位,并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.1 親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果 蛋白的親/疏水性主要取決于其分子表面的電荷量[21]。蛋白質(zhì)折疊時(shí)能形成親水表面和疏水內(nèi)核,并于潛在跨膜區(qū)出現(xiàn)高疏水值區(qū)域[22]。為了初步查明本研究中所設(shè)計(jì)的多肽的性質(zhì),首先利用ProtScale程序?qū)Π袠?biāo)肽與互補(bǔ)肽序列進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,靶標(biāo)肽的最低分值-0.511位于第10位氨基酸,表明親水性最強(qiáng);最高分值0.544位于第13位氨基酸,說(shuō)明疏水性最強(qiáng)(圖2-A),整條多肽鏈親水域高于疏水域;而互補(bǔ)肽鏈第14位氨基酸具有最低分值-0.844,親水性最強(qiáng);第8位氨基酸賴(lài)氨酸具有最高分值1.200,疏水性最強(qiáng)(圖2-B)。

2.1.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,靶標(biāo)肽結(jié)構(gòu)多樣,66.7%為延伸股,16.6%為無(wú)規(guī)則卷曲,8.3%為β轉(zhuǎn)角,8.3%為α螺旋;互補(bǔ)肽66.7%為α螺旋,33.3%為無(wú)規(guī)則卷曲。與靶標(biāo)肽相比,互補(bǔ)肽結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。

A.靶標(biāo)肽親/疏水性預(yù)測(cè);B.互補(bǔ)肽親/疏水性預(yù)測(cè)。A.Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of target peptide;B.Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of complementary peptide.圖2 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of target peptide and complementary peptide

2.1.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 圖3-A為靶標(biāo)肽,紅色標(biāo)記從右向左依次為DEFFLIDEDYFD;同理,圖3-B中紅色標(biāo)記從右向左依次為KKFFLLRKYNWK。結(jié)果顯示靶標(biāo)肽的三維空間結(jié)構(gòu)存在較多延伸股,互補(bǔ)肽多為α螺旋,與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.2 酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果

將構(gòu)建好的載體提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定,電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。真核重組質(zhì)粒命名為pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽。

重組載體pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽提取質(zhì)粒后進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果(圖5)表明靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽分別正確插入pBiFC-VC155與pBiFC-VN173載體中。

2.3 BiFC分析靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽相互作用結(jié)果

按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn),轉(zhuǎn)染36 h后利用EVOS M7000智能全自動(dòng)活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)觀察BiFC熒光信號(hào)表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中出現(xiàn)BiFC熒光信號(hào),而在pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)均沒(méi)有熒光出現(xiàn)(圖6),證實(shí)互補(bǔ)肽與靶標(biāo)肽在活細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。

2.4 BiFC復(fù)合物的亞細(xì)胞定位

為了進(jìn)一步研究靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽在活細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位,把重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽和pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,并用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體標(biāo)記蛋白的抗體來(lái)對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)行染色,最后用間接免疫熒光技術(shù)研究靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽互作后形成的BiFC復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的定位情況。研究結(jié)果表明靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽互作后形成的BiFC復(fù)合物位于細(xì)胞核內(nèi),而不在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)(圖7)。

A.泳道1:pBiFC-VC155用SacI單酶切;泳道2:pBiFC-VN173用SacI單酶切;泳道3:pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽用SacI單酶切;泳道4:pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽用SacI單酶切;M:Marker DL5000.B.泳道1:pBiFC-VC155 用SacI/NheI雙酶切;泳道2:pBiFC-VN173用SacI/BamHI雙酶切;泳道3:pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽用SacI/NheI雙酶切;泳道4:pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽用SacI/BamHI雙酶切;M:Marker DL5000。A.Lane1:pBiFC-VC155 digested by SacI;Lane2:pBiFC-VN173 digested by SacI;Lane3:pBiFC-VC155-target peptide digested by SacI;Lane4:pBiFC-VN173-complementary peptide digested by SacI;M:DL5000 Marker.B.Lane1:pBiFC-VC155 digested by SacI/NheI;Lane2:pBiFC-VN173 digested by SacI/BamHI;Lane3:pBiFC-VC155-target peptide digested by SacI/NheI;Lane4:pBiFC-VN173-complementary peptide digested by SacI/BamHI;M:DL5000 Marker.圖4 重組載體pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽的酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion of recombinant plasmids pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide

紅色區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)肽(A)或互補(bǔ)肽(B),藍(lán)色區(qū)域?yàn)檩d體序列。The red region represented the target peptide (A) or complementary peptide (B),and the blue region represented the vector sequence.圖3 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Three-dimensional structure prediction of target peptide and complementary peptide

A.pBiFC-VC155空載測(cè)序圖;B.pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽測(cè)序圖;C.pBiFC-VN173空載測(cè)序圖;D.pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽測(cè)序圖。A.pBiFC-VC155 empty-load sequencing map;B.pBiFC-VC155-target peptide sequence scheme;C.pBiFC-VN173 empty-load sequencing scheme;D.pBiFC-VN173-complementary peptide sequence scheme.圖5 pBiFC-VC155與pBiFC-VN173空載以及pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽重組質(zhì)粒部分測(cè)序圖譜Fig.5 Partial sequencing map of pBiFC-VC155,pBiFC-VN173,pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide

3 討 論

通常情況下多肽是指由3個(gè)或者3個(gè)以上氨基酸分子組成的肽,寡肽是指氨基酸數(shù)目為2～10個(gè)的生物活性肽,其特點(diǎn)是可以像小分子一樣穿越細(xì)胞膜,通過(guò)生理屏障,吸收快速。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要以多肽類(lèi)藥物的形式參與臨床應(yīng)用,此外,多肽還可以診斷試劑來(lái)檢測(cè)病毒、細(xì)菌、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲(chóng)、錐蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)的抗體[23]。由于氨基酸序列短,特異性強(qiáng),且易于制備,因此常用作檢測(cè)抗原裝配的檢測(cè)試劑,其檢測(cè)相關(guān)病原微生物抗體的背景和假陽(yáng)性都很低,易于在臨床上推廣應(yīng)用[24]。當(dāng)前隨著新發(fā)人畜共患病的流行傳播以及城市伴侶動(dòng)物數(shù)量的不斷增多,對(duì)病原的快速檢測(cè)及質(zhì)量提出了更高的要求,目前的常規(guī)檢查方法已不能滿(mǎn)足現(xiàn)階段的需求,如不及時(shí)作出快速診斷和采取針對(duì)性的措施,將會(huì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)公共衛(wèi)生安全[25]。

本研究基于BiFC技術(shù)研究基于豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)的靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系以及亞細(xì)胞定位,為進(jìn)一步探索在臨床上利用該肽段進(jìn)行抗原檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)。研究中為了初步了解目標(biāo)多肽的基本理化特性,首先利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)設(shè)計(jì)的靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的親/疏水性、二/三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,靶標(biāo)肽整體呈親水性,二級(jí)結(jié)構(gòu)包含延伸股、無(wú)規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、α螺旋;互補(bǔ)肽二級(jí)結(jié)構(gòu)2/3為α螺旋,1/3為無(wú)規(guī)則卷曲,表明靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽分別帶有親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域,親水性結(jié)構(gòu)域都帶有正負(fù)電荷,能夠產(chǎn)生靜電引力;其次酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽和pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽真核表達(dá)質(zhì)粒;最后細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染后靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽能夠在Vero細(xì)胞內(nèi)形成在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光的BiFC復(fù)合物,表明兩者發(fā)生了相互作用;為進(jìn)一步了解該復(fù)合物的基本特性,本研究對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況進(jìn)行了初步研究,間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該BiFC復(fù)合物主要分布于細(xì)胞核中,為進(jìn)一步解析其功能提供了可能。本研究針對(duì)靶標(biāo)肽的局部位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)出與該位點(diǎn)相互作用的多肽,大大提高了針對(duì)性并設(shè)計(jì)出與蛋白質(zhì)不同功能域相互作用的多肽,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于蛋白質(zhì)相互作用的病原檢測(cè)新方法和篩選抗PEDV藥物積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

A.重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽單轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞;B.重組質(zhì)粒pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽單轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞;C.pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞;D.pBiFC-bFos-VC155與pBiFC-bJun-VN173共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照);E.pBiFC-VC155與pBiFC-VN173共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞(陰性對(duì)照)。A.Transfection of pBiFC-VC155-target peptide into Vero cells;B.Transfection of pBiFC-VN173-complementary peptide into Vero cells;C.Co-transfection of pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide into Vero cells;D.Co-transformation of pBiFC-bFos-VC155 and pBiFC-bJun-VN173 into Vero cells(positive control);E.Co-transformation of pBiFC-VC155 and pBiFC-VN173 into Vero cells(negative control).圖6 pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽在Vero細(xì)胞中的雙分子熒光互補(bǔ)Fig.6 BiFC of pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide in Vero cells

A.BiFC復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位;B.BiFC復(fù)合物在高爾基體中的定位。A.BiFC complex in the endoplasmic reticulum;B.BiFC complex in the Golgi apparatus.圖7 BiFC復(fù)合物在Vero細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of BiFC complex in Vero cells

4 結(jié) 論

本研究選取較為成熟的真核表達(dá)載體pBiFC-VC155與pBiFC-VN173作為骨架載體,將基于豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合域設(shè)計(jì)的靶標(biāo)肽插入pBiFC-VC155載體中,互補(bǔ)肽插入pBiFC-VN173,構(gòu)建一對(duì)真核重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染活細(xì)胞后通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào),證實(shí)靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽能在細(xì)胞內(nèi)形成BiFC復(fù)合物,存在相互作用;進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)該互作復(fù)合物定位在細(xì)胞核內(nèi)。綜上所述,基于豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)構(gòu)位點(diǎn)肽段人工設(shè)計(jì)與之相互作用的多肽方法可行,這為以后利用該肽段進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒抗原檢測(cè)和相關(guān)診斷提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持,具有潛在的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。