摘 要：以美樂葡萄營(yíng)養(yǎng)袋扦插苗為試材，噴施0.4 mg/L的EBR，置于不同低溫（4、0、-2 ℃）下4 h，研究EBR對(duì)美樂葡萄幼苗抗寒性的影響，為釀酒葡萄抗寒性的研究提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示：EBR處理提高了美樂葡萄葉片的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活性，增加了葡萄葉片中可溶性糖和脯氨酸含量，減少了電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量。SOD活性和脯氨酸含量分別比對(duì)照提高了32.12%、29.61%，MDA含量比CK處理降低了46.98%。EBR處理提高了美樂葡萄幼苗的抗寒性。

關(guān)鍵詞：低溫脅迫；外源油菜素內(nèi)酯；美樂葡萄

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

美樂（Vitis vinifera L.cv. Merlot）原產(chǎn)于法國(guó)波爾多，歐亞種，是世界上著名的紅葡萄品種，也是我國(guó)優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄品種之一[1]，在賀蘭山東麓被大面積種植。美樂適合沙質(zhì)地種植，喜歡溫暖氣候，對(duì)低溫反應(yīng)十分敏感，春季出土后易受晚霜凍危害[2]。

晚霜凍是中國(guó)北方早春時(shí)節(jié)常發(fā)生的自然災(zāi)害之一，輕者延緩葡萄的生長(zhǎng)、重者造成大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[3]。賀蘭山東麓是中國(guó)著名的葡萄酒產(chǎn)區(qū)之一，雖然有著適宜的氣候，但是此地葡萄也頻頻遭受晚霜凍的危害[4]。目前，應(yīng)對(duì)晚霜凍，大多數(shù)采用加熱、煙熏等方式來緩解[5]。油菜素內(nèi)酯（24-Epibrassinolide，EBR）是一種無毒且高效的植物激素[6]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)可提高植物的抗逆性，在抵御低溫脅迫中起著重要作用[7]。在對(duì)蘋果、葡萄、杏等果樹的研究中，發(fā)現(xiàn)噴施合適濃度的EBR能提高其抗寒力[8-10]；周偉江等[11]研究表明，EBR能緩解低溫對(duì)水稻幼苗的傷害，從而提高幼苗的抗寒性；惠竹梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，EBR處理可提高保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低細(xì)胞膜透性損傷，從而提高葡萄幼苗的抗寒性。本研究以美樂營(yíng)養(yǎng)袋扦插苗葡為試材，研究EBR對(duì)美樂葡萄幼苗抗寒性的影響，以期為進(jìn)一步研究EBR調(diào)控葡萄幼苗抗低溫脅迫的機(jī)理、利用EBR減輕葡萄幼苗低溫傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2021年5—7月在寧夏玉泉營(yíng)農(nóng)場(chǎng)國(guó)家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系水分生理與節(jié)水栽培崗位試驗(yàn)基地（38.28°N，106.24°E）進(jìn)行。以釀酒葡萄美樂營(yíng)養(yǎng)袋扦插苗為試材，營(yíng)養(yǎng)袋直徑10 cm、高15 cm，土樣配比為m（原土）∶m（珍珠巖）∶m（腐殖質(zhì)）=1∶1∶2，營(yíng)養(yǎng)袋苗在日光溫室經(jīng)過煉苗后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）EBR噴施處理：用36株長(zhǎng)勢(shì)一致的美樂營(yíng)養(yǎng)袋扦插苗，當(dāng)長(zhǎng)到6～7片葉子時(shí)，對(duì)葉片兩面噴施0.4 mg/L的EBR，清水為CK，噴施標(biāo)準(zhǔn)為直到葉片滴水。第1次噴施后隔1 d進(jìn)行第2次噴施，共計(jì)噴施2次，生長(zhǎng)3 d后進(jìn)行低溫處理。

2）低溫處理：幼苗噴施后放在低溫培養(yǎng)箱（BC1300）中，逐步降溫到4 ℃、0 ℃、-2 ℃時(shí)分別低溫處理4 h，然后逐漸升溫到4 ℃保持4 h，升降溫速率均為2 ℃/ h。然后采取葉片樣品，進(jìn)行抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性糖）與膜脂透性（MDA、電導(dǎo)率）的測(cè)定。

3）后期生長(zhǎng)：將低溫處理后的植株放入人工培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，設(shè)置晝夜光照時(shí)間分別為14 h和10 h，溫度分別為24 ℃和16 ℃，相對(duì)濕度為65%～85%，光照強(qiáng)度為3 000 lx，培養(yǎng)10 d后測(cè)量葉片生長(zhǎng)狀況。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1）生理指標(biāo)：使用浸泡法測(cè)電導(dǎo)率[13]，使用硫代巴比妥酸法測(cè)MDA含量，分別用氮藍(lán)四唑法、紫外吸收法、愈創(chuàng)木酚法測(cè)SOD、POD、CAT活性。用蔥酮法測(cè)可溶性糖含量，用酸性茚三酮法測(cè)脯氨酸含量[14]。

2）生長(zhǎng)指標(biāo)：用直尺測(cè)量株高、用手持葉面儀（YMJ-B型）測(cè)量最大葉葉面積，游標(biāo)卡尺測(cè)量基徑粗。

3）凍害情況：恢復(fù)程序結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)葉片和新梢的凍害情況。凍害率 =（植株上表現(xiàn)出凍害癥狀的葉片數(shù)（新梢數(shù)）/植株葉片（新梢）總數(shù)）×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013、SPSS 23和Origin 29b軟件進(jìn)行分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR處理對(duì)美樂葡萄新梢和葉片凍害率的影響

在低溫恢復(fù)過程結(jié)束后，對(duì)葉片和新梢的凍害率進(jìn)行調(diào)查。由表1可知，不同的低溫處理對(duì)葡萄幼苗葉片和新梢造成了不同程度的傷害。隨著溫度的不斷降低，新梢和葉片凍害率都呈上升趨勢(shì)，但經(jīng)EBR處理的葡萄幼苗葉片和新梢凍害率都低于CK處理，可見EBR處理緩解了低溫對(duì)葡萄幼苗新梢和葉片的傷害，從而提高了葡萄幼苗的抗寒性。

2.2 EBR處理對(duì)美樂葡萄葉片MDA和電導(dǎo)率的影響

低溫脅迫會(huì)使植物細(xì)胞膜被破壞，電解質(zhì)外滲，從而電導(dǎo)率增大。因此電導(dǎo)率越大，抗寒性越差。由圖1可知，CK處理和EBR處理的葡萄葉片的電導(dǎo)率隨著溫度的降低呈上升趨勢(shì)。CK處理始終高于EBR處理，可見EBR處理降低了細(xì)胞膜的損害，減少了電解質(zhì)的外滲，從而提高了葡萄葉片的抗寒性。CK處理和EBR處理葡萄葉片的MDA含量都隨著溫度的降低呈上升趨勢(shì)，當(dāng)在-2 ℃時(shí)EBR處理達(dá)到最高，比CK處理降低了46.98%，可見EBR處理的葡萄葉片隨著溫度的降低，MDA的含量也隨之降低，從而緩解低溫脅迫對(duì)葡萄葉片的影響，進(jìn)而提高葡萄幼苗的抗寒性。

2.3 EBR處理對(duì)美樂葡萄葉片SOD、POD、CAT活性的影響

由圖2（a—c）可知，CK處理和EBR處理的幼苗SOD活性隨著溫度的降低呈上升趨勢(shì)，經(jīng)EBR處理的SOD活性都顯著高于CK處理。分別比CK處理增加了26%、29.23%、32.12%?？梢姡珽BR處理提高了SOD的活性，從而緩解了低溫對(duì)葡萄葉片的傷害。CK處理的葡萄葉片POD活性隨著溫度的降低先降低后升高，EBR處理葉片POD活性隨著溫度的降低呈先升后降趨勢(shì)。隨著溫度的降低，CK處理的葉片在0 ℃時(shí)POD活性下降，在-2 ℃出現(xiàn)回升，經(jīng)EBR處理的葉片隨著溫度的降低，POD的活性逐漸增加，在0 ℃達(dá)到最高。比CK增加了1.91倍，在-2 ℃時(shí)出現(xiàn)下降，但仍高于CK處理?？梢婋S著溫度的降低，EBR處理組提高了葡萄葉片的POD活性，從而提高抗寒性。隨著溫度的不斷降低，CK處理和EBR處理的葡萄葉片的CAT活性都呈下降趨勢(shì)。經(jīng)EBR處理的萄萄葉片的CAT的活性顯著高于CK處理，在4 ℃時(shí)達(dá)到最高，比CK處理提高33.33%。隨著溫度的不斷降低，在溫度達(dá)到-2 ℃時(shí)，EBR處理對(duì)葉片的效果不顯著，但依然高于CK處理?？梢奅BR處理提高了CAT活性，從而緩解低溫對(duì)葡萄葉片的傷害，從而提高抗寒性。

2.4 EBR處理對(duì)美樂葡萄葉片脯氨酸和可溶性糖的影響

如圖3所示，CK處理和EBR處理的葉片脯氨酸含量隨著溫度的降低呈下降趨勢(shì)，EBR處理明顯高于CK處理，在4 ℃時(shí)達(dá)到最高，比CK處理提高29.61%?？梢奅BR處理提高了脯氨酸含量，緩解了低溫對(duì)葡萄葉片的傷害，從而提高了其抗寒性。CK處理組的可溶性糖含量隨著溫度的降低先升高后降低，CK處理在0 ℃時(shí)迅速上升，在-2 ℃時(shí)稍有降低。而EBR處理組則呈下降走勢(shì)，在溫度低于0 ℃時(shí)，EBR處理和CK處理雖然差異不太明顯，但EBR處理組始終高于CK處理，可見在低溫下EBR能增加葉片中可溶性糖的含量，提高葡萄葉片的抗寒性。

2.5 EBR處理對(duì)美樂葡萄地上部分生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表2可知，隨著溫度的降低，葡萄的株高、葉片數(shù)、葉面積和基徑粗都有降低趨勢(shì)。經(jīng)EBR處理的各生長(zhǎng)指標(biāo)都大于CK處理。株高比CK提高了16%、28%、8%，葉面積比CK處理提高了78%、46%、30%，葉片數(shù)和基徑粗差異不明顯。隨著溫度的降低，新葉和基徑粗生長(zhǎng)速度慢，但經(jīng)EBR處理，有所回升，但仍生長(zhǎng)緩慢。說明EBR處理有利于低溫脅迫后，提高葡萄幼苗的株高、基徑粗、葉片數(shù)、葉面積，從而促進(jìn)葡萄幼苗的生長(zhǎng)。

2.6 葡萄葉片生理指標(biāo)與抗寒性的相關(guān)性分析

由表3可知，噴施油菜素內(nèi)酯在不同的溫度下美樂葡萄的電導(dǎo)率與基徑粗呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），與株高呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），由此可知，釀酒葡萄葉片中電導(dǎo)率與抗寒性呈極顯著負(fù)相關(guān)。CAT活性與葉面積、株高、基徑粗呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），與葉片數(shù)呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），由此可知：美樂葡萄葉片中CAT活性與抗寒性呈極顯著正相關(guān)。MDA含量與葉面積和葉片數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）?？扇苄蕴桥c基徑粗與株高呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），脯氨酸含量與葉面積呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），與葉片數(shù)呈顯著性正相關(guān)（Plt;0.05）。由相關(guān)性分析可得，葡萄葉片的電導(dǎo)率越低，幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)越好，抗寒性越強(qiáng)。葡萄葉片中的CAT活性、可溶性糖和脯氨酸含量都與抗寒性相關(guān)。

3 討論

低溫脅迫會(huì)造成細(xì)胞膜透性損傷，產(chǎn)生MDA，使大量的電解質(zhì)外滲，使電導(dǎo)率增大，從而影響植物的生長(zhǎng)[15]?？扇苄蕴呛透彼崾侵参矬w的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增加細(xì)胞液的濃度，對(duì)原生質(zhì)起保護(hù)作用，增加幼苗的抗寒性[16]。SOD、POD、CAT作為植物體內(nèi)的抗氧化酶，能積極參與對(duì)抗低溫脅迫帶來的危害[17]。張小貝等[18]研究表明，EBR處理甘薯可降低細(xì)胞的電導(dǎo)率和MDA含量，從而提高其抗寒性。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的不斷降低，經(jīng)EBR處理的葡萄葉片電導(dǎo)率和MDA含量始終低于CK處理，EBR處理能降低MDA和電導(dǎo)率含量，從而促進(jìn)葉片的抗寒性。隨著溫度的降低，經(jīng)EBR處理的脯氨酸和可溶性糖含量都高于CK處理，說明一定濃度的EBR可以提高脯氨酸和可溶性糖含量，從而促進(jìn)葉片的抗寒性，這與普布卓瑪?shù)萚19]的研究一致。吳旺嬪等[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，EBR處理的水稻種子的POD和SOD活性都顯著增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后，經(jīng)EBR處理的葡萄葉片SOD、POD、CAT活性都高于CK處理，這與前人的研究結(jié)果一致，說明一定濃度的EBR能顯著提高葡萄葉片中的保護(hù)酶活性，清除過多的活性氧，進(jìn)而增強(qiáng)葡萄葉片的抗寒性。

低溫脅迫下植物的表型等通常會(huì)發(fā)生變化[21]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢等[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下EBR處理能提高水稻株高、莖粗等生長(zhǎng)量[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，CK處理的葡萄幼苗的生長(zhǎng)量低于EBR處理，說明EBR能夠顯著提高葡萄幼苗的生長(zhǎng)，這與前人研究結(jié)果一致[24]。因此，可通過噴施一定濃度的EBR來提高葡萄幼苗對(duì)低溫脅迫的抗性。

由相關(guān)性分析可知，膜脂透性與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)都和抗寒性呈正相關(guān)，經(jīng)一定濃度EBR處理后，可降低電導(dǎo)率和MDA含量，增加CAT活性，增加脯氨酸和可溶性糖含量，提高葡萄幼苗的抗寒力，從而促進(jìn)葡萄幼苗的生長(zhǎng)，這與前人研究一致[25]。

4 結(jié)論

EBR通過提高葡萄葉片的保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低細(xì)胞膜透性損傷和電解質(zhì)外滲來維持葉片生長(zhǎng)代謝平衡，進(jìn)而提高葡萄葉片的抗寒性，促進(jìn)了葡萄幼苗的生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉松濤，李茜，呂雯，等.中國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)：以寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)為例[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（9）：241-243.

[2] 王銳，孫權(quán)，郭潔，等.賀蘭山東麓砂質(zhì)釀酒葡萄園土壤水分分布研究[J].灌溉排水學(xué)報(bào)，2013，32（1）：69-73.

[3] 劉升，張長(zhǎng)儉，戚尚恩.一次罕見晚霜凍對(duì)春季葡萄的凍害及晚霜凍的預(yù)防[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（20）：12364-12365.

[4] 李倩，李映龍，劉子雨，等.萌芽前枝蔓噴施S-誘抗素、水楊酸和萘乙酸對(duì)‘北紅’葡萄抗晚霜性的影響[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2019，40（2）：29-32.

[5] 孫玉，王國(guó)槐.外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物抗寒性的影響[J].作物研究，2011，25（3）：287-291.

[6] BETTI C，DELLA R F，PIACENTINI D，et al.Jasmonates，ethylene and brassinosteroids control adventitious and lateral rooting as stress avoidance responses to heavy metals and metalloids[J].Biomolecules，2021，11（1）：77.

[7] 任鴻雁，王莉，馬青秀，等.油菜素內(nèi)酯生物合成途徑的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2015，50（6）：768-778.

[8] 曲芳，姜麗梅.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紅富士蘋果抗寒性的影響[J].北方果樹，2001（3）：18-19.

[9] 練華山，李欣欣，林立金，等.表油菜素內(nèi)酯對(duì)夏黑葡萄幼苗生長(zhǎng)的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，33（10）：1889-1896.

[10] 張瑞杰，張杼潤(rùn)，金鵬，等.24-表油菜素內(nèi)酯減輕杏果實(shí)冷害及與活性氧的代謝關(guān)系[J].現(xiàn)代食品科技，2018，34（4）：39-44.

[11] 周偉江，吳旺嬪，唐才寶，等.外源油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗生長(zhǎng)及生理特性的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，29（9）：1410-1416.

[12] 惠竹梅，王智真，胡勇，等.24-表油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下葡萄幼苗抗氧化系統(tǒng)及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（5）：1005-1013.

[13] 陳愛葵，韓瑞宏，李東洋，等.植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定方法比較研究[J].廣東教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（5）：88-91.

[14] 高俊山，蔡永萍.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].2版，北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2018.

[15] 鄧天福，吳艷兵，李廣領(lǐng)，等.油菜素內(nèi)酯提高植物抗逆性研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，11：21-25.

[16] 趙芳芳，郭學(xué)良，劉研，等.冬前噴施EBR對(duì)‘美樂’葡萄枝條生理特性及萌芽的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022（3）：1-7.

[17] 張帆航，李澤，譚曉風(fēng)，等.不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2018，36（3）：17-24.

[18] 張小貝，祝志欣，南文卓，等.2，4-表油菜素內(nèi)酯（EBR）對(duì)菜用甘薯抗寒生理生化的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，44（3）：525-529.

[19] 普布卓瑪，羅藝嵐，高金柱，等.2，4表-油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下西藏野生垂穗披堿草幼苗抗氧化保護(hù)和滲透調(diào)節(jié)的影響[J].草地學(xué)報(bào)，2019，27（3）：547-552.

[20] 吳旺嬪，周偉江，唐才寶，等.2，4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下水稻種子萌發(fā)及生理特性的影響[J].分子植物育種，2020，18（13）：4427-4434.

[21] 袁凌云，朱世東，趙冠艷，等.油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)番茄幼苗抗冷效果的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（5）：205-208.

[22] 張娟，吳曉穎，許娜，等.2，4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)煙苗幼莖生長(zhǎng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2021（4）：1-6.

[23] 周偉江.油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下水稻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)特性的調(diào)控機(jī)制[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[24] GUPTA P，SRIVASTAVA S，SETH C S.2，4-Epibrassinolide and sodium nitroprusside alleviate the salinity stress in Brassica juncea L.cv.varuna through cross talk among proline，nitrogen metabolism and abscisic acid[J].Plant and Soil，2017，411（1-2），483-498.

[25] 趙芳芳.外源油菜素內(nèi)酯對(duì)‘美樂’葡萄枝條抗寒性的影響[D].銀川：寧夏大學(xué)，2021.

Effects of exogenous brassinolide on the resistance of Merlot grape seedlings to low temperature stress

Guo Xueliang， Wang Yuening， Liu Yan， Yin Mengting， He Yan， Wang Zhenping， Dai Hongjun

（School of Agricultural， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： The effects of 0.4 mg/L EBR on the cold resistance of Merlot grape seedlings were studied by spraying it on the cutting seedlings of Merlot grape and placing them at different low temperatures of 4 ℃， 0 ℃ and -2 ℃ for 4 hours， which can provide a theoretical basis for the research on the cold resistance of wine grapes. The results show that the EBR treatment improved the activity of catalase（CAT）， superoxide dismutase（SOD）and peroxidase （POD） in the leaves， increased the content of soluble sugar and proline， and decreased the conductivity and malondialdehyde（MDA） content. The SOD activity and proline content increased by 32.12% and 29.61% compared to the control， respectively， and the MDA content decreased by 46.98% compared to the group with CK treatment. EBR treatment improved the cold resistance of wine grape Merlot seedlings.

Key words： low temperature stress； exogenous brassinolide； Merlot； correlation analysis

（責(zé)任編輯 才 波）