關(guān)鍵詞： 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠；力學(xué)性能；形狀記憶；生物可降解；生物相容性

中圖分類(lèi)號(hào)： O63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

水凝膠因具有含水量高、生物相容性好、質(zhì)地柔軟等性能[1-3]，在生物組織、藥物載體、仿生智能材料等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景[4-6]。傳統(tǒng)的高分子水凝膠往往存在結(jié)構(gòu)單一、力學(xué)性能差等缺陷，從而大大限制了水凝膠的實(shí)際應(yīng)用[7]。國(guó)內(nèi)外科研人員就如何提高水凝膠的強(qiáng)度開(kāi)展了大量研究工作，提出了一系列新型高強(qiáng)度水凝膠體系[8-10]。Zhang 等[11] 通過(guò)構(gòu)建雙網(wǎng)絡(luò)（DN）結(jié)構(gòu)來(lái)提高水凝膠的力學(xué)性能，剛性第一網(wǎng)絡(luò)與柔性第二網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用，賦予水凝膠優(yōu)異的拉伸強(qiáng)度和模量。在先前的工作中[12]，本課題組通過(guò)簡(jiǎn)單的溶劑置換法，用甘油置換水凝膠中的水分子，單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的拉伸強(qiáng)度可提高至1.21 MPa。最近，有研究人員提出了一種“鹽析”處理方法，利用霍夫邁斯特（Hofmeister）效應(yīng)制備高強(qiáng)度水凝膠。通過(guò)強(qiáng)水合離子（kosmotrope離子）穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然折疊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致鹽析行為處理過(guò)程簡(jiǎn)單有效，不涉及復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)或制備過(guò)程[13，14]。明膠是一類(lèi)由膠原部分水解而得到的蛋白質(zhì)，基于明膠及Hofmeister 效應(yīng)制得的材料能應(yīng)用于傷口敷料[14，15]、藥物載體[16] 等領(lǐng)域，但對(duì)于其形狀記憶性能研究較少。

本文制備出一種由天然高分子明膠（Gel）、甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）組成的DN/SO₄^2?雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，其中第一層網(wǎng)絡(luò)由HEMA 經(jīng)化學(xué)交聯(lián)形成，交聯(lián)劑為雙鍵改性的甲基丙烯酰化明膠（GelMA），第二層網(wǎng)絡(luò)由明膠浸泡飽和硫酸鈉溶液獲得。所得水凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能和自恢復(fù)性能，并能被胰酶水解。Hofmeister效應(yīng)使得水凝膠分子鏈在高濃度鹽溶液中收縮，模量增大；在稀溶液中舒展膨脹，顯示出離子刺激響應(yīng)性，賦予水凝膠形狀記憶性能。此外，細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明該水凝膠具備良好的生物相容性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

明膠（Type A）、RPMI-1640 培養(yǎng)基：Sigma Aldrich；HEMA、2-羥基-4’-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮（I2959）、無(wú)水硫酸鈉（Na₂SO₄）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（ MTT） ：北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（ DMSO） ：無(wú)錫海碩生物有限公司；胰蛋白酶（酶活力≥5×10⁴ U/g）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GelMA：取代度90%，參照文獻(xiàn)[17] 合成。

1.2 水凝膠的制備

稱取不同質(zhì)量的Gel、HEMA 與交聯(lián)劑GelMA 溶于去離子水中，在60 ℃ 水浴鍋中攪拌均勻，然后在反應(yīng)溶液中加入光引發(fā)劑I2959（加入量為去離子水質(zhì)量的1%） ，用超聲波清洗機(jī)（中國(guó)賽飛有限公司SB-5200DTD 型，功率為240 W，頻率為45 kHz）除去氣泡。用注射器將上述混合溶液注入模具中（美國(guó)DYMAX公司ECE 2000 Modular Flood 型， 105 mW/cm²）紫外光照10 min 得到DN 水凝膠。光照結(jié)束后，將水凝膠浸泡到高濃度Na₂SO₄ 溶液（w=20%）中，得到DN/SO₄^2?水凝膠。

1.3 水凝膠的性能測(cè)試

1.3.1 力學(xué)性能測(cè)試 取DN/SO₄^2?水凝膠樣品（16 mm×4 mm×2 mm）在萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)（美國(guó)INSTRON 儀器公司5969 型）上進(jìn)行測(cè)試，拉伸速率為100 mm/min，根據(jù)所測(cè)試樣品的初始橫截面積和初始長(zhǎng)度計(jì)算拉伸應(yīng)力和應(yīng)變。

1.3.2 自恢復(fù)性能測(cè)試 取DN/SO₄^2?水凝膠樣品（ 16 mm×4 mm×2 mm）在萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行應(yīng)變?yōu)?50% 的拉伸循環(huán)測(cè)試，樣條恢復(fù)15 min 后再重復(fù)1 次測(cè)試。

1.3.3 可降解性能測(cè)試 制備直徑為1 cm、厚度為1 mm 的水凝膠樣品，37 ℃ 下分別浸入胰酶溶液及磷酸鹽緩沖液（PBS）中，水浴鍋（常州智博瑞儀器有限公司HH-1 型）中每隔2 h 觀察1 次降解情況，并拍照記錄。

1.3.4 形狀記憶測(cè)試 將DN/SO₄^2?水凝膠樣品進(jìn)行拉伸后固定成不同的形狀（打結(jié)、彎折、扭曲），再浸泡入低濃度Na₂SO₄ 溶液（w=2%）中，觀察水凝膠恢復(fù)至原始形狀的過(guò)程。

1.3.5 溶脹測(cè)試 準(zhǔn)確稱取一定量DN/SO₄^2?水凝膠樣品置于去離子水中，隔一段時(shí)間后取出，用濾紙吸掉表面多余水分并進(jìn)行稱重，按式（1）進(jìn)行溶脹率（SR）計(jì)算：

SR（%） = （m_t－m₀）／m₀×100% （1）

式中：mt 為t 時(shí)刻水凝膠溶脹后的質(zhì)量，m0 為溶脹前原始水凝膠質(zhì)量。

1.3.6 細(xì)胞毒性測(cè)試 將200 mg DN/SO42?水凝膠樣品浸泡于2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37 ℃ 水浴鍋中分別放置1、4、7 d。將小鼠成纖維細(xì)胞（L929）接種于96 孔板中，每孔5 000 個(gè)細(xì)胞。將96 孔板放于5% CO₂，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo 公司BB15 型）中培養(yǎng)24 h，再用200 μL 不同質(zhì)量濃度的水凝膠浸提液（12.5、25、50、100 mg/mL）替換96 孔板中的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h。每孔加入20 μL 的MTT 溶液（ 5 mg/mL） ，孵育4 h 后，去掉上清液，并加入DMSO，放置在搖床上振蕩10 min。最后用酶標(biāo)儀（中國(guó)華東電子公司DG5033A型）檢測(cè)每孔在492 nm 處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠的力學(xué)性能

2.1.1 各組分含量對(duì)水凝膠力學(xué)性能的影響 水凝膠由剛性的聚甲基丙烯酸羥乙酯（PHEMA）網(wǎng)絡(luò)及柔性明膠網(wǎng)絡(luò)組成[18]，在受到外力作用時(shí)，剛性PHEMA 網(wǎng)絡(luò)發(fā)生斷裂消耗能量，物理交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)了水凝膠的斷裂應(yīng)變及韌性，保持了水凝膠的完整性[19，20]。固定w_GelMA=10%，w_HEMA=40%，浸泡時(shí)間為16 h，由不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Gel 制備的DN/SO₄^2?水凝膠拉伸曲線如圖1（a）所示，從中可以看到，隨著w_Gel 從10% 增加到25%，DN/SO₄^2?水凝膠的模量持續(xù)增加，拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率先增加后下降，這是因?yàn)镈N/SO₄^2?水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的明膠分子鏈密度增加，分子鏈的折疊和沉淀也增加[21]；當(dāng)w_Gel 過(guò)大時(shí)，DN/SO₄^2?水凝膠脆性增加，導(dǎo)致斷裂伸長(zhǎng)率降低。當(dāng)w_Gel=20% 時(shí)，DN/SO₄^2?水凝膠的拉伸性能最優(yōu)，拉伸強(qiáng)度為0.94 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為496%。

固定wGel=20%，wHEMA=40%，浸泡時(shí)間為16 h，wGelMA 對(duì)DN/SO₄^2?水凝膠拉伸性能的影響如圖1（b）所示。隨著wGelMA 從5% 增加到10%， DN/SO₄^2?水凝膠的拉伸強(qiáng)度從0.89 MPa 增加到0.94 MPa， 斷裂伸長(zhǎng)率從459% 增加到496%，隨著wGelMA 繼續(xù)增加，水凝膠網(wǎng)絡(luò)中交聯(lián)點(diǎn)增加，限制了鏈段運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致拉伸性能下降。

固定wGel=20%，wGelMA=10%，浸泡時(shí)間為16 h，wHEMA 對(duì)DN/SO₄^2?水凝膠拉伸性能的影響如圖1（c）所示。當(dāng)w_HEMA=40% 時(shí)，DN/SO₄^2?水凝膠具有最優(yōu)的拉伸性能。當(dāng)w_HEMA=27% 時(shí)，DN/SO₄^2?水凝膠的拉伸強(qiáng)度僅為0.35 MPa；當(dāng)w_HEMA 增加到47% 時(shí)，由于網(wǎng)絡(luò)剛性過(guò)大，DN/SO₄^2?水凝膠的斷裂伸長(zhǎng)率從40% 時(shí)的496%下降到318%，拉伸強(qiáng)度下降到0.73 MPa。

2.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)水凝膠力學(xué)性能的影響 圖2 所示為在Na₂SO₄ 溶液中浸泡不同時(shí)間后DN/SO₄^2?水凝膠（固定w_Gel=20%，w_GelMA=10%，w_HEMA=40%）的拉伸曲線圖，從8 h 增加到16 h 后，DN/SO₄^2?水凝膠的拉伸強(qiáng)度大幅度提升，在鹽析作用下，明膠分子鏈形成聚集區(qū)域[22，14]。繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，拉伸性能的提高不明顯，考慮到時(shí)間成本選擇16 h 為最佳浸泡時(shí)間。綜上所述， DN/SO₄^2?水凝膠的最佳配方為w_Gel 為20%， w_GelMA 為10%， w_HEMA 為40% ， 浸泡于鹽溶液中16 h，后文中的DN/SO₄^2?水凝膠均以此配方制備。

2.2 水凝膠自恢復(fù)性能

圖3（a ）為DN/SO₄^2?水凝膠在250% 應(yīng)變下的拉伸循環(huán)曲線圖，圖中明顯的滯回環(huán)表明水凝膠在拉伸過(guò)程中發(fā)生了能量耗散。在不間斷的第二次循環(huán)中，水凝膠的滯回環(huán)明顯減小，說(shuō)明水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞且還未恢復(fù)。15 min 后再次進(jìn)行拉伸，循環(huán)曲線已經(jīng)恢復(fù)到原始狀態(tài)，強(qiáng)度和耗散能略有提升，這可能是因?yàn)榉肿渔溤诶旆较虬l(fā)生了重排。在拉伸斷裂的樣條中截取一段繼續(xù)測(cè)試，其拉伸性能與原始水凝膠相差不大（圖3（b））。從圖3（c）的實(shí)物照片中也可以看出，剛經(jīng)過(guò)拉伸的水凝膠形狀有所改變，無(wú)法立即恢復(fù)，但是靜置15 min后，能夠恢復(fù)原貌。以上數(shù)據(jù)都證實(shí)了DN/SO₄^2?水凝膠具有良好的自恢復(fù)性能，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的抗疲勞性。

2.3 水凝膠降解性能

胰蛋白酶可以分解多種包括明膠在內(nèi)的蛋白質(zhì)[23]，明膠網(wǎng)絡(luò)以及作為PHEMA 網(wǎng)絡(luò)化學(xué)交聯(lián)點(diǎn)的GelMA 均可被胰蛋白酶水解。DN 及DN/SO₄^2?水凝膠在不同溶液中的降解情況如圖4 所示，DN 水凝膠及DN/SO₄^2?水凝膠在胰蛋白酶作用下，都能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全降解，溶液由透明變渾濁；而浸泡于PBS 中的兩種水凝膠在4 h 后依然保持完整結(jié)構(gòu)，沒(méi)有發(fā)生降解。

2.4 水凝膠的形狀記憶性能

水凝膠的鹽響應(yīng)形狀恢復(fù)過(guò)程如圖5（a）所示，DN/SO₄^2?水凝膠在折疊、扭曲和打結(jié)后，可以保持固定的形狀，然后將高度變形的水凝膠樣條浸入低濃度Na₂SO₄ 溶液，樣條能5 min 內(nèi)快速恢復(fù)到原來(lái)的形狀。這表明鹽析的水凝膠表現(xiàn)出良好的形狀記憶性能，由溶液的離子強(qiáng)度觸發(fā)。當(dāng)浸泡于高濃度Na₂SO₄ 溶液后，通過(guò)Hofmeister 效應(yīng)增強(qiáng)的明膠分子鏈之間的氫鍵和疏水相互作用為臨時(shí)物理交聯(lián)形成第二網(wǎng)絡(luò)，而PHEMA相的化學(xué)交聯(lián)形成第一網(wǎng)絡(luò)，2 個(gè)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用保持結(jié)構(gòu)完整，賦予水凝膠優(yōu)異的力學(xué)性能，并穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)以固定永久形狀[24，25]。當(dāng)鹽析水凝膠放入低濃度Na₂SO₄ 水溶液中時(shí)，低濃度鹽溶液的滲透壓小于水凝膠內(nèi)部，水分子被吸附到變形的水凝膠中，導(dǎo)致水凝膠膨脹[26]。因此，作為臨時(shí)物理交聯(lián)點(diǎn)的氫鍵和疏水相互作用被解離。形狀固定過(guò)程中彈性變形所儲(chǔ)存的能量被釋放，導(dǎo)致水凝膠恢復(fù)到原來(lái)的形狀[18]。

2.5 水凝膠的溶脹性能和細(xì)胞毒性

圖6（a）所示為DN/SO₄^2?水凝膠的溶脹曲線。從圖中可以看出，DN/SO₄^2?水凝膠在室溫下（25 ℃）的溶脹率為285%，在37 ℃ 下的溶脹率為320%，這是由于溫度升高，水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的氫鍵作用力被削弱，高分子鏈從互相纏繞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致溶脹率升高。

通過(guò)MTT 法測(cè)試了與DN/SO₄^2?水凝膠浸出液共培養(yǎng)后的L929 細(xì)胞的活力，結(jié)果如圖6 （b）所示，浸泡1、4、7 d 后的水凝膠浸出液，在稀釋成不同濃度后與L929 細(xì)胞共培養(yǎng)，均未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯損害，細(xì)胞存活率都在80% 以上。

3 結(jié)論

（1）制備出一種基于明膠及其衍生物、HEMA 的DN/SO₄^2?雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。第一網(wǎng)絡(luò)由HEMA 經(jīng)化學(xué)交聯(lián)形成，第二網(wǎng)絡(luò)由明膠浸泡高濃度Na₂SO₄ 溶液獲得。

（2） DN/SO₄^2?水凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能，當(dāng)明膠、GelMA 和HEMA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、10%、40% 時(shí)，水凝膠拉伸性能最優(yōu)，拉伸強(qiáng)度為0.94 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為496%，同時(shí)可恢復(fù)性能優(yōu)異。

（3）Hofmeister 效應(yīng)使得水凝膠分子鏈在高濃度Na₂SO₄ 溶液中收縮，模量增大；在低濃度Na₂SO₄ 溶液中舒展膨脹，顯示出離子刺激響應(yīng)性。水凝膠在25 ℃ 和37 ℃ 下溶脹率分別為285%、320%。此外，該水凝膠具備良好的生物相容性和生物可降解性。