陳麗飛，李嘉峻，劉云怡慧，白 云，孟 緣，李 江，周蘊(yùn)薇

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與草學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.定西市水土保持科學(xué)研究所，甘肅 定西 743000；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

萱 草（Hemerocallisspp.）屬 阿 福 花 科（Asphodelaceae）萱草屬（Hemerocallis），多年生草本植物，民間多稱其“忘憂草”[1-2]。萱草屬植物分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、品種繁多、觀賞價(jià)值高，被稱為中國(guó)的“母親花”。大苞萱草（Hemerocallis middendorffii）是現(xiàn)代萱草的原始親本之一，主要分布在我國(guó)東北、華北等地。大苞萱草抗旱能力強(qiáng)、花色艷麗，而且具有二次開(kāi)花特性，可廣泛應(yīng)用于各類(lèi)園林綠地或進(jìn)行盆栽裝飾。

干旱不僅限制著植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)影響植物體的代謝功能，降低光合速率、蒸騰速率以及抑制植物生長(zhǎng)[3]。干旱是植物非生物脅迫的主要原因之一，迫使植物發(fā)生形態(tài)和生理變化[4]。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)主要表現(xiàn)為根系和葉片結(jié)構(gòu)的改變，生理水平主要表現(xiàn)為光合作用、滲透調(diào)節(jié)代謝、抗氧化代謝及激素物質(zhì)等方面的變化，而分子水平則是調(diào)控抗旱調(diào)節(jié)基因和功能基因的表達(dá)，改變功能性蛋白和有機(jī)分子合成酶的編碼，進(jìn)而影響干旱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及激素、滲透物質(zhì)的合成和積累[5]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的主要特征在于其包含60 個(gè)左右氨基酸DNA 結(jié)合區(qū)的WRKY 域，其中包含一個(gè)高度保守的七肽序列（WRKYGQK）。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物防御生物及非生物脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。超表達(dá)的WRKY 家族基因能夠幫助植物在干旱環(huán)境中維持較好的水分狀況，緩解因干旱所造成的萎蔫及生長(zhǎng)抑制[7]。在大豆研究中，過(guò)表達(dá)的GmWRKY54可能通過(guò)激活A(yù)BA 以及Ca2+信號(hào)通路來(lái)控制氣孔的關(guān)閉，增強(qiáng)大豆的抗旱能力[8]。在干旱脅迫下，植物會(huì)受到諸如活性氧（ROS）損傷等次生脅迫損傷。VlWRKY48能提高葡萄過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性，清除活性氧來(lái)提高其抗旱性[9]。

目前，對(duì)于大苞萱草的開(kāi)發(fā)利用還不充分，關(guān)于大苞萱草在分子層面響應(yīng)干旱脅迫的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，不利于深入研究大苞萱草的抗旱機(jī)制。鑒于此，以大苞萱草為試驗(yàn)材料，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)干旱脅迫下的大苞萱草WRKY 基因（HmWRKY）進(jìn)行鑒定、構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)、分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)等，根據(jù)HmWRKY基因的表達(dá)特性，明確候選基因，為進(jìn)一步研究HmWRKY基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

供試材料大苞萱草取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)野生花卉資源圃，選取田間長(zhǎng)勢(shì)一致且植株健壯的大苞萱草幼苗移栽至高13 cm、直徑10 cm 的塑料花盆中，單株單盆，栽培基質(zhì)為草炭、珍珠巖按體積比3∶1混合配制成的營(yíng)養(yǎng)土，進(jìn)行正常的盆栽管理。緩苗后，將供試材料分為對(duì)照組（CK 組）和干旱脅迫處理組（D組）。干旱處理前使各組均處于飽和含水狀態(tài)，處理后，CK 組每3 d 澆一次水，D 組采取自然失水脅迫的方式處理。于5 d 后的10：00 對(duì)CK 組和D組進(jìn)行取樣，每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將嫩葉和新根放入液氮中帶回并存放在-80 ℃冰箱保存，備用。RNA 的提取、質(zhì)控、建庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組的三代測(cè)序均由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 HmWRKY基因家族成員鑒定

以大苞萱草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為材料。在TAIR網(wǎng) 站（https://www.arabidopsis.org/）下 載 擬 南 芥WRKY 基因家族的轉(zhuǎn)錄因子序列和蛋白質(zhì)序列，共72 個(gè)。通過(guò)本地blast+進(jìn)行比對(duì)，篩選出大苞萱草的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。利用Smart（http://smart.emblheidelberg.de/）在線軟件進(jìn)行鑒定以確保含有WRKY 保守域，通過(guò)NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）在線軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域完整性的預(yù)測(cè)。

1.3 HmWRKY基因家族成員生物信息學(xué)分析

1.3.1 HmWRKY 基因家族聚類(lèi)分析及多重序列比對(duì) 利用MEGA 7 對(duì)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白構(gòu)建進(jìn) 化 樹(shù)（Neighbor-joining，NJ），Bootstrap 設(shè) 置 為1 000次重復(fù)，其余參數(shù)選擇默認(rèn)值[10]。利用序列分析軟件DNAMAN 6.0 對(duì)HmWRKY 蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，截取包含WRKY 結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，通過(guò)TBtools 軟件的SeqLogo 繪制HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的logo圖。

1.3.2 HmWRKY 基因家族的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)HmWRKY蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中包括氨基酸序列長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、總平均親水性、不穩(wěn)定系數(shù)以及脂溶性系數(shù)。使 用CELLO v.2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）對(duì)HmWRKY 家族成員進(jìn)行植物細(xì)胞的亞細(xì)胞定位，整理數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總。

1.3.3 HmWRKY 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa-sopma.html）在線軟件對(duì)大苞萱草WRKY蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.4 HmWRKY 蛋白保守基序分析 通過(guò)在線軟件MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）對(duì)HmWRKY 蛋白保守基序進(jìn)行搜索，搜索參數(shù)設(shè)置為最大搜索數(shù)量20 個(gè)，ZOOPS 參數(shù)設(shè)置為Zero or one occurrence per sequence，其余參數(shù)使用網(wǎng)頁(yè)默認(rèn)設(shè)置。最后使用TBtools將HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守基序可視化。

1.3.5 HmWRKY 基因家族在葉和根中的表達(dá)分析 利用北京諾禾致源科技股份有限公司提供的售后平臺(tái)工具NovoMagic（https://magic.novogene.com/customer/main#/login）分別制作處理組與對(duì)照組葉和根中HmWRKY基因家族41個(gè)成員的表達(dá)模式熱聚圖。

1.4 HmWRKY 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）分析

將公司測(cè)序后剩余的樣品進(jìn)行液氮研磨，使用RNApure Plant Kit（DNase Ⅰ）植物RNA 提取試劑盒（DNase Ⅰ）提取葉片總RNA，使用NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis（gDNA Purge）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，使用Primer 5.0進(jìn)行qRT-PCR 引物設(shè)計(jì)（表1），內(nèi)參基因?yàn)镠fEF-1α（GenBank No.MT096368）[11]。qRT-PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Mix 主混合物10 μL，上下游引物各1 μL，模板（cDNA）2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃1 min；95 ℃20 s、60 ℃20 s、72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[12]。

表1 HmWRKY基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences for HmWRKY gene

2 結(jié)果與分析

2.1 HmWRKY基因家族成員鑒定

通過(guò)本地blast+與擬南芥WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中共篩選出182 個(gè)大苞萱草WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。利用在線軟件Smart鑒定以確保含有WRKY 保守域，通過(guò)NCBI 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域的完整性。最終得到41 個(gè)大苞萱草WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，并將這些基因命名為HmWRKY1—HmWRKY41。

2.2 HmWRKY基因家族成員生物信息學(xué)分析

2.2.1 HmWRKY 基因家族聚類(lèi)分析及多重序列比對(duì) 將41 個(gè)HmWRKY 蛋白與72 個(gè)擬南芥WRKY蛋白進(jìn)行多序列分析并通過(guò)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖1）。WRKY DNA 結(jié)構(gòu)域（DBD）的特征是在其N(xiāo) 端有一個(gè)不變的七肽WRKYGQK 氨基酸基序，在其C端包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指狀基序的特征將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類(lèi)，其中Ⅱ類(lèi)分為5個(gè)亞類(lèi)。

圖1 大苞萱草和擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子聚類(lèi)分析Fig.1 Cluster analysis of WRKY transcription factors in Hemerocallis middendorffii and Arabidopsis thaliana

WRKY 結(jié)構(gòu)域高度保守，多重序列比對(duì)結(jié)果如圖2 和圖3 所示。WRKYGQK 的氨基酸序列存在替換的現(xiàn)象。Ⅰ類(lèi)共有8個(gè)HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子，含有2 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為CX7CX24～25HXH 型。Ⅱ類(lèi)共有30 個(gè)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，只含有1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域且鋅指結(jié)構(gòu)為CX7CX25HXH 型，Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子均有不同程度的七肽結(jié)構(gòu)變異和鋅指結(jié)構(gòu)缺失的現(xiàn)象。Ⅲ類(lèi)有4 個(gè)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，含有1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為CX7CX25HXC 型，Ⅲ類(lèi)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)保守，七肽結(jié)構(gòu)不發(fā)生變異且鋅指結(jié)構(gòu)完整。

圖2 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Conservative domain analysis of HmWRKY transcription factor family

圖3 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Fig.3 Conservative domain analysis of HmWRKY transcription factor family

2.2.2 HmWRKY 基因家族的理化性質(zhì)分析HmWRKY 基因家族成員的理化性質(zhì)差異性較大（表2），HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸數(shù)目在92（HmWRKY11）～641（HmWRKY7），分 子 質(zhì) 量 在10 551.76（HmWRKY11）～69 972.1（HmWRKY7）ku，理論等電點(diǎn)在4.97（HmWRKY26）～9.99（HmWRKY24），脂溶性指數(shù)在47.08（HmWRKY26）～75.93（HmWRKY6），41 個(gè)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的親水性平均值均為負(fù)值，判定為親水性蛋白。除HmWRKY2、HmWRKY4、HmWRKY5、HmWRKY27、HmWRKY41 為穩(wěn)定蛋白外，其余均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＞40）。HmWRKY 家族成員亞細(xì)胞定位結(jié)果如表3所示，除HmWRKY41 定位在線粒體中外，其余的HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子均定位在細(xì)胞核中。

表2 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的理化性質(zhì)Tab.2 Physicochemical properties of HmWRKY transcription factor proteins

續(xù)表2 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的理化性質(zhì)Tab.2（Continued）Physicochemical properties of HmWRKY transcription factor proteins

2.2.3 HmWRKY 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 41 個(gè)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無(wú)規(guī)卷曲，無(wú)其他二級(jí)結(jié)構(gòu)（表4）。絕大多數(shù)HmWRKY 蛋白都表現(xiàn)出無(wú)規(guī)卷曲數(shù)＞α-螺旋數(shù)≥延伸鏈數(shù)＞β-折疊數(shù)的特點(diǎn)，但少數(shù)蛋白質(zhì)，如HmWRKY11、HmWRKY16、HmWRKY17等表現(xiàn)出無(wú)規(guī)卷曲數(shù)＞延伸鏈數(shù)＞α-螺旋數(shù)＞β-折疊數(shù)的特點(diǎn)。

表4 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Tab.4 Secondary structure of HmWRKY transcription factor proteins %

續(xù)表4 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Tab.4（Continued）Secondary structure of HmWRKY transcription factor proteins %

2.2.4 HmWRKY 蛋白保守基序分析 HmWRKY蛋白序列的保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。Motif 1 是WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的特征基序且組成了WRKY 結(jié)構(gòu)域。除HmWRKY24、HmWRKY26、HmWRKY27 和HmWRKY30外，其他成員均包含Motif 1。Motif 2和Motif 5 共同構(gòu)成C2H2型的鋅指結(jié)構(gòu)域，存在于大多數(shù)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子中。Ⅰ類(lèi)成員幾乎全包含Motif 5、Motif 17 以 及 在N 端、C 端 分 別 含 有1 組Motif 1 和Motif 2。Ⅱ類(lèi)成員的Motif種類(lèi)繁多，但呈現(xiàn)出在進(jìn)化樹(shù)中親緣關(guān)系較近的各亞類(lèi)成員，包含Motif 種類(lèi)也基本一致的規(guī)律，如Ⅱa 亞類(lèi)與Ⅱb 亞類(lèi) 除HmWRKY2 外，均 包 含Motif 19；Ⅱc 亞 類(lèi)HmWRKY33 和HmWRKY39 的Motif 種類(lèi)完全相同且成員多數(shù)包含Motif 4；Ⅱd 亞類(lèi)HmWRKY14 和HmWRKY37包含的Motif種類(lèi)以及排列順序完全相同，其他成員幾乎都包含Motif 7。Ⅲ類(lèi)成員中存在的Motif種類(lèi)比較單一，只包含Motif 1和Motif 2。

圖4 HmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序Fig.4 Conserved motif of HmWRKY transcription factor family

2.2.5 HmWRKY 基因家族在葉和根中的表達(dá)分析 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，對(duì)比HmWRKY 基因家族的41 個(gè)成員在不同處理下葉和根中的表達(dá)見(jiàn)圖5，在葉中有10 個(gè)上調(diào)基因，29 個(gè)下調(diào)基因，其中HmWRKY25和HmWRKY32在 葉 中 無(wú) 表 達(dá)。HmWRKY22、HmWRKY9上 調(diào) 較 明 顯，HmWRKY2、HmWRKY11、HmWRKY12、HmWRKY20、HmWRKY26、HmWRKY30、HmWRKY34和HmWRKY36下 調(diào) 較 明顯。41 個(gè)HmWRKY基因在根中均有表達(dá)，其中有20 個(gè)上調(diào)基因，21 個(gè)下調(diào)基因。HmWRKY4、HmWRKY8、HmWRKY14、HmWRKY15、HmWRKY22、HmWRKY23、HmWRKY24、HmWRKY35在受到干旱脅迫時(shí)，表達(dá)量上調(diào)較為明顯。HmWRKY2、HmWRKY16、HmWRKY27、HmWRKY30、HmWRKY41在下調(diào)基因中表達(dá)量變化較為明顯。

圖5 大苞萱草葉片和根中HmWRKY基因在不同處理下的表達(dá)模式熱聚圖Fig.5 Thermopolygram of HmWRKY gene expression pattern under different treatments in leaves and roots of Hemerocallis middendorffii

HmWRKY差異基因的表達(dá)變化如圖6 所示，在葉中共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)差異基因，1 個(gè)上調(diào)基因，9 個(gè)下調(diào)基因。大苞萱草受到干旱脅迫后，只有HmWRKY9的表達(dá)量升高。下調(diào)的差異基因中HmWRKY2、HmWRKY26和HmWRKY30的表達(dá)量變化顯著。在根中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)差異基因，其中3 個(gè)上調(diào)基因，1 個(gè)下調(diào)基因。HmWRKY4和HmWRKY24上調(diào)趨勢(shì)比較明顯，可能在根系中起到積極的調(diào)控作用。此外，通過(guò)葉和根的差異基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HmWRKY2在2個(gè)組織內(nèi)均有表達(dá)且均為負(fù)表達(dá)，表達(dá)量變化十分明顯。

圖6 大苞萱草葉片和根中HmWRKY差異基因在不同處理下的表達(dá)水平Fig.6 Expression of HmWRKY differential gene under different treatments in leaves and roots of Hemerocallis middendorffii

2.3 候選差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證候選差異基因HmWRKY9在葉中表達(dá)量的正確性，進(jìn)行qRT-PCR 分析。結(jié)果如圖7 所示，HmWRKY9在受到干旱脅迫后，表達(dá)量升高，正向響應(yīng)了干旱脅迫。HmWRKY9的qRT-PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的變化趨勢(shì)基本一致，從而驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與討論

WRKY 基因家族在植物體中響應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫以及非生物脅迫等過(guò)程，在非生物脅迫中對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮重要作用。CmWRKY10通過(guò)ABA 途徑來(lái)調(diào)控菊花的干旱耐受性[13]，水稻在干旱脅迫條件下過(guò)表達(dá)OsWRKY11可增強(qiáng)其耐旱性[14]，過(guò)表達(dá)AtWRKY30轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著提高小麥的耐旱能力[15]。以上研究均揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員可提高植物抗旱能力。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共挖掘出41 個(gè)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子。將HmWRKY 基因家族與已公布的擬南芥WRKY 基因共同構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行聚類(lèi)分析，HmWRKY 基因家族的分類(lèi)與擬南芥WRKY 基因家族的分類(lèi)一致，表明本試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有可靠性，HmWRKY 基因家族在進(jìn)化上相對(duì)保守。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的七肽和鋅指結(jié)構(gòu)是WRKY 基因行使功能的兩大基團(tuán)，隨著植物進(jìn)化，這兩大基團(tuán)的氨基酸組成也有所變化。Ⅰ類(lèi)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子中只有HmWRKY41N 端的七肽結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，變異為“WRKYGPK”，Ⅱ類(lèi)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的七肽結(jié)構(gòu)易發(fā)生變異，其中變異為“WKKYGQK、WRKYGKK、WRKYGEK”[16-17]。Ⅲ類(lèi)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域相比前兩類(lèi)保守，沒(méi)有發(fā)生變異情況。ZHANG 等[16]針對(duì)真核生物WRKY 基因的研究發(fā)現(xiàn)，WRKY 家族成員有19 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域的變異，WRKYGEK 和WRKYGKK 是2 個(gè)常見(jiàn)的變異。EULGEM 等[17]在香蕉和楊樹(shù)中也發(fā)現(xiàn)七肽變異類(lèi)型為WRKYGKK 的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其中的變異類(lèi)型與本研究結(jié)果一致。YU等[18]認(rèn)為高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域可以特異識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的W-BOX 元件從而調(diào)控該基因的活性，進(jìn)一步發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，具有變異的WRKY 結(jié)構(gòu)域的HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)影響其發(fā)揮生物學(xué)功能。保守基序分析表明，絕大多數(shù)HmWRKY 蛋白含有的特征基序構(gòu)成不同，如Ⅰ類(lèi)成員多數(shù)含有2 組Motif 1、Motif 2 和Motif 5，Ⅱa和Ⅱb 亞類(lèi)的特征基序是Motif 19，Ⅱc 亞類(lèi)特征基序?yàn)镸otif 4，Ⅱd和Ⅱe亞類(lèi)的特征基序均為Motif 7，而Ⅲ類(lèi)成員中只存在2 種Motif，保守基序種類(lèi)不同說(shuō)明這些成員在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了不同程度的變異，這可能與基因家族的分類(lèi)及功能調(diào)控有關(guān)。

通過(guò)對(duì)干旱脅迫下HmWRKY基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，41個(gè)HmWRKY基因在葉和根中的表達(dá)量變化均有不同，少數(shù)HmWRKY基因如HmWRKY6、HmWRKY29等在干旱脅迫前后葉和根中的表達(dá)量變化不明顯，而HmWRKY22、HmWRKY36等在處理前后葉和根中的表達(dá)量變化相對(duì)顯著。另外，HmWRKY6在干旱處理前不表達(dá)，處理后開(kāi)始表達(dá)，HmWRKY21和HmWRKY38則相反，說(shuō)明HmWRKY6、HmWRKY21和HmWRKY38可能與大苞萱草的抗旱性相關(guān)。已有研究表明，擬南芥中部分WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可在植物抵御干旱脅迫的過(guò)程中起到重要調(diào)控作用。AtWRKY28和AtWRKY57均能提高植株的耐旱性[19-20]。過(guò)表達(dá)AtWRKY29可使擬南芥植株變小且葉片顏色變深，增強(qiáng)其抗旱能力[21]。AtWRKY33可通過(guò)直接調(diào)控CesA8 參與干旱脅迫[22]。AtWRKY40可以通過(guò)增強(qiáng)植株的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力來(lái)維持細(xì)胞吸水，從而提高植株對(duì)干旱脅迫的抵抗力[23]。過(guò)表達(dá)AtWRKY57的擬南芥耐旱性顯著提高[19]。本研究通過(guò)大苞萱草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果得到13個(gè)差異基因，部分差異基因與上述擬南芥抗旱基因具有較近的親緣關(guān)系，如HmWRKY2、HmWRKY3、HmWRKY4、HmWRKY9、HmWRKY30和HmWRKY34。這 也 間 接 表 明 ,HmWRKY2、HmWRKY3、HmWRKY4、HmWRKY9、HmWRKY30和HmWRKY34可能通過(guò)促進(jìn)或抑制自身的表達(dá)來(lái)參與大苞萱草響應(yīng)干旱脅迫的過(guò)程。大苞萱草受到干旱脅迫的前后，HmWRKY2均存在于葉和根中，HmWRKY2的表達(dá)量變化均為顯著下降且HmWRKY2與AtWRKY40同 源 性 較 高。因 此，HmWRKY2可能通過(guò)抑制其表達(dá)在大苞萱草抵御干旱脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究基于大苞萱草的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，首次對(duì)大苞萱草WRKY 基因家族進(jìn)行鑒定，初步確定了41個(gè)HmWRKY基因。通過(guò)對(duì)HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征及在不同處理下葉和根中表達(dá)量的綜合分析，揭示了大苞萱草WRKY 基因家族成員可能與大苞萱草抗旱方面相關(guān)，為HmWRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究以及抗性基因篩選提供參考。確定HmWRKY9為候選基因，后續(xù)將開(kāi)展HmWRKY9的功能驗(yàn)證工作，探討其是否與大苞萱草的抗旱性有關(guān)。