雷學俊，張霞，劉芳，趙東，2，喬宗偉，2，羅青春，王曉妹，劉多濤，鄭佳，2

(1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點實驗室，四川宜賓 644000)

濃香型白酒占我國白酒年總產(chǎn)量的70 %以上，因入口甜、落口綿、窖香濃郁、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)、尾凈余長等特點，廣受消費者的喜愛[1-2]。窖泥作為濃香型白酒釀造過程中厭氧微生物的發(fā)酵載體，是賦予濃香型白酒主體香、窖香等復(fù)雜風味的主要來源[3]。在長期不間斷的生產(chǎn)過程中，窖泥微生物菌群也在不斷的發(fā)生演替變化，逐漸形成了以乳桿菌屬(Lactobacillus)、己酸菌屬(Caproiciproducens)、梭菌屬(Clostridium)、互營單胞菌屬(Syntrophomonas)、沉積菌屬(Sedimentibacter)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)等為優(yōu)勢微生物屬[4-5]，宜賓產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢微生物為沉積菌屬(Sedimentbacter)、Sporanaerobacter和Tissierella[6-7]等。不同種類優(yōu)勢微生物各司其職，又相互影響，例如，Lactobacillus相對豐度6.45 %～55.79 %[8-9]，能夠利用葡萄糖產(chǎn)生氫氣、二氧化碳和乙酸等[10]；Caproiciproducens相對豐度隨著窖齡的增加而升高，約為40.40 %[11-12]，能利用葡萄糖、乳糖等產(chǎn)生乙酸、CO2和H2[13]；Sedimentibacter相對豐度為1.14 %[9]，具有降解氨基酸的作用[14]；Clostridium與Caproiciproducens在厭氧及有關(guān)酶的作用下，代謝產(chǎn)生己酸和氫氣[4]，與產(chǎn)甲烷菌之間通過種間氫轉(zhuǎn)移過程，消耗氫氣，促進己酸的合成[15]。

近年來，運用高通量測序技術(shù)和統(tǒng)計學方法等研究窖泥微生物群落與理化指標之間的關(guān)系越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，窖泥微生物生長的最適溫度為32～35 ℃，溫度過低會抑制窖泥微生物生長[16]。乙酸、銨態(tài)氮和pH 值等與老窖泥的菌群呈正相關(guān)，乳酸、乙醇和丙酸含量與新窖泥的菌群呈正相關(guān)[17]。成熟期窖泥中的乳酸與Caproiciproducens和Clostridium微生物呈負相關(guān)[18]。此外，30 年窖齡的窖泥中的有機酸與Caproiciproducens、Caloramatoraceae呈正相關(guān)[19]。目前的研究熱點在于尋找窖齡、窖泥微生物和窖泥理化特性與風味物質(zhì)相關(guān)的信息，因此，探索不同環(huán)境因素脅迫條件下窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)的定向馴化（特別是優(yōu)勢微生物菌群）是十分有意義的。

本研究應(yīng)用高通量測序系統(tǒng)研究了環(huán)境因素（溫度為物理因素，乙醇、乳酸、乙酸為化學因素）脅迫下窖泥微生物菌群的演化，通過定量的環(huán)境因素水平下揭示窖泥優(yōu)勢微生物群落的變化情況，以期為闡明窖泥微生物的功能和影響因素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及材料：窖泥樣品由五糧液股份有限公司提供，窖齡約20年，窖泥均采集下層窖泥，編號分別為A和B。

試劑及耗材：乳酸，美國Sigma 公司；乙醇，成都市科隆化學品有限公司；乙酸，成都市科隆化學品有限公司，以上試劑均為分析純。土壤樣品提取試劑盒（MP Biomedicals FastDNA），美國MP Biomedicals 生物醫(yī)學公司；五糧粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻[20]進行制備。

儀器設(shè)備：高速冷凍離心機（5810R），德國Eppendorf 公司；NanoDrop one 超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；生化培養(yǎng)箱（BPC-250F），上海一恒科學儀器有限公司；蒸汽滅菌鍋（HVE-50），上海一恒科學儀器有限公司；高通量測序儀（Next-Seq 500），美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥微生物洗脫液的制備

按窖泥∶無菌水=1∶10比例進行渦旋混勻5 min，800 r/min 低速分離，收集上清液；10000 r/min 高速收集，去掉上清液，再按窖泥∶無菌水=1∶10 比例加入無菌水，重復(fù)以上步驟5～6次，盡量洗脫窖泥溶解于水中的風味物質(zhì)，得到窖泥微生物洗脫液。

1.2.2 發(fā)酵實驗方案

1.2.2.1 物理因素脅迫窖泥微生物發(fā)酵

溫度：窖泥洗脫液按培養(yǎng)基的10 %接種至100 mL 已滅菌的五糧粉液態(tài)培養(yǎng)基中，分別放置28 ℃、34 ℃、40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。

1.2.2.2 化學因素脅迫窖泥微生物發(fā)酵

乙醇：窖泥洗脫液按培養(yǎng)基的10 %接種至100 mL 已滅菌的五糧粉液態(tài)培養(yǎng)基中，再添加1%、2%、4%乙醇，混合均勻，放置34 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。

有機酸：窖泥洗脫液按培養(yǎng)基的10 %比例接種至100 mL 已滅菌的五糧粉液態(tài)培養(yǎng)基中，分別添加0.1%、0.2%、0.4%乳酸和乙酸，混合均勻，放置34 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。

1.2.3 基因組DNA提取及PCR擴增

采用MP Biomedicals FastDNA 試劑盒提取窖泥發(fā)酵液中微生物基因組總DNA，用NanoDrop one 超微量分光光度計檢測DNA 濃度和純度。以DNA 為模板，引物為Hyb515F(5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTG -CCAGCMGCCGCGGTAA-3') 和 Hyb806R (5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAG -ACAGGGACTACHVGGGTTCTAAT-3-) 對細菌16S rDNA 基因V4 區(qū)域擴增[7]。PCR 擴增具體反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，53 ℃退火25 s，72 ℃延伸45 s，共25 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.4 高通量測序及序列分析

高通量測序及序列分析步驟具體參照文獻[7]進行。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

對測序原始數(shù)據(jù)參照文獻[7]進行處理；采用Origin 2021繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因素脅迫下窖泥發(fā)酵液pH值變化

如圖1 所示，物理因素脅迫發(fā)酵后，pH 值由5.2～5.5 降低至3.0 左右；經(jīng)化學因素脅迫發(fā)酵后，pH 值由3.0～4.2 降低至3.0 左右，均呈現(xiàn)減少的現(xiàn)象，說明經(jīng)環(huán)境因素脅迫，窖泥微生物能進行正常生長且一定程度上代謝產(chǎn)酸。

圖1 發(fā)酵前后pH值變化情況

2.2 物理因素脅迫下窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 目水平下群落結(jié)構(gòu)變化

基于OTU 注釋，每個發(fā)酵樣品中厚壁菌門(Fimicutes)相對含量占96%以上，與四川某知名濃香型酒廠窖泥中厚壁菌門為絕對優(yōu)勢菌群具有一致性[21]。門水平下差異性不顯著，故選擇在目水平進行比較。在目水平下共檢出8 個目，占每個樣品總含量的95%以上，如圖2所示。

目水平下，兩個窖泥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成大體一致（圖2）。經(jīng)物理因素脅迫發(fā)酵后，主要由4 個目主導(dǎo)，包括梭菌目(Clostridiales)＞Thermoanaerobacterales＞乳桿菌目(Lactobacillales)≥芽孢桿菌目(Bacillales)，擬桿菌目(Bacteroidales)、Coriobacteriales、互養(yǎng)菌目(Synergistales)和Acholeplasmatales未檢出。

圖2 目水平下窖泥中原核微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

與培養(yǎng)前相比，梭菌目的相對豐度為68 %～79%，差異性不顯著，除在28 ℃脅迫發(fā)酵后；Thermoanaerobacterales 相對豐度從4 %增加到14 %～16%，差異性顯著。經(jīng)28 ℃脅迫發(fā)酵后，窖泥A 和B 中乳桿菌目相對豐度分別為23.7 %和9.3 %，相比其他水平脅迫（相對豐度為0.1%～8%），達到了最高相對豐度。

2.2.2 屬水平下群落結(jié)構(gòu)變化

將平均相對豐度超過1 %的微生物定義為優(yōu)勢屬[22]。本研究基于OTU注釋，兩個窖泥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成大體一致，共得到113 個屬，其中相對豐度＞1%的優(yōu)勢菌屬共17個，各優(yōu)勢菌屬的相對豐度如圖3 所示。經(jīng)物理因素脅迫發(fā)酵后，主要由6 個屬主導(dǎo)，包括Sedimentibacter(占20 %～35 %)＞Caloribacterium(占10 %～17 %)＞Tepidimicrobium(占6 %～12 %)＞Lactobacillus(占1 %～23 %)≥Sporanaerobacter(占2 %～4 %)≥Tissierella(占2 %～3 %)，占每個樣品總含量的60 %以上。Aminobacterium、Proteiniphilum、Acholeplasma和Atopobium均未檢出。

圖3 屬水平下窖泥中原核微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

與培養(yǎng)前相比，Sedimentibacter、Tissierella和Sporanaerobacter的相對豐度差異不顯著；Calorib-acterium和Tepidimicrobium相對豐度均增加了2 倍以上，但在不同溫度脅迫下差異不顯著；在28 ℃發(fā)酵下，Lactobacillus相對豐度最高，增加了3倍以上。有關(guān)研究表明，Sedimentibacter和Tepidimicrobium能夠為己酸合成提供前體物質(zhì)乙酸和丁酸[13，23]，Caloribacterium和Sporanaerobacter能夠利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙酸、氫氣和二氧化碳[24-25]。

相比對照組（34 ℃培養(yǎng)下），低溫28 ℃能促進Lactobacillus的生長。作為固態(tài)法白酒生產(chǎn)的重要微生物Lactobacillus，代謝產(chǎn)有機酸能促進釀酒酶系的糖化和發(fā)酵[26]，代謝積累的乳酸可作為梭菌屬合成丁酸和己酸的底物，還具有維護與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[27-28]。

2.3 化學因素脅迫下窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 目水平下群落結(jié)構(gòu)變化

基于OTU 注釋，每個發(fā)酵樣品中厚壁菌門(Fimicutes)相對含量占99%以上，無法進行樣品之間的差異性比較，故選擇在目水平進行比較。在目水平下共檢出8 個目，占每個樣品總含量的97 %以上，兩個窖泥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成大體一致，如圖4所示。

圖4 目水平下窖泥中原核微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

目水平下，經(jīng)化學因素脅迫發(fā)酵后，主要由4個目主導(dǎo)，包括梭菌目(Clostridiales)＞Thermoanaerobacterales＞乳桿菌目(Lactobacillales)≥芽孢桿菌目(Bacillales)，擬桿菌目(Bacteroidales)、Coriobacteriales、互養(yǎng)菌目(Synergistales)和Acholeplasmatales 未檢出。添加乳酸脅迫發(fā)酵，能抑制梭菌目微生物生長，添加乙酸脅迫，則無顯著性作用，這與吳浪濤等[18]表明的乳酸與大部分梭菌綱微生物都呈負相關(guān)相一致。

與培養(yǎng)前相比，Thermoanaerobacterales 相對豐度從4 %增加到14 %～16 %，差異性顯著；芽孢桿菌目和乳桿菌目相對豐度均呈現(xiàn)增加的趨勢，芽孢桿菌目在添加0.2 %乙酸（在窖泥A 中相對豐度為12.1%）和0.4 %乳酸（在窖泥B 中相對豐度為13.8 %）脅迫發(fā)酵下達到最高，乳桿菌目在添加0.2 %乳酸脅迫發(fā)酵下達到最高（A-30.4 %，B-25.5%）。

2.3.2 屬水平下群落結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)化學因素脅迫發(fā)酵后，兩個窖泥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成大體一致，各優(yōu)勢菌屬的相對豐度如圖5 所示。主要由6 個屬主導(dǎo)，包括Sedimentibacter(占19 %～30 %)＞Caloribacterium(占10 %～16 %)＞Tepidimicrobium(占4 %～12 %)＞Lactobacillus(占3 %～30 %)≥Sporanaerobacter(占2～4%)≥Tissierella(占1%～3%)，占每個樣品總含量的60 %以上。Aminobacterium、Proteiniphilum、Acholeplasma和Atopobium均未檢出。

圖5 屬水平下窖泥中原核微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

與培養(yǎng)前相比，Lactobacillus相對豐度差異極顯著，在添加0.2%乳酸脅迫下的相對豐度最高，占25%～30%；Sedimentibacter和Sporanaerobacter相對豐度差異不顯著；Caloribacterium和Tepidimicrobium相對豐度均增加了2 倍以上，但在不同乙醇濃度脅迫下差異不顯著；Caloribacterium相對豐度增加了2 倍以上，但在不同乳酸、乙酸濃度下相對豐度差異不顯著；在窖泥樣品B組中，Tepidimicrobium相對豐度增加幅度具有顯著性。

相比對照組（34 ℃培養(yǎng)下），添加乳酸和乙酸脅迫發(fā)酵能促進Lactobacillus的生長，抑制Tissierella和Clostridium的生長。推測原因如圖1 所示，添加乳酸和乙酸脅迫發(fā)酵后，環(huán)境pH 維持在3.0 左右，適宜乳酸桿菌屬生長（Lactobacillus可以在pH值低至2.4 的條件下存活[29]），不適宜Tissierella和Clostridium生長（Tissierella生長的最適pH值為6.0～7.0[30]，Clostridium生長的最適pH 值為5.0～7.0[31]）。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測序儀對環(huán)境因素（溫度物理因素，乙醇、乳酸、乙酸化學因素）脅迫下窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析和比較。結(jié)果表明，選取2個窖泥樣品進行環(huán)境因素脅迫發(fā)酵后，在目水平和屬水平下，窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)組成大體一致，具有一定程度的可重復(fù)性。

目水平下，經(jīng)環(huán)境因素脅迫發(fā)酵后，28 ℃和0.2 %乳酸脅迫下，對乳桿菌目菌群微生物的生長具有促進作用。主要由4 個目主導(dǎo)，包括梭菌目(Clostridiales)＞hermoanaerobacterales＞乳桿菌目(Lactobacillales)≥芽孢桿菌目(Bacillales)，擬桿菌目(Bacteroidales)、Coriobacteriales、互養(yǎng)菌目(Synergistales)和Acholeplasmatales 未檢出。與培養(yǎng)前相比，Thermoanaerobacterales 相對豐度由4 %增加到14%～16%，具有顯著差異性；在化學因素脅迫發(fā)酵下，芽孢桿菌目和乳桿菌目相對豐度均呈現(xiàn)增加的趨勢。

屬水平下，經(jīng)環(huán)境因素脅迫發(fā)酵后，得出低溫、乳酸和乙酸對Lactobacillus的生長具有促進作用；乳酸和乙酸對Tissierella和Clostridium具有抑制作用。主要由6 個屬主導(dǎo)，包括Sedimentibacter＞Caloribacterium＞Tepidimicrobium＞Lactobacillus≥Sporanaerobacter≥Tissierella，Aminobacterium、Proteiniphilum、Acholeplasma和Atopobium均未檢出。與培養(yǎng)前相比，Sedimentibacter、Tissierella和Sporanaerobacter的相對豐度差異不顯著；Lactobacillus在低溫28 ℃和0.2 %乳酸脅迫發(fā)酵下相對豐度最高，分別為16.2%和27.65%。