陳 瑞 楊德強 趙長林

（1. 西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650233；2. 云南國誠農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，云南 昭通 657000）

天麻（Gastrodia elata）又名赤箭、離母、獨搖草，為蘭科天麻屬多年生共生草本植物，主產(chǎn)于中國云南、貴州、湖南、湖北、陜西、四川等省，其中云南省昭通市彝良縣、永善縣、綏陽縣等地區(qū)所產(chǎn)天麻為特色道地藥材。天麻性平，味甘，歸肝經(jīng)，“此草獨莖而葉攢其端，無風自動，故曰鬼獨搖草，天麻可用于頭痛眩暈、肢體麻木、癲癇抽搐等癥的治療”[1]。此外，天麻廣泛應用于食品領域，其塊莖中主要化學成分有天麻素、香莢蘭醇、酚性化合物[2]，能增強細胞免疫和機體非特異性免疫[3-5]。然而，天麻栽培存在連作障礙，目前研究表明藥用植物連作產(chǎn)生的化感自毒物質引起的土壤微生態(tài)變化是其發(fā)生連作障礙的重要原因[6]。連作障礙是指在同一塊土地上連續(xù)栽培同種作物時，盡管在正常的栽培管理條件下，也出現(xiàn)長勢變?nèi)?、產(chǎn)量減少、品質降低、病蟲害加重的現(xiàn)象，其主要原因包括：土傳病害的影響、土壤微生物的影響、植物化感自毒作用、土壤酶活性變化、理化性質的改變。隨著天麻栽培面積的不斷擴大及中藥材規(guī)范化種植的推行，藥用植物栽培中主要是土壤環(huán)境惡化導致連作障礙進而嚴重影響中藥材規(guī)范化種植及種植基地建設，連作障礙已成為限制天麻生產(chǎn)發(fā)展和體系構建的重要因素[7-12]。

引起藥用植物連作障礙的原因主要有三方面，一是土壤微生物引起的病害，二是根際化感作用，三是土壤養(yǎng)分不足或營養(yǎng)元素缺失[13]。前人研究證實，作物根系分泌物、植株殘茬腐解物為病原菌營造了良好的繁殖條件，豐富的營養(yǎng)和寄主使病原菌快速增殖，導致土壤病原菌的不斷積累造成重茬問題，由于植物殘渣分解物和植物根系分泌物改變了根際微生物群落組成致使土壤微生物的比例失調(diào)引起連作障礙[14-15]；導致連作障礙發(fā)生的原因并非單一因素，不同作物連作產(chǎn)生的主導因素也有所不同，因此如何解決作物連作障礙一直是農(nóng)林領域世界性的難題[16]。

近年來，我國藥用植物與作物連作障礙研究逐漸受到重視，該領域快速發(fā)展，科研水平不斷提升[10]。但我國天麻連作障礙研究較少，仍有許多卡脖子問題困惑麻農(nóng)，本研究基于在云南省昭通市彝良縣蕎山鎮(zhèn)開展天麻種植前后及方竹修復后土樣的采樣，用宏基因組測序方法揭示天麻種植土壤細菌群落結構變化，進而為后期搞清天麻連作障礙成因及破障菌劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土樣采集于云南省昭通市彝良縣蕎山鎮(zhèn)，該鎮(zhèn)屬于昭通地區(qū)天麻主產(chǎn)地，位于104°16′14″ E，27°39′33″ N，平均海拔1 650 m，年均氣溫11 ℃，年均降水量860 mm。山高坡陡，常年多霧，土壤為酸性或微酸性土，含有豐富的腐殖質，適宜于天麻的生長。本研究分批次采樣，采樣過程中土樣設置3 個重復，使用50 mL康寧離心管進行分裝，確保土樣完整無污染。取樣完成后低溫保藏，每個樣本置于-80 ℃冰箱中保存。本次采樣區(qū)域為麻農(nóng)開展林下種植天麻片區(qū)的天麻原始土、天麻1 年土和方竹輪作土。采集土壤樣品名稱編號分組見表1。

表1 土壤樣品編號及分組Table 1 Soil sample number and assigned group

1.2 試驗方法步驟

1.2.1 基因組DNA 提取

使用特定的DNA 提取試劑盒，提取樣本的總基因組，DNA 提取后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.2 PCR 擴增

引物：16S 引物V3 + V4 區(qū)域；

341F: CCTACGGGNGGCWGCAG；

806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物檢測、純化和定量

電泳檢測，使用Thermo Scientific 公司Gene-JET 試劑盒純化并回收產(chǎn)物。

1.2.4 建庫測序

用illumina 測序平臺進行測序，主要有如下3 個步驟：1）PE reads 拼接：使用FLASH v1.2.7軟件；2）Tags 過濾：使用Trimmomatic v0.33 軟件；3）去除嵌合體：使用UCHIME v4.2 軟件。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

劃分OTU（Operational taxonomic units）、多樣性及差異性分析，利用Qiime2[17]進行數(shù)據(jù)處理：拼接（vsearch）[18]，去除引物（cutadapt）[19]，過濾低質量數(shù)據(jù)[20]，基于有效數(shù)據(jù)進行去噪和物種分類分析，形成擴增子序列變屏（Amplicon Sequence Variants，ASV）和物種分類等級的物種特征表（Feature table）。

1.2.6 聚類分析

使用QIIME（Version 1.8.0）軟件[17]中的UCLUST[21]對Tags 在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，基于Siva （細菌）分類學數(shù)據(jù)庫，用柱形圖顯示各樣品的分類學注釋和OTU個數(shù)。

1.2.7 物種組成分析

利用相關軟件繪制樣本各分類學水平下的群落結構圖，用特定的物種分類樹進行研究，利用Venn[22]圖展示樣本之間共有、特有ASV 數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣本間ASV 的重合情況，結合 ASV所代表的物種，找出不同環(huán)境中的核心微生物。

1.2.8 物種差異分析

通過統(tǒng)計分析，找出分組間豐度變化差異顯著的物種，比較組內(nèi)差異和組間差異的大小，判斷不同分組間的群落結構差異是否具有顯著意義。在門、綱、目、科、屬、種水平下進行組間物種差異顯著性分析和物種Metastat 差異分析；用軟件STAMP[23]做組間的Welch's t-test 檢驗，找出差異顯著的物種。

1.2.9 物種多樣性分析

進行Alpha、Beta 多樣性分析，并對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。通過UniFrac 分析[24]利用系統(tǒng)進化的信息來比較樣本間的物種群落差異，主要有：

1）主成分分析：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）將多組數(shù)據(jù)的差異反映在坐標圖上，通過分析不同樣品OTU（97%相似性）組成反映樣品的差異和距離。

2）主坐標分析：主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）與PCA 類似，基于binary jaccard, bray curtis, unweighted unifrac 和weighted unifrac 距離進行分析，選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖展示。

3）主加權組平均分析：通過非加權組平均法（ Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA），所產(chǎn)生的聚類樹聚類分析，樹枝的距離和聚類的遠近可以觀察樣本間相似性。

4）基于OTU-Table 和上述4 種距離矩陣繪制樣本聚類熱圖，從聚類中了解樣本之間的相似性，進行多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土樣細菌OTU 組成與分析

基于有效OTU 數(shù)據(jù)進行去噪和物種分類得到各個樣本細菌ASV（圖1），由圖1 可知Zhaochang l 021 細菌ASV 最大，為2 034；Zhaochangl 019 細菌ASV 最小，為1 038，樣本的細菌總ASV 為3 004。

圖1 各樣本ASVFig. 1 ASV number per sample

將豐度小于0.001 的ASV 過濾掉，比較3 組樣本細菌ASV（圖2），由圖2 可知3 組樣本共有細菌ASV 為95，從charlle001、charlle002 和charlle006 特有細菌ASV 可知，原壤charlle001 特有細菌數(shù)量最多，其次為方竹壤charlle006，二者均高于一麻壤charlle002 所含有的特有細菌數(shù)量。結果表明：天麻原壤具有最多的特有細菌，但種植1 年天麻后土壤種特有細菌減少，隨后將地方經(jīng)濟作物方竹種植于一麻壤后，土壤中特有細菌數(shù)量呈現(xiàn)回升趨勢。

圖2 3 組樣本ASV 花瓣圖Fig. 2 ASV petal maps of 3 groups of samples

3 組樣本細菌系統(tǒng)發(fā)育樹結果見圖3，不同顏色的扇形表示3 個不同的樣品，扇形的大小表示該樣品在該分類上相對豐度的比例大小。餅圖下方的拉丁名代表相應的分類階元，從系統(tǒng)發(fā)育分類樹上可明確3 組樣本細菌按門主要可分為Acidobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、Proteobacteria、Planctomycetes 和Verrucomicrobia；按綱主要可分為Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Anaerolineae、Chloroflexi、Gammaproteobacteria、Holophagae、 Ktedonobacteria、 Pedosphaerae、 Phycisphaerae、 Planctomycetia 和Verrucomicrobiae； 按目主要可分為Bryobacterales、Burkholderiales、Chthoniobacterales、Ktedonobacterales、Pedosphaerales、Lachnospirales、Rhizobiales、Solibacterales 和Tepidisphaerales；按科主要可分為Bacteoidales、Bryobacteraceae、Chthoniobacteraceae、Koribacteraceae、Ktedonobacteraceae、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Nitrosomonadaceae、Pedosphaeraceae 和Solibacteraceae；按屬主要可分為Acidibacter、Acidothermus、Bryobacter、Clostridia、Koribacter、Solibacter和Udaeobacter。

圖3 樣本細菌分類學系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The taxonomic phylogenetic tree of the sample bacteria

2.2 土樣細菌群落結構及相對豐度

本研究將豐度低的部分物種合并為Others 在圖4 中顯示，圖5 中Unknown 代表未得到分類學注釋的ASV，一種顏色代表一個物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例。單個樣本在門水平分析的樣本豐度（圖4）和種水平分析的樣本豐度（圖5）分析結果表明：樣本豐度按門等級主要可分為Acidobacteria、Actinobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadota、Latescibacterota、Myxococcota、Nitrospirota、Patescibacteria、Planctomycetota、 Proteobacteria、 SAR324、 Verrucomicrobiota 和WPS-2，其中Acidobacteria 豐度占比最大；按種等級主要可分為Bellilinea 和Holophaga；其中未得到分類學注釋的細菌物種Unknown 豐度所占比例較大。

圖4 單個樣本在門水平上的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of a single sample

圖5 單個樣本在種水平上的相對豐度Fig. 5 Relative abundance of a single sample

組間樣本豐度門水平分析（圖6）表明：3 個組中Acidobacteria 細菌豐度最大，charllle006 ＞charllle002 ＞ charllle001；Proteobacteria 細 菌 豐 度charllle006 ＞ charllle002 ＞ charllle001；Gemmatimonadota 細 菌 豐 度 charllle001 ＞ charllle002 ＞charllle006；Verrucomicrobiota 細菌豐度charllle006 ＞charllle002 ＞ charllle001。

通過circos[25]繪制物種豐度與樣本相互關系（圖7），揭示各分組樣本中不同物種所占的比例以及物種在不同分組中的比例關系。篩選相對豐度大于0.01 的物種以目水平繪圖，第1 圈左半邊為物種，右邊為樣本分組，第2 圈左邊一半為物種中各樣本的比例，右邊一半為樣本中各物種的比例，內(nèi)2 圈與外2 圈標注相同，最里面連線為物種豐度與樣本分組之間的連線。在系統(tǒng)分類的細菌目中，3 組優(yōu)勢菌組成較為相似，均以Acidobacterales、 AD3、 Bacteroidales、 Burkholderiales、 Bryobacterales、 Ktedonobacterales、 Pedosphaerales、 Rhizobiales、 Subgroup-2、 和WPS-2 細菌為優(yōu)勢菌，但各優(yōu)勢菌相對豐度有一定差異。其中，charlle001 目水平相對豐度較大的主要優(yōu)勢菌依次為：Bacteroidales ＞ Subgroup-2 ＞Ktedonobacterales ＞ AD3 ＞ Acidobacterales ＞ WPS-2 ＞Bryobacterales ＞ Burkholderiales ＞ Rhizobiales ＞ Pedosphaerales；charlle002 目水平相對豐度較大的主要優(yōu)勢菌依次為：Subgroup-2 ＞ Acidobacterales ＞AD3 ＞ Ktedonobacterales ＞ Rhizobiales ＞ WPS-2 ＞Burkholderiales ＞ Pedosphaerales ＞ Bryobacterales ＞Bacteroidales；charlle006 目水平相對豐度較大的主要優(yōu)勢菌依次為：Subgroup-2 ＞ Acidobacterales ＞Ktedonobacterales ＞ Pedosphaerales ＞ WPS-2 ＞Rhizobiales ＞ Burkholderiales ＞ Bryobacterales ＞Bacteroidales ＞ AD3。Bacteroidales 細 菌 豐 度 在charlle001 中 最 大（ 20%）， 在 charlle002 和charlle006 中幾乎沒有；Subgroup-2 細菌豐度在charlle006 中最大（20%），在charlle001 中最?。?0%）；Acidobacterales 細菌豐度在charlle006中最大（18%），在charlle001 中最?。?%）；Ktedonobacterales 細菌豐度在charlle006 中最大（14%），在charlle001 和charlle002 中較小。上述結果表明，3 組土樣主要優(yōu)勢菌屬大致相同，但各組優(yōu)勢菌相對豐度存在較大差異；原壤charlle001 中Bacteroidales 細菌較多，但通過種植1 年天麻后，一麻壤charlle002 中Bacteroidales 細菌急劇減少，且細菌物種數(shù)量也呈減少趨勢；方竹壤中Subgroup-2、Ktedonobacterales 細菌豐度呈現(xiàn)回升態(tài)勢，均在10%以上。進而可以得出結論：該地區(qū)原壤通過種植天麻導致土壤中細菌物種總數(shù)和總豐度呈降低趨勢，通過種植方竹，一麻壤得到修復，物種總數(shù)和總豐度再次回升，進而推測天麻連作障礙與土壤中細菌物種總數(shù)和豐度密切相關。

通過門水平Heatmap 熱圖聚類分析 (圖8)顯示物種豐度與不同物種的相似情況，圖8 中包含物種信息及樣本信息。2 個物種豐度越相似，距離越近，枝長越短；橫向聚類表示不同樣本的各物種豐度的相似情況，默認最多展示豐度最高的前35 個物種。研究結果顯示：1）Zhaochangl 019、Zhaochangl 020、Zhaochangl 021 聚至charlle 001； Zhaochangl 015、 Zhaochangl 016、Zhaochangl 017 聚至charlle 002；Zhaochangl 032、Zhaochangl 033 聚至charlle 006；2）全部樣本聚為兩個大類：charlle001 與charlle 006（group I）、charlle002（group II），結果揭示兩類細菌物種總豐度存在差異；3）原壤中Zhaochangl 020 和Zhaochangl 021 樣 品 內(nèi)4 門Bacteroidales、Campilobacterota、Cyanobacteria 和Firmicutes 細菌豐度極高，而一麻壤和方竹壤樣品內(nèi)該4 門細菌豐度極低；原壤中Zhaochangl 019, Zhaochangl 020 和Zhaochangl 021 樣品內(nèi)3 門Actinobacteriota,Myxococcota, Proteobacteria 細菌豐度較低，而一麻壤和方竹壤樣品內(nèi)該3 門細菌豐度較高。該結果揭示天麻原壤經(jīng)過種植1 年天麻，細菌群落發(fā)生變化，有益細菌減少，再次種植天麻將導致連作障礙，如一麻壤種植方竹后，其方竹壤內(nèi)有益細菌再次增加，待方竹豐收后，該樣地還可繼續(xù)種植天麻，進而提升土地利用效率。樣品Zhaochangl 019 內(nèi)4 門Bacteroidales、Campilobacterota、Cyanobacteria、Firmicutes 細 菌 豐 度 較 低，推測主要原因為該采樣點附近有可能種植過天麻。

圖6 組間樣本在門水平的相對豐度Fig. 6 Relative abundance of samples among groups

圖7 樣本與物種豐度circos 圖Fig. 7 Circos plots of samples and species abundance

圖8 物種相對豐度聚類熱圖Fig. 8 Clustering heatmap of relative species abundance

2.3 土樣細菌多樣性分析

使用Qiime2 軟件，對樣本Alpha 多樣性指數(shù)進行評估。為比較樣本間的多樣性指數(shù)，分析時將Feature table 先均一化之后再計算多樣性指數(shù)。Alpha 多樣性是反映豐富度和均勻度的綜合指標，豐富度表示物種的有無和群落中物種分配上的均勻性，即物種豐度大小是否均勻，群落豐富度的指數(shù)主要包括Richness、Chao1 和Ace 等指數(shù)。既考慮豐富度又考慮均勻性的指數(shù)包括Shannon 和Simpson 等指數(shù)，各樣本Alpha 多樣性指數(shù)值統(tǒng)計如表2 所示。

表2 樣本細菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 2 Statistical analysis of bacterial Alpha diversity index of the samples

表2 中各樣本細菌物種數(shù)及Alpha 多樣性指數(shù)揭示樣本Zhaochangl 015、 Zhaochangl 016、Zhaochangl 017 物種數(shù)較均衡， 原壤樣本Zhaochangl 021 物種數(shù)最大，Zhaochangl 019 物種數(shù)最小。辛普森指數(shù)越大，對應樣本中細菌群落多樣性越小，Zhaochangl 015 的辛普森指數(shù)最大，其次是Zhaochangl 017，表明這兩種樣本中細菌群落多樣性較小。

使用R 語言ggplot2 包繪制 PCA 散點圖（圖9），組間PCA 分析結果表明：縱坐標水平顯示方竹壤charlle006 介于原壤charlle001 和一麻壤charlle002 之間，3 組樣本中各樣本離散程度不同，其原因可能與采樣點距離不同有關。PCoA 分析（圖10）結果表明：charlle002 和charlle006 樣本聚類較近，charlle001 樣本較分散，該結果與細菌群落聚類分析結果一致。

圖9 樣本PCA 散點圖Fig. 9 Sample PCA scatter plot

圖10 樣本PCoA 分析圖Fig. 10 Sample PCoA analysis graphics

通過R 語言ggplot2 采用非加權配對平均法對樣本進行層次聚類，以判斷各樣本間物種組成的相似性。樣本層次聚類樹和相對豐度（圖11）分析表明： Acidobacteriota、Chloroflexi 和Proteobacteriota 細菌為樣本主要優(yōu)勢菌，樣本Zhaochangl 020 和Zhaochangl 021 中Acidobacteriota 細菌豐度明顯較低，原壤Zhaochangl 020、Zhaochangl 021中Bacteroidota 和Firmicutes 細菌豐度較高，而一麻壤和方竹壤中幾乎沒有，推測Bacteroidota 和Firmicutes 細菌可能是天麻種植土壤中的有益菌。一麻壤的3 樣本聚類為一支，表明樣本細菌組成與豐度較相似。方竹壤兩樣本Zhaochangl 032 和Zhaochangl 033 聚為一類，樣本中Acidobacteriota 豐度最大，同時Verrucomicrobiota 豐度也較大。

圖11 UPGMA 樣本聚類樹分析Fig. 11 UPGMA sample cluster tree analysis

2.4 樣本細菌差異分析

通過R 語言pheatmap 繪制樣本聚類熱圖（圖12），根據(jù)顏色梯度的變化可直觀地看出樣本間的差異性。圖12 中左側和上方展示了樣本的聚類關系，中間顏色梯度變化代表各樣本表達量，紅色越深表示樣本表達量越高。圖12 中顏色梯度變化明顯，同組樣本聚類在一起表明樣本間具相似性；charlle006 兩個樣本與charlle002 的3 個樣本距離較遠，揭示兩組間細菌群落組成差異較大。

LDA Effect Size[26]分析能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計學差異的Biomarker，即組間差異顯著的物種。不同組中豐度差異顯著物種包括細菌的門、綱、目，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。圖13 表明：charlle001 中顯著差異細菌為p-Bacteroidota、 c-Bacteroidia 和 o-Anaerolineales；charlle002 中顯著差異細菌為o-Tepidisphaerales、c-Holophagae、o-Nitrospirales、p-Nitrospirota 和c-Nitrospiria；charlle006 中 顯 著 差 異細 菌 為 c-Acidobacteria、 p-Acidobacteriota、o-Acidobacteriales、 c-Ktedonbacteria、 o-Ktedonbacterales、o-Elsterales和o-Solibacterales。

在目水平做組間Welch's 檢驗，3 組樣本charlle001、charlle002 和charlle006 兩兩比較做組間物種差異分析（圖14），圖14 左邊為組間差異物種豐度展示，右邊為組間差異置信度展示。圖14a 表明：原壤charlle001 和方竹壤charlle006組間細菌Pedosphaerales 和Acidobacteriales 相對豐度差異顯著，且兩目細菌在charlle006 中豐度更高，其余各目細菌差異不明顯。

原壤charlle001 和一麻壤charlle002 組間圖14b 表明：Rhizobiales、Chthoniobacterales、Pirellulales、 Holophagales、 Xanthomonadales、 Gaiellales、Fankiales 和Solirubrobacterales 細菌相對豐度差異顯著，其中Rhizobiales 最為突出，該目細菌在charlle002 中豐度極高。

圖14c 表明：一麻壤charlle002 和方竹壤charlle006 組 Tepidisphaerales、 Gemmatales、 Pedosphaerales 和Chthoniobacterales 細菌相對豐度差異顯著，Pedosphaerales 在charlle006中豐度更高，而 Tepidisphaerales、 Gemmatales 和 Chthoniobacterales 在charlle002 中豐度更高，其余細菌無顯著差異。

圖12 樣本聚類熱圖Fig. 12 Sample clustering heatmap

圖13 差異物種LDA 柱狀圖Fig. 13 LDA histogram of different species

圖14 樣本微生物群落差異比較Fig. 14 Comparison of microbial community differences in samples

3 結論與討論

本研究共分析8 個土樣Zhaochangl 015、Zhaochangl 016、Zhaochangl 017、Zhaochangl 019、Zhaochangl 020、 Zhaochangl 021、 Zhaochangl 032，Zhaochangl 033，分為3 組原壤charlle001、一麻壤charlle002、方竹壤charlle006。土壤高通量測序分析結果揭示了各個土樣細菌種類與物種豐度，并通過各樣本細菌組成和群落結構數(shù)據(jù)搞清了彝良縣蕎山鎮(zhèn)天麻種植區(qū)土樣優(yōu)勢細菌為Acidobacteria、Actinobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadota、Latescibacterota、 Myxococcota、 Nitrospirota、 Patescibacteria、Planctomycetota、Proteobacteria 和Verrucomicrobiota。

3 組樣本群落結構比較表明：1）Acidobacteria 為優(yōu)勢細菌，其次是Proteobacteria 和Chloroflexi；2）Firmicutes、Bacteroidota 細 菌 在 原 壤中豐度最高，而在一麻壤和方竹壤中幾乎沒有；3）組內(nèi)各樣本細菌群落組成較相似，但不同樣本中各細菌豐度不同。

各組間細菌數(shù)比較：3 組樣本共有細菌ASV為95 個，基于charlle001、charlle002 和charlle006特有細菌ASV 分析表明：原壤charlle001 特有細菌數(shù)量最多，其次為方竹壤charlle006，二者均高于一麻壤charlle002 特有細菌數(shù)量。原壤與一麻壤優(yōu)勢細菌比較分析顯示：優(yōu)勢細菌Acidobacteria、Planctomycetota 和Proteobacteria 在 原 壤 中豐度明顯低于一麻壤中，且原壤中Bacteroidota、Firmicutes 兩門細菌豐度顯著高于一麻壤；一麻壤與方竹壤優(yōu)勢細菌比較分析顯示：Chloroflexi 和Planctomycetota 在一麻壤中豐度明顯高于方竹壤，但方竹壤優(yōu)勢細菌Acidobacteria 豐度最大且Bacteroidota 細菌豐度高于一麻壤；原壤與方竹壤優(yōu)勢細菌比較分析顯示：方竹壤中Acidobacteria、Proteobacteria 豐度顯著高于原壤。云南省內(nèi)關于森林及農(nóng)田土壤細菌多樣性的測序研究表明，正常土壤中優(yōu)勢細菌門主要為Proteobacteria、 Actinobacteria、 Acidobacteria、 Firmicutes 和Gemmatimonadetes[27-28]，土壤細菌群落的多樣性和豐度越高，越有利于植株生長，土壤微生物的相對豐度發(fā)生改變，其功能也發(fā)生相應變化[29]，基于上述分析推斷Firmicutes、Bacteroidota 細菌是天麻種植土壤中重要有益菌；猜測天麻連作障礙原因與其土壤微生物群落結構和豐度變化有緊密的關聯(lián)，而連作菌塘種植方竹能緩解并一定程度修復天麻連作土壤。

連作障礙是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的問題，連作導致農(nóng)作物減產(chǎn)和病蟲害等問題的發(fā)生，故稱“障礙”，對很多農(nóng)作物[30-36]造成不可估量的經(jīng)濟損失。由于大部分藥用植物特別是栽培根類藥材的連作障礙問題較突出，藥材品質和產(chǎn)量均大幅下降[16,37-47]。天麻是我國特有的名貴中藥材，也是近年發(fā)展迅速的中藥大品種之一，因其對氣候、土壤、真菌等環(huán)境有特殊要求，因此傳統(tǒng)上云南省以昭通市境內(nèi)為主要種植地。近年來，中藥材已規(guī)范化種植，栽培土壤環(huán)境惡化及連作障礙問題備受關注，隨著社會需求量不斷增加，天麻栽培面積擴大，天麻價格不斷上漲，連作障礙己成為限制天麻生產(chǎn)的重要因素。天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展與產(chǎn)品質量提升和連作障礙的矛盾，已成為制約現(xiàn)代云藥產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要屏障。因此，明確天麻土壤微生物群落結構是揭開連作障礙的第一層面紗。

引起藥用植物連作障礙因素較多，其中植物根際土壤以及根際微生物是重要的環(huán)境和生物因子[48-49]。鄧文祥等[50]通過對白及（Bletilla striata）根部內(nèi)生真菌的篩選，揭示土壤理化性質影響白及根部內(nèi)生真菌物種組成。土壤微生物研究對探討植物生長有重大意義，土壤微生物結構的多樣性，加強了土壤自肥作用[51]，但連作常引起植物根際微生物變化，引起土壤病原菌增多肥力下降等問題，使作物產(chǎn)量和品質下降[52]，如隨著靈芝栽培年數(shù)增加，靈芝種植土壤中優(yōu)勢菌多樣性降低，病原菌增多[53]。大部分研究表明細菌與土壤肥力相關，馮金玲等[54]試驗5 種栽培模式說明土壤細菌可作為判斷土壤肥力狀況的生物學指標。研究土壤微生物群落結構均表明：土壤中真菌數(shù)量、真菌與細菌數(shù)量比值越低，土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定程度越高，抑制病害能力越強，在連作障礙土壤微生物研究中常見細菌型土壤轉變?yōu)檎婢屯寥繹55-58]。

作物連作后根際土壤微生態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在有益菌數(shù)目減少、病原菌數(shù)目增多，基于研究連作土壤微生物菌群演替規(guī)律，明確引入特殊土壤功能菌和有益微生物，可抑制病原菌增殖，同時恢復穩(wěn)定的微生物群落并防控連作障礙[58]?；贗llumina Hi Seq 高通量測序技術，探討植物與微生物的互作關系，研究連作土壤中細菌群落或真菌群落多樣性及豐度，提高有益菌群在土壤中的比例，降低有害菌群在土壤中的相對含量，研究結果推動了人類對連作障礙的認知[59]。本研究通過高通量測序技術揭示3 種類型天麻土壤細菌在種群組成、數(shù)量和分布上存在差異性，并明晰了連作前后及修復后細菌物種數(shù)量及組成的變化，與前人對連作白術（Atractylodes macrocephala）根際土壤變化[44]和連作土壤微生物區(qū)系分析、調(diào)控及高通量研究分析結果相似[60]，但大部分細菌的分類僅限于屬的水平，測序分析無法定位到特定細菌物種，且同一屬的不同細菌種在土壤中可能會行使不同的功能，不同屬的細菌也可能在土壤中行使同樣的功能，研究所得到的結果可能會有偏差。

天麻連作障礙一直被視為該領域的卡脖子問題，其連作機制與修復方案未曾問世，只因其基礎研究一直擱淺，因此研究天麻土壤中微生物結構組成及豐度變化，便于接下來對天麻種植土壤更深層次的研究和探索。